专利名称：一种双小分子干扰rna载体的构建方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种双siRNA载体的构建方法，该载体在制备或预防抗病毒药物中的用途。
背景技术：
人类传染性疾病的70％是有病毒引起，病毒感染性强传播广威力大，流行性感冒，非典型肺炎，麻疹，乙型脑炎，乙型肝炎，脊髓灰质炎，狂犬病，爱滋病等病毒性疾病严重威胁着人类的健康，影响世界经济的发展。以乙型肝炎病毒和人免疫缺陷病毒为例乙型肝炎病毒(HBV)感染可以引起急性和慢性肝病变。每年全世界死于由于乙肝病毒感染而导致的肝硬化或肝癌的人数超过1百万人。每年被该病毒感染的人数达5万人。全世界范围内，大约有20亿人被乙肝病毒感染过，有3亿5千万人是乙肝病毒的长期带病者。而中国则有1亿2千万人是病毒的长期携带者(刘崇柏等(1997)中国公共卫生学，13515)。人免疫缺陷病毒(HIV)感染能引起爱滋病。爱滋病被称之为世纪瘟疫。据估计从1981年发现首例爱滋病以来，全球感染的人数达6000万，死于爱滋病的人已达1400万，并且每天以16000的感染人数增加。而且在HIV感染的人群中，存在HBV或HCV等混合感染的现象很普遍。但病毒病的治疗是一世界难题，没有很好的药物或方法。抗病毒药物的治疗已有近30年的历史，由于病毒进入机体后，在宿主细胞内进行复制和繁殖，因此，能抑制病毒繁殖的药物对宿主细胞或机体有不同程度的损害，使得抗病毒药的发展缓慢。到目前为止，尚无令人完全满意的抗病毒药。如抗乙肝药物α干扰素是目前公认的治疗慢性乙型肝炎的首选药物，但其疗效仅可使25％～40％的病例获得有效答；拉米夫定对HBV DNA的抑制作用及治疗HBV感染的短期疗效已得到肯定，但长期应用可诱导HBV产生耐药性。齐多夫定(zidovudine)是第一个用于治疗HIV感染的药物，但抑制病毒复制并不理想，且导致病毒的耐药性快速出现。而近年来发展起来的RNA干扰技术在抑制病毒复制上效率高，特异性强，没有毒副作用。因而RNA干扰在抗病毒治疗上显示了诱人的前景RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。RNAi是一种从低等生物到哺乳动物都有的保守的防御机制。双链RNA在细胞内被Dicer切成约19-22nt的小片断干扰RNA(siRNA)，进而形成siRNA-蛋白复合物(siRNP)，siRNP通过识别、降解具有同源序列的mRNA最终导致特异性的基因表达沉默(gene silencing)[Liu JY，Jia LT，Wang CJ，et al.RNAi-genesilencing mediated by dsRNAs.J.Section Genet Foreign Med Sci，2004；27(1)4-10.]。RNA干扰技术近年来日益受到人们的重视，已被广泛应用到研究基因的功能、细胞信号转导途径分析、冗余基因的确定、药物开发中靶标验证、基因治疗、病毒感染、癌症和显性遗传病等。在抗病毒感染方面已经进行研究的病毒有如脊髓灰质炎病毒、人免疫缺陷病毒、兽棚病毒、劳氏肉瘤病毒、登革病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、SARS冠状病毒等。但这些是用一种siRNA抑制病毒的某一基因而达到抑制一种病毒的复制。而用同一载体表达两种双小分子干扰RNA载体，抑制两种病毒的混合感染的抗病毒治疗，目前未见报道。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种双小分子干扰RNA(siRNA)载体的构建方法，方法简单，操作方便，用这一方法可以构建针对任何两种病毒的双siRNA载体，该siRNA载体沉默病毒基因而达到抑制病毒的复制。
本发明的另一个目的是提供一种双siRNA在制备治疗或抑制乙型肝炎病毒(HBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)混合感染药剂中的应用。用载体表达的方法制备siRNA，方法简单成本低廉。RNA干扰效率高，抑制基因表的效率可达90％以上，只使具有与siRNA同源序列的基因表达沉默而不影响其它基因的功能，所以特异性强，无毒副作用。因此用双siRNA治疗病毒混合感染是一种非常有前途的方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案
1、双siRNA产生载体的构建引物合成设计了一对引物，上游引物5’-GCTGATGACGTCAGTGGAAAGACGCG-3’下游引物5’-TCAGCGAATTCACGCCAAGCTTTTCC-3’。该上游引物含有U6启动子的一段序列并引入AatII的限制性内切酶位点，下游引物是乙型肝炎病毒S基因的小分子干扰RNA表达载体(HBssiRNA)上788～807之间的一段序列，并引入一个EcoRI的限制性内切酶位点。然后送Invitrogen公司合成。
2、小分子干扰RNA产生模板PCR扩增以乙型肝炎病毒S基因的小分子干扰RNA表达载体(HBssiRNA)为模板，用上述步骤1合成的引物进行扩增得到PCR产物。用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，用Qiagen公司的DNA纯化回收试剂盒纯化。
3、克隆和测序将回收的DNA片段用AatII和EcoRI进行双酶切后连接到人免疫缺陷病毒小分子干扰RNA表达载体(HIVsiRNA)上的AatII和EcoRI位点之间，产生一个能同时表达乙型肝炎病毒(HBs)S基因的小分子干扰RNA和人免疫缺陷病毒(HIV)小分子干扰RNA两个小分子干扰RNA(siRNA)的质粒psilencer2.1-U6-HBV-HIVsiRNA(简称HBV-HIVsiRNA)，筛选到的阳性克隆送上海华诺并测序证实。(HBssiRNA和HIVsiRNA的获得见参考文献Kailang Wu，Xue Zhang，Jianlin Zhang，Yongbo Yang，Yong-Xin Mu，Mo Liu，Lu Lu，Yan Li，Ying Zhu，Jianguo Wu.Inhibition of Hepatitis B Virus Gene Expression by Single and Dual SmallInterfering RNA Treatment.Virus Research 2005.Sept，112(1-2)100-107.)。构建过程见图1。
通过以上步骤得到了双siRNA载体，该载体对在制备或抑制HBV混合感染药剂中的应用，同时该载体在制备或抑制HIV混合感染药剂中的应用，该载体对HBV、HIV的复制的抑制应用过程是A、双siRNA产生载体对HBV的复制的抑制试验1)转染质粒溶液的配制将1mg-10mg HBV-HIVsiRNA质粒溶解在1mL灭菌的水。
2)转染取1uL-10uL上述溶液加5uL-10uL 5mg/mL的阳离子脂质体(厦门太阳马生物技术有限公司)转染生长在6孔的组织培养盘上的HepG2.2.15细胞(并用表达无关siRNA的载体作为阴性对照)。
3)HBV复制中间体提取6孔板培养的HepG2.2.15细胞培养48小时后用冷的PBS(pH7.4)洗一次，5)然后加入300uL/孔的细胞裂解液(裂解液的成分是50mM Tris-Cl，pH7.4，1mM EDTA，1％Nonidet P-40)室温(20-25℃)放置15min～30min使其充分裂解；将细胞裂解液转到1.5mL EP管中14000rpm离心1min；取上清加10mMMgCl和100ug/mL DNase I置37℃处理30min，再加EDTA到终浓度为25mM终止反应；加蛋白酶K使其终浓度为0.5ug/mL，37℃保温2hr以消化蛋白；用酚和氯仿混合液(两者体积比为1∶1)抽提一次；用无水乙醇沉淀DNA，干燥后灭菌水溶解。
4)HBV抑制效率测定用荧光定量PCR检测试剂盒(深圳PG生物科技有限公司生产)测定HBV的拷贝数。病毒复制抑制率＝(1-样品孔拷贝数/对照孔拷贝数)×100％，结果见表1。
表1 双siRNA对HBV和HIV的抑制效果
用HBV-HIVsiRNA转染HepG2.2.15细胞然后再用荧光定量PCR测定HBV的复制中间体的拷贝数，计算对HBV的抑制率。用HBV-HIVsiRNA和pNL4-3共转染HEK293T然后用p24蛋白检测试剂盒检测p24蛋白的浓度，计算对HIV的抑制率。
B、双siRNA产生载体对HIV的复制的抑制试验1)转染质粒溶液的配制将1mg-10mg HBV-HIVsiRNA质粒溶解在1mL灭菌的水。pNL4-3(购于NIH)是HIV-1的侵染性质粒在HEK293T细胞中能进行复制并产生有感染性的病毒颗粒。同样用灭菌水配成1mg-10mg/mL的溶液。
2)转染取1uL-5uLHBV-HIVsiRNA质粒溶液和1uL-5uL pNL4-3质粒溶液加5uL-10uL 5mg/mL的阳离子脂质体(厦门太阳马生物技术有限公司)共转染生长在6孔的组织培养盘上的HEK293T细胞(并用表达无关siRNA的载体作为阴性对照)。
3)HIV抑制效率测定转染后细胞再培养72小时后用p24蛋白检测试剂盒(购于Ghent Belgium公司)测定细胞培养上清液中HIV-1 p24蛋白的浓度。抑制率＝(1-样品孔浓度值/对照孔浓度值)×100％。结果见表1。
发明优点和效果本发明提供了一种双siRNA载体，该载体能表达两种siRNA抑制两种病毒的复制。本发明还提供了一种双siRNA载体构建的方法。方法简单，操作方便，成本低廉。RNA干扰效率高，抑制基因表的效率可达90％以上，只使具有与siRNA同源序列的基因表达沉默而不影响其它基因的功能，所以特异性强，无毒副作用。因此用双siRNA治疗病毒混合感染是一种非常有前途的方法。现有的用RNA干扰技术抗病毒还停留在用siRNA抑制一种病毒的某一基因而达到抑制一种病毒的复制。本发明最大的优点是能同时抑制两种病毒的复制，是极有潜在临床应用价值的生物制剂。
图1.双siRNA产生载体的构建示意图用一对引物将一个载体U6启动子和siRNA表达模板扩增出来后再克隆到另一siRNA表达载体上的Aat II和EcoRI位点，构成一个同时表达2个siRNA的载体。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.双siRNA产生载体的构建1)双siRNA产生载体的构建引物合成设计了一对引物，上游引物5’-GCTGATGACGTCAGTGGAAAGACGCG-3’下游引物5’-TCAGCGAATTCACGCCAAGCTTTTCC-3’。该上游引物含有U6启动子的一段序列并引入AatII的限制性内切酶位点，下游引物是HBssiRNA上788～807之间的一段序列，并引入一个EcoRI的限制性内切酶位点。然后送Invitrogen公司合成。
2)siRNA产生模板PCR扩增以HBssiRNA为模板，用上述合成的引物进行扩增得到PCR产物。用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，用Qiagen公司的DNA纯化回收试剂盒纯化。
3)克隆和测序将回收的DNA片段AatII和EcoRI进行双酶切后连接到HIVsiRNA上的AatII和EcoRI位点之间，产生一个能同时表达HBs和HIV-1的siRNA两个siRNA的质粒psilencer2.1-U6-HBV-HIVsiRNA(简称HBV-HIVsiRNA)，筛选到的阳性克隆送上海华诺并测序证实。
实施例2.双siRNA产生载体对HBV的复制的抑制1)转染质粒溶液的配制将1mg-10mg HBV-HIVsiRNA质粒溶解在1mL灭菌的水。
2)转染取1uL-10uL上述溶液加5uL-10uL 5mg/mL的阳离子脂质体(厦门太阳马生物技术有限公司)转染生长在6孔的组织培养盘上的HepG2.2.15细胞(并用表达无关siRNA的载体作为阴性对照)。
3)HBV复制中间体提取6孔板培养的HepG2.2.15细胞培养48小时后用冷的PBS(pH7.4)洗一次，然后加入300uL/孔的细胞裂解液(裂解液的主要成分是50mMT-Cl，pH7.4，1mM EDTA，1％Nonidet P-40)室温(20-25℃)放置15min～30min使其充分裂解；将细胞裂解液转到1.5mLEP管中14,000rpm离心1min；取上清加10mMMgCl和100ug/mL DNase I置37℃处理30min，再加EDTA到终浓度为25mM终止反应；加蛋白酶K使其终浓度为0.5ug/mL，37℃保温2hr以消化蛋白；用酚和氯仿混合液(两者体积比为1∶1)抽提一次；用无水乙醇沉淀DNA，干燥后灭菌水溶解。
4)HBV抑制效率测定用荧光定量PCR检测试剂盒(深圳PG生物科技有限公司生产)测定HBV的拷贝数。病毒复制抑制率＝(1-样品孔拷贝数/对照孔拷贝数)×100％，结果见表1。
实施例3.双siRNA产生载体对HIV的复制的抑制1)转染质粒溶液的配制将1mg-10mg HBV-HIVsiRNA质粒溶解在1mL灭菌的水。pNL4-3(购于美国NIH)pNL4-3是HIV-1的侵染性质粒，在HEK293T细胞中能进行复制并产生有感染性的病毒颗粒。同样用灭菌水配成1mg-10mg/mL的溶液。
2)转染取1uL-5uLHBV-HIVsiRNA质粒溶液和1uL-5uL pNL4-3质粒溶液加5uL-10uL 5mg/mL的阳离子脂质体(厦门太阳马生物技术有限公司)共转染生长在6孔的组织培养盘上的HEK293T细胞(并用表达无关siRNA的载体作为阴性对照)。
3)HIV抑制效率测定转染后细胞再培养72小时后用p24蛋白检测试剂盒(购于Ghent Belgium公司)测定细胞培养上清液中HIV-1p24蛋白的浓度。抑制率＝(1-样品孔浓度值/对照孔浓度值)×100％。结果见表1。
权利要求
1.一种双小分子干扰RNA载体的构建方法，它包括下列步骤A、双小分子干扰RNA产生载体的构建引物合成设计了一对引物，上游引物5’-GCTGATGACGTCAGTGGAAAGACGCG-3’，下游引物5’-TCAGCGAATTCACGCCAAGCTTTTCC-3’；B、小分子干扰RNA产生模板PCR扩增以乙型肝炎病毒S基因的小分子干扰RNA表达载体为模板，用A步骤合成的引物进行扩增得到PCR产物，用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，纯化回收试剂盒纯化；C、克隆和测序将回收的DNA片段用AatII和EcoRI进行双酶切后连接到人免疫缺陷病毒小分子干扰RNA表达载体上的AatII和EcoRI位点之间，产生一个能同时表达乙型肝炎病毒S基因的小分子干扰RNA和人免疫缺陷病毒小分子干扰RNA两个小分子干扰RNA的质粒psilencer2.1-U6-HBV-HIVsiRNA，筛选到的阳性克隆测序证实，便得到双siRNA表达载体。
2.一种双siRNA载体在制备治疗或抑制乙型肝炎病毒混合感染药剂中的应用。
3.一种双siRNA载体在制备治疗或抑制人免疫缺陷病毒混合感染药剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种双小分子干扰RNA载体的构建方法及应用，其步骤是第一是双siRNA产生载体的构建引物合成；第二是siRNA产生模板PCR扩增；第三是克隆和测序；该载体在制备治疗或抑制HBV、HIV混合感染药剂中的应用。本发明的双siRNA能同时抑制两种病毒的复制，双siRNA载体的构建方法简单，操作方便。RNA干扰效率高，抑制基因表的效率可达90％以上，只使具有与siRNA同源序列的基因表达沉默而不影响其它基因的功能，所以特异性强，无毒副作用。因此用双siRNA治疗病毒混合感染是一种非常有前途的方法。
文档编号C12N15/11GK1869237SQ20061001914
公开日2006年11月29日 申请日期2006年5月26日 优先权日2006年5月26日
发明者吴建国, 邬开朗, 朱应 申请人:武汉大学