专利名称：烟草系统素原基因在转基因烟草中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于转基因植物领域，具体地说，本发明涉及一种烟草系统素基因在转基因烟草中提高烟草棉铃虫抗性的应用。
背景技术：
1972年，Green和Ryan研究发现当被昆虫伤害时，番茄和马铃薯的叶片系统性积累被称为蛋白酶抑制剂I的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白(Green T.R.，Ryan C.A.Wound-induced proteinase inhibitor in plant leavesa possible defense mechanismagainst insects.Science(1972)175776-77.)。这表明在植物的伤害部位和未伤害部位之间有一种移动的因子作为信号诱导抗性蛋白的表达及系统性的抗性反应。实验证实这种因子存在于番茄伤害叶片的粗体液中(Ryan C.A.Assay andbiochemical properties of the proteinase inhibitor inducing factor，a wound hormone.Plant Physiol.(1974)54328-32.)。当体外施加这种初提物时能激活烟草蛋白酶抑制剂基因表达。依据这种因子的蛋白酶抑制剂诱导活性，通过生化手段，纯化得到了18氨基酸的小分子多肽，因其与系统性信号转导有关所以命名为系统素(Pearce G.，Strydom D.，Johnson S.，Ryan C.A.A polypeptide from tomato leavesactivates the expression of proteinase inhibitor genes.Science(1991)253895-87.)。系统素在非常低的水平具有活性。番茄的系统素来自于一个200氨基酸的前体——系统素原(McGurl B.，Pearce G.，Orozco-Cardenas M.，Ryan C.A.Structure，expression，and antisense inhibition of the systemin precursor gene.Science(1992)2551570-73.)，编码系统素原的基因由11个外显子和10个内含子组成(McGurl B.，Ryan C.A.The organization of the prosystemin gene.(1992)Plant Mol.Biol.20405-409.)。在未受伤的植物中，发现系统素原的水平很低，但是受伤之后系统素原的水平上升了几倍，在植物受到伤害的时候明显的放大了伤害信号(McGurl B.，Pearce G.，Orozco-Cardenas M.，Ryan C.A.Structure，expression，andantisense inhibition of the systemin precursor gene.Science(1992)2551570-73.)。
过量表达反义系统素原基因的转基因植物在伤害时降低了对蛋白酶抑制剂的系统性诱导并且也降低了对食草昆虫的抗性(McGurl B.，Pearce G.，Orozco-Cardenas M.，Ryan C.A.Structure，expression，and antisense inhibition of thesystemin precursor gene.Science(1992)2551570-73.；Orozco-Cárdenas，M.McGurlB.，Ryan C.A.Expression of an antisense prosystemin gene in tomato plants reducesresistance toward Manduca Sexta larvae.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)908273-8276.)。过量表达系统素原的番茄植物，在整个植物的细胞中组成性合成和积累蛋白酶抑制剂，在没有受伤的情况下，好像这些植物处于永久的受伤状态(McGurl B.，Orozco-Cardenas M.，Pearce G.，Ryan C.A.Overexpression of theprosystemin gene in transgenic tomato plants generates a systemic signal that inducesproteinase inhibitor synthesis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)919799-9802.)。这些实验表明在伤反应中系统素是起始信号。
在其它茄科植物，如马铃薯，茄，和辣椒中也发现了系统素原的同源物(Constabel C.P.，Yip L.，Ryan C.A.Prosystemin from potato，black nightshade，andbell pepperprimary structures and biological acivities of the predicted systemins.Plant Mol.Biol.(1998)3455-62.)，但是在烟草中没有发现番茄系统素原的同源物。虽然番茄的系统素不能诱导烟草植物叶片中防卫基因的表达，然而烟草中确实存在系统性激活烟草胰蛋白酶抑制剂家族合成伤害反应(Pearce G.，Johnson S.，Ryan C.A.Purification and characterization from tobacco(Nicotiana tabacum)leavesof six small，wound-inducible，proteinase isoinhibitors of the potato inhibitor II family.Plant Physiol.(1993)102639-644.)。后来发现系统素引起悬浮培养番茄细胞的培养基碱化(Schaller，A.Oecking C.Modulation of Plasma Membrane H+-ATPaseActivity Differentially Activates Wound and Pathogen Defense Responses in TomatoPlants.Plant Cell(1999)11263-272.)。这种分析促使了两个18个氨基酸多肽从烟草叶片的分离，并且这两个多肽具有强烈的烟草胰蛋白酶抑制剂诱导活性。这两个多肽被称为烟草系统素I(Tob Sys I)和烟草系统素II(Tob Sys II)(Pearce G.，Moura D.S.，Stratmann J.，Ryan C.A.Production of multiple plant hormones from asingle polyprotein precursor.Nature(2001)411817-820.)。这两个多肽相互之间的同源性很低，两者与番茄系统素的同源性也很低。两个系统素都具有番茄系统素类似的烟草胰蛋白酶抑制剂诱导活性。Pearce等人在2001年从烟草叶片的cDNA文库中通过RT-PCR分离得到一个cDNA，其编码一个165个氨基酸包含烟草Tob SysI和II两个多肽的前体-系统素原，Tob Sys I位于系统素原的N端区域，Tob Sys II位于系统素原的C端区域(Pearce G.，Moura D.S.，Stratmann J.，Ryan C.A.Production of multiple plant hormones from a single polyprotein precursor.Nature(2001)411817-820.)。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种烟草系统素原基因(proTobsys)在转基因烟草中的应用。该转基因烟草表现为对棉铃虫的抗性大大的提高，在转基因植株上的棉铃虫生长和发育受到了明显的抑制，生长缓慢，食欲下降，烟草的受损程度也降低。过量表达烟草系统素原基因的转基因烟草诱导蛋白酶抑制剂表达和多酚氧化酶活性提高是抗性提高的主要原因。
在本发明中，为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案，该方法包括下列步骤A.依据烟草系统素原基因cDNA序列(Pearce G.，Moura D.S.，Stratmann J.，RyanC.A.Production of multiple plant hormones from a single polyprotein precursor.Nature(2001)411817-820.)设计引物Prosys5(5’-cgggatccatgagagttctgtttctcatctacc-3’)和Prosys3(5’cgggatccttaataggagtgaagaggacgctg-3’)，提取烟草的总RNA，通过RT-PCR得到烟草系统素原基因开放阅读框序列。
B.通过T载体策略将系统素原基因片段连接到pBS上，形成pBS-proTobsys，重组pBS-proTobsys测序验证。
C.用BamHI酶切包含有烟草系统素原基因片段的pBS-proTobsys；D.将C步获得的烟草系统素原基因片段连接到植物表达载体pBIm(W.Hua，L.Zhang，S.P.Liang，R.L.Jones，Y.T.Lu，A TobaccoCalcium/Calmodulin-binding Protein Kinase Functions as a NegativeRegulator of Flowering，J.Biol.Chem.279(2004)31483-31494.)上，形成pBIm-proTobsys(+)；使得烟草系统素元基因置于35S启动子和NOS尾巴之间，形成可转化或表达的载体；E.将pBIm-proTobsys(+)通过制备的农杆菌LBA4404(W.Hua，L.Zhang，S.P.Liang，R.L.Jones，Y.T.Lu，A Tobacco Calcium/Calmodulin-binding ProteinKinase Functions as a Negative Regulator of Flowering，J.Biol.Chem.279(2004)31483-31494.)感受态转化进入农杆菌LBA4404，再通过叶盘法导入烟草叶片；F.筛选阳性植株.将烟草叶片在农杆菌LBA4404中浸泡10min，叶片上表皮朝下置于共培养上，25℃光照培养2-3天，共培养结束后，用液体MS培养基洗叶片2次，再用加羧苄青霉素(500μg/ml)的液体MS培养基洗1次，叶片转移到选择培养基上，每隔15天继代一次选择培养基，待再生芽长至1cm时切下小芽移至生根培养基上。苗生根后，移栽至土钵中形成完整的植株。
G.将通过Northern鉴定过量表达烟草系统素原基因的转基因烟草进行棉铃虫取食烟草叶片实验。将人工孵化3天的棉铃虫幼虫接到转基因烟草叶片上，以野生型烟草作对照，每株烟草上接20条棉铃虫。棉铃虫取食烟草叶片10天后统计棉铃虫的体重和体长，转基因烟草植株上棉铃虫的体重和体长分别是野生型烟草上棉铃虫的47％和73％，野生型烟草受到棉铃虫的伤害程度也远大于转基因烟草。通过上述步骤烟草系统素基因(proTobsvs)在转基因烟草对棉铃虫抗性中得以应用。
转基因烟草抗性蛋白表达和活性分析。分析表明蛋白酶抑制剂的表达在转基因烟草中显著提高，转基因烟草中多酚氧化酶的活性是野生型烟草多酚氧化酶活性的40倍左右。说明蛋白酶抑制剂和多酚氧化酶是受系统素调节的烟草伤害信号通路下游的抗性蛋白。蛋白酶抑制剂表达和多酚氧化酶活性在转基因烟草和野生型烟草中的差异是转基因烟草抗性提高的主要原因之一。
本发明有以下优点1.指出烟草系统素原基因在伤害反应中的功能，即来源于系统素原的系统素是烟草伤害反应信号转导的起始信号以诱导下游一系列的反应。
2.指出了过量表达系统素原基因能提高烟草对棉铃虫的抗性，减少了棉铃虫对烟草的伤害。
3.指出了过量表达系统素原基因能提高下游抗性基因蛋白酶抑制剂和多酚氧化酶的表达。
图1植物表达载体pBIm示意图其中Kanamycin为卡那霉素抗性，promoter为35S启动子，NOS尾巴为转录终止子。
图2转化植株的核酸分析-PCR鉴定结果W为对照野生植株，Transgenic lines为转基因植株，结果显示转基因植株成功导入外源基因。
图3转化植株的Northern结果W为对照野生植株；T2、T8、T10、T12为转基因植株，结果显示转基因植株系统素原基因过量表达。
图4棉铃虫取食转基因烟草与野生烟草对比。
a.取食烟草叶片10天后的棉铃虫，W为取食野生型烟草叶片棉铃虫，T为取食转基因烟草叶片棉铃虫；b.棉铃虫取食烟草叶片3天后，烟草叶片伤害状况，W为野生型烟草叶片，T为转基因烟草叶片；c.棉铃虫取食烟草叶片10天后，烟草伤害状况，W野生型烟草，T转基因烟草。
图5转基因烟草和野生型烟草蛋白酶抑制剂表达W为野生型烟草对照，T2、T8、T10、T12为4个不同的转基因株系。
图6转基因烟草和野生型烟草多酚氧化酶活性a.分广光度法分析多酚氧化酶活性。W为野生型烟草，T2，T8，T10，T12为不同转基因烟草株系。
具体实施例方式
下面具体阐述本发明。
实例1含有烟草系统素原基因的表达载体构建根据烟草系统素原基因的cDNA序列(Pearce G.，Moura D.S.，Stratmann J.，Ryan C.A.Production of multiple plant hormones from a single polyprotein precursor.Nature(2001)411817-820.)，设计引物Prosys5(5’-cgggatccatgagagttctgtttctcatctacc-3’)和Prosys3(5’cgggatccttaataggagtgaagaggacgctg-3’)，RT-PCR克隆得到烟草系统素原基因。通过T载体策略将系统素原基因序列连接到pBS上，重组pBS-proTobsys测序验证。BamHI37℃消化pBS-Prosys获得的系统素原基因片段克隆到植物表达载体质粒pBIm(W.Hua，L.Zhang，S.P.Liang，R.L.Jones，Y.T.Lu，A Tobacco Calcium/Calmodulin-binding Protein KinaseFunctions as a Negative Regulator of Flowering，J.Biol.Chem.279(2004)31483-31494.)中，形成pBIm-proTobsys(+)。
实例2含有烟草系统素原基因的植株的转化与筛选(1).农杆菌感受态的制备将农杆菌LBA4404(W.Hua，L.Zhang，S.P.Liang，R.L.Jones，Y.T.Lu，ATobacco Calcium/Calmodulin-binding Protein Kinase Functions as a NegativeRegulator of Flowering，J.Biol.Chem.279(2004)31483-31494.)划YM(W.Hua，L.Zhang，S.P.Liang，R.L.Jones，Y.T.Lu，A TobaccoCalcium/Calmodulin-binding Protein Kinase Functions as a NegativeRegulator of Flowering，J.Biol.Chem.279(2004)31483-31494.)平板，26-28℃培养48小时，挑取单菌落接种到40ml YM液体培养基中，250rpm悬浮培养约12-20小时，然后在超净台上将菌液转入灭过菌的50ml离心管中，4℃，8000rpm，离心8分钟，弃上清，用100mM氯化钠(NaCl)(4℃预冷)重悬农杆菌，4℃，8000rpm，离心8分钟，弃上清，加入原始菌液1/50体积(800μl)的20mM氯化钙(CaCl2)重悬菌体，并分装成100μl/管。(此时的感受态农杆菌可以直接用于转化)，或置液氮中10秒钟，放入-20℃或-80℃冰箱中保存备用。
YM培养基的配方酵母抽提液 0.4g/l甘露醇 10g/l氯化钠(NaCl) 0.1g/l硫酸镁(MgSO4) 0.1g/l
磷酸氢二钾(K2HPO4) 0.5g/l琼脂粉 15g/lpH7.2-7.4LB培养基(100ml)蛋白胨 1g酵母抽提物 0.5g氯化钠 1g(2).重组质粒转化农杆菌将感受态农杆菌LBA4404置于冰上，加入1μg pBIm-proTobsys(+)质粒DNA(体积不宜超过10μl)，充分混匀，置冰上30分钟，置液氮中1分钟(时间不能过长)，然后迅速转入37℃水浴中，待其融化后加入1ml YM液体培养基于28℃，230rpm培养2-4小时，3000rpm离心2分钟，将上清吸去500μl，留500μl于管中，振荡重悬菌体，并涂布到含有卡那霉素(50μg/ml)和硫酸链霉素(25μg/ml)的YM平板上，吹干，28℃培养48小时，挑取单菌落接种到含有卡那霉素(50μg/ml)和硫酸链霉素(25μg/ml)的液体YM培养基中，28℃，250rpm培养48小时，菌液用于保存或转化。
(3).烟草叶盘法转化将成熟的烟草种子70％乙醇洗30s，无菌水洗5％的次氯酸钠(NaClO)浸洗5-10min；无菌水洗4-5遍；将烟草种子平铺在琼脂浓度为0.8％的MS(pH5.8)培养基上，萌发的烟草无菌苗备用。
接种农杆菌LBA4404(含质粒DNA)于固体YM培养基上，两天后挑取单菌落于50mlYM液体培养基中，200rpm，28℃培养42-48小时，待OD600为1.0左右时使用，将烟草叶片在农杆菌中浸泡10min，叶片上表皮朝下置于共培养基上，25℃光照培养2-3天，共培养结束后，用液体MS培养基洗叶片2次，再用加羧苄青霉素(500μg/ml)的液体MS培养基洗1次，叶片转移到选择培养基上，每隔15天继代一次选择培养基，待再生芽长至1cm时切下小芽移至生根培养基上。苗生根后，移栽至土钵中形成完整的植株。
MS培养基成分
大量元素
微量元素
铁盐
烟草转化培养基共培养基MS+2-吗啉乙磺酸(MES)(0.59g/l)+萘乙酸(NAA)(0.1mg/l)+苄氨基嘌呤(BA)(1mg/l)+卡那霉素(Kan)(300mg/l)选择培养基MS+MES(0.59g/l)+NAA(0.1mg/l)+BA(1mg/l)+Kan(300mg/l)+羧卞青霉素(Carb)(500mg/l)生根培养基1/2MS+Kan(100mg/l)+Carb(200mg/l)
实施例3含有烟草系统素原基因转化植株的核酸分析-PCR1.用于PCR的转化植株总DNA的提取70％乙醇擦洗叶片，称取100mg，加入600μl抽提缓冲液(0.2M氯化钠(NaCl)，25mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)，pH7.5)，室温快速研磨，在1.5ml Eppendorf管中涡旋混匀5-20秒于室温，12000rpm，离心25分钟。取上清加等体积异丙醇，上下颠倒混匀。-20℃沉淀过夜，室温条件下，12000rpm，15分钟。弃上清，倒置于吸水纸上待壁上液体流尽后加入200μl 70％的乙醇泡洗DNA沉淀，室温(20-25℃)，12000rpm，10分钟。弃乙醇，倒置于纸巾上待其干燥后加100μl TE缓冲液(pH 7.5)溶解沉淀。分光光度计测定或电泳估测DNA浓度，最后以总DNA为模板，进行PCR反应和电泳检测。
2.PCR程序PCR反应混合液的配比同质粒PCR鉴定，反应的时间和温度作如下94℃3min94℃1min，55℃1min，72℃1min30s，30cycles72℃10min实施例4含有烟草系统素原基因转化植株的核酸分析Northern杂交1.RNA提取液氮研磨烟草组织，将研磨好的样品加入1ml TRizol试剂，室温(20-25℃)下放置5min。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15sec。室温22-25℃放置2-3min，12,000×g，4℃，离心15min。上清转移到另一离心管中，加入0.5ml异丙醇室温沉淀RNA 10min。12,000×g，4℃，离心10min。用70％乙醇洗涤沉淀，室温22-25℃干燥。沉淀溶于焦碳酸二乙酯处理的无菌水(DEPC-H2O)。
2.转膜RNA电泳10×电泳上样缓冲液50％(V/V)甘油(用DEPC处理的水稀释)10mM EDTA(pH8.0)
100μg/ml EB(用DEPC处理的水稀释)RNA样品缓冲液甲酰胺 50μl10×MOPS10μl甲醛17.5μl①制备凝胶(1.2％)称1.2克琼脂糖，加72ml DEPC处理的水，加热溶化。冷却至60℃，在通风厨内加入10×凝胶缓冲液10ml，甲醛(37％)18ml，混均后倒入凝胶模具中。
②样品制备在离心管里，将RNA样品与RNA样品缓冲液以1∶2比例混合。65℃温浴5-10分钟，迅速在冰上冷浴5分钟，瞬时离心数秒。对于Northern杂交实验，总RNA上样量可达到10-30μg。
③上样前凝胶需预电泳5min，随后将样品加入上样孔。以5V/cm的电压电泳1.5h-2.0h。
④待溴酚蓝迁移至凝胶长度2/3-4/5处结束电泳。
⑤在紫外灯下观察结果。
2)转膜①用焦碳酸二乙酯处理的无菌水(DEPC-H2O)淋洗RNA胶，再用10×标准柠檬酸缓冲液(SSC)洗两次，每次30min。
②用吸印法或者转膜仪转RNA到尼龙膜上(步骤同Southern Blot)。转膜后在紫外交联仪上交联。立即使用或者4℃保存。
3)探针的制备①制备探针5×标记缓冲液10μl(dATP、dTTP、dGTP各50μM)dNTP2μl(3’非翻译区)变性的DNA模板 25ngBSA(10mg/ml) 2μlα-32PdCTP 50μCiKlenow(5U/μl) 1μl②室温22℃反应1-2小时。
③加入2μl 0.5M EDTA终止反应。
④加入35μl STE，过柱纯化探针。
4)预杂交①杂交液0.5M Na2HPO4pH7.47％SDS②ssDNA(10mg/ml)70μl煮沸5min，放冰上10min。
③将交联有RNA的膜至于杂交管中，带有RNA的面朝内。
④加入5-10ml预杂交液(即无探针的杂交液，含有100μg/ml的变性的ssDNA)，防止产生气泡。
⑤65℃，2-3h。
5)杂交探针煮沸5min，放于冰上。倒掉预杂交液，加入杂交液后加入探针，65℃，10-16h。
6)洗膜①2×SSC/0.1％SDS，65℃洗两次，每次15min；②0.2×SSC/o.1％SDS，65℃洗两次，每次5min；7)放射自显影，洗胶片洗膜、压片杂交完成后，用含2×SSC，0.2％SDS的洗液在室温下冷漂洗一次，再用预热至65℃的洗液(1×SSC或0.5×SSC，0.1％SDS)于65℃热洗两次，各15分钟。晾半干，迅速用保鲜膜包裹，放入暗夹。在暗室里装入X-光片，把暗夹放在-80℃冰箱中放射自显影4-7天，冲洗X-光片。
实例5.转基因烟草对棉铃虫抗性分析将人工孵化3天的棉铃虫幼虫接到转基因烟草叶片上，以野生型烟草作对照，每株烟草上接20条棉铃虫。棉铃虫取食烟草三天观察烟草受棉铃虫的伤害程度，发现转基因烟草上的棉铃虫取食的叶片要明显少于野生性烟草上的棉铃虫取食的叶片。棉铃虫取食烟草叶片10天后统计棉铃虫的体重和体长，转基因烟草植株上棉铃虫的体重和体长分别是野生型烟草上棉铃虫的47％和73％，野生型烟草受到棉铃虫的伤害程度也远大于转基因烟草。
实例6.转基因烟草蛋白酶抑制剂表达和多酚氧化酶活性分析取野生型和转基因烟草的叶片组织，液氮研磨后提取叶片组织的总RNA；在RNA变性胶上电泳；RNA转到尼龙膜上；用烟草蛋白酶抑制剂I和II(Tob-PI I和Tob-PI II)cDNA两端设计的引物(Heitz T.，Geoffroy P.，Stintzi A.，Fritig B.，Legrand M.cDNA cloning and gene expression analysis of the microbial proteinaseinhibitor of tobacco.J.Biol.Chem.268(1993)16987-16992；Balandin T.，van derDoes C.，Albert，J.M.Bol J.F.，Linthorst H.J.Structure and induction pattern of anovel proteinase inhibitor class II gene of tobacco.Plant Mol.Biol. 27(1995)1197-1204.)，通过PCR从已经测序鉴定的重组质粒pBS-Tob-PI I和pBS-Tob-PIII中扩增烟草蛋白酶抑制剂I和II的基因片段作为Northern杂交探针制备的模板。用制备探针进行杂交；放射自显影显示蛋白酶抑制剂的表达。
依据Laukkanena 1999年报到方法，分析烟草叶片组织中多酚氧化酶的活性(Laukkanena H.，Haggman H.，Kontunen-Soppela S.，Hohtola A.Tissue browningof in vitro cultures of Scots pineRole of peroxidase and polyphenol oxidase.Physiol.Plant.106(1999)337-343.)。取新鲜的烟草叶片100mg在液氮中研磨，然后将研磨的组织转移到EP管中，向EP管中加入1ml 100mM预冷的磷酸钠(pH7.0)摇匀放置于冰上5min；4℃，8,000rpm，离心5min，取上清。将100μl粗提物上清液加入到反应混合液中。反应混合液含有50mM磷酸钠(pH8.7)和10mM对苯二酚，反应混合液的总体积为1000μl。取100μl反应混合液在25℃，410nm处测定其在5min内吸收值的变化。测定的吸收值变化强弱表示烟草多酚氧化酶活性的强弱，变化越大说明多酚氧化酶的活性越强，请见表1。
表1棉铃虫取食烟草叶片10天后，棉铃虫的体重和体长
权利要求
1.一种烟草系统素原基因在转基因烟草中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种烟草系统素原基因在转基因烟草中的应用，其步骤是A.通过RT－PCR得到的cDNA序列；B.用T载体的策略将proTobsys克隆；C.BamHI酶切包含有proTobsys的pBS－proTobsys；D.将获得的片段连接到植物表达载体pBIm上，形成可转化载体；E.将制备的载体通过制备的农杆菌感受态转化进入农杆菌，再通过叶盘法导入烟草叶片；F.对转基因烟草进行杂交鉴定，得到proTobsys过量表达的转基因烟草；G.转基因烟草进行棉铃虫取食烟草叶片实验，转基因植物对棉铃虫的抗性提高。分析转基因烟草抗性基因的表达和活性，转基因烟草蛋白酶抑制剂表达和多酚氧化酶活性都提高。
文档编号C12N15/82GK1884540SQ200610019360
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月15日 优先权日2006年6月15日
发明者吕应堂, 任峰 申请人:武汉大学