专利名称：利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达多肽的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，更具体涉及一种利用谷物非储藏蛋白为融合蛋白在胚乳表达多肽的方法及应用，即以水稻和大麦等谷物作物胚乳细胞作为生物反应器，采用融合蛋白的技术策略，将胚乳细胞特异性融合蛋白表达载体通过转基因方法，导入水稻、大麦细胞，在转基因水稻/大麦的胚乳细胞中特异性表达和大量积累融合蛋白的方法以及由该方法所生产的植物来源的多肽。
背景技术：
小分子多肽通常是指氨基酸序列在100个以下的多肽，最近几年来，他们在医药、疾病治疗、分子疫苗等方面有着广泛的用途。这些包括抗体表面抗原、抗各种病原菌作用、疾病诊断以及艾滋病和癌症的治疗等。尤其是随着一些分子生物学技术-噬菌体展示技术，越来越多的多肽被发现，因而需要生产大量的多肽来满足各种功能研究、临床试验以及疾病治疗的需要。通常这些小于40个氨基酸的多肽生产，主要是以化学合成为主，由于在化学合成过程中，有一些不完全地化学反应和化学修饰(Dobeli，等1998，Protein Expression &Purification，Vol，12404-414)，有些多肽即使是小于40个氨基酸的多肽也较难合成。因而，利用生物学系统来生产多肽具有它的优越性和必要性。
在上世纪50年代，主要医药产品的生产是以细菌作为生物反应器。但由于细菌属于原核生物，不具备真核生物的蛋白质合成与加工系统。而一些蛋白质的生物活性是依靠蛋白质的修饰来达到的，所以，它的应用受到了限制。酵母作为第二代生物反应器，在上世纪70年代开始应用于医药产品生产，由于产量低，其体内修饰/加工系统统不完善，也限制了它的广泛应用。第三代生物反应器是利用高等植、动物细胞作为生物反应器。目前真核生物反应器可分为动物和植物生物反应器两大类，动物生物反应器有细胞培养与转基因动物两种，目前一些主要的医用抗体使用动物CHO细胞系(或小鼠)细胞培养来生产。转基因动物研究方面主要是在转基因乳牛的乳腺细胞表达重组蛋白质以及在鸡蛋蛋清中表达重组蛋白质。然而，动物细胞培养和转基因动物由于不能克服动物病原菌的污染问题，加上动物细胞培养的成本极高，大规模生产需要巨大的投资，有人估计，全世界目前只有1000公斤的生产单克隆抗体的能力；据计算，每扩大1000公斤的生产能力，需要投资40亿美元，并要花10年的时间来建成投产，这些数据说明现有的重组蛋白质的生产体系和能力大大地小于市场需求，因而急需一个高效、安全的表达系统来满足多肽的巨大市场需求。
在大多数情况下，重组蛋白质的表达需要多肽的长度至少在80个氨基酸以上，尽管如此，其表达水平也非常低，因而，提高多肽表达水平的方法主要是通过融合蛋白的方式。到目前为止，融合蛋白载体的研究主要在原核生物大肠杆菌和酵母，例如麦芽糖结合蛋白(maltosebinding protein MBP)、FLAG(Einhauer et al，2001，J.Biochem.Biophys.Methods，Vol49455-465)and谷胱甘肽(GST)(Papaioannou et al，2002，Protein Expression & Purification，Vol，13462-466)等被用于在大肠杆菌和酵母的宿主表达系统，虽然有些融合载体已经商业化，但仅用于实验室的基础研究。而利用植物表达体系表达多肽的研究起步较晚。最近，有报道利用蛋白质二硫键歧化酶(PDI)和绿色荧光蛋白(GFP)作为融合蛋白来表达多肽，但表达量也很低。在另一方面，虽然许多多肽已成功地在大肠杆菌和酵母为宿主进行了表达，由于这些宿主具有可能的病原污染，存在着明显的安全隐患。另外，目前所用的原核细胞的融合蛋白载体的融合蛋白的分子量较大、表达量低以及表达后形成不溶的包涵体，这些给下游的加工带来麻烦，因而不适合真核生物，尤其是高等植物细胞的宿主系统。虽然有人尝试用植物细胞来表达多肽，但是表达量一直是一个瓶颈。
由于上述这些缺陷与限制，开发高等植物的融合蛋白表达载体显得尤为重要。尤其最近高等植物作为生物反应器具有低价格、高表达量、容易扩大生产和无病原菌污染等优点。利用高等植物细胞来生产多肽具有广阔的前景。到目前为止，由于这些原核生物的融合载体的分子量较大，缺乏细胞器转运信号等，因而均不适合于高等植物细胞的表达。因此，研究和开发适合于高等植物的融合载体具有十分重要的意义和应用前景。美国的VentriaBioscience公司采用水稻储藏蛋白作为融合载体来表达小分子多肽已经获得了成功，虽然他们用水稻的盐溶储藏蛋白(globulin)作为融合蛋白载体取得了较高的表达，但由于盐溶储藏蛋白来表达多肽存在溶解性的问题，因而在很多方面限制了它的应用。在水稻胚乳细胞除储藏蛋白外，大量表达的另外两种蛋白是内质网结合蛋白(BiP)和蛋白质二硫键歧化酶(PDI)，它们均储藏在蛋白体I中。在Bip蛋白的C-末端均具有分子伴娘功能，在帮助蛋白质折叠成正常功能的蛋白质构象发挥着重要作用，以它作为融合蛋白不但可以使融合蛋白储藏在蛋白体内，类似于储藏蛋白在蛋白体内储藏，还可以增加融合蛋白的溶解性，克服现有用储藏蛋白作为融合蛋白的不溶性问题。在水稻胚乳中的另一个表达量较高的非储藏蛋白是PDI。PDI具有两个功能，-是在它的N-末端具有二硫键歧化酶活性，在它的C-末端具有分子伴娘的功能。利用其C-末端作为融合蛋白载体同样可以达到增加融合蛋白表达和可溶性的目的。本专利用两个胚乳特异性表达的非储藏蛋白PDI和Bip作为融合载体，在提高表达量和克服可溶性两个方面克服了现有的利用储藏蛋白作为融合蛋白的国际专利，具有独立自主的创新。
类胰岛素生长因子(IGFs)是一类参与许多增生与新陈代谢过程的重要生长因子之一，对人体骨骼生长起着重要的作用，还能够促进相应细胞的成熟以及参与人体创伤的愈合。类胰岛素生长因子(Insulin-like growth Factor-I，IGF-I)是一种含70个氨基酸及3个二硫键、无糖基化位点的单链多肽分子(De Bree，et al.，1998，Protein Expression&Purification，Vol13，319-325))。基于其中可识别的二硫键位置分析，其二级结构被认为与胰岛素相似，它们保守的甘氨酸都在相同的位点上，而且含有相似的非极性核心氨基酸残基。在医疗上，它有着广泛的应用的现状与前景。仅以重组生产的人类的IGF-I(rhIGF-I)及其复合体而言，已经被有效地用于治疗生长激素敏感综合症(growth hormone insensitivity syndrome，GHIS)，其中包括生长激素缺陷(GH receptor deficiency)，IGF基因缺失、生长激素信号转导途径受阻；此外它还被用于有治疗患有I型或II型糖尿病或有着严重胰岛素抗性症状的一系列病人。在这些病人中，用rhIGF-I治疗都能够明显地改善病人的症状。此外，而用rhIGF-I或其复合体rhIGF-I/IGFBP-3还有可以治疗慢性炎症、营养紊乱等症状，如克罗恩氏病(Crohn’s disease，又称节段性回肠炎)，少年慢性关节炎以及膀胱/胆囊纤维化等。在这些病症中，有关IGFs的药效研究还非常有限，其中IGFs的供给非常紧缺是其主要原因之一(Savage，et al.，2005，Edocr Development，Vol.9100-106)。
发明内容
本发明针对现有原核和真核生物为宿主的生物反应器表达量低、可溶性差、无生物活性和不安全等缺点，利用谷物作物的非储藏蛋白的内质网结合蛋白(Bip)和蛋白二硫键异构酶(PDI)的C-末端的分子伴侣的功能，以此作为融合蛋白，与小分子目标多肽基因融合，采用水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，介导融合蛋白表达后进入水稻胚乳细胞的内膜系统，并储存到水稻胚乳的蛋白体中，从而使融合蛋白能在水稻种子内大量积累，最终达到较高水平。本发明不仅有效地解决了其他表达系统的表达量低、可溶性差、无生物活性等问题，还可以完全杜绝动物病原菌的污染问题。
本发明的目的是在于提供了一种利用种子谷物储藏醇溶谷蛋白基因Gt13a的启动子和信号肽介导融合蛋白在胚乳细胞特异性表达并储存在水稻胚乳细胞的蛋白体内的方法，使融合蛋白不受细胞质内的蛋白酶攻击，在水稻胚乳内大量积累，最终获得较高融合蛋白产量的表达方法。
本发明的再一个目的是利用谷物非储藏蛋白-Bip和PDI的C末端分子伴侣的功能结构域作为融合蛋白，同时解决提高融合蛋白在胚乳细胞的表达量和可溶性两个关键问题，建立水稻或大麦等谷物胚乳细胞高效表达小分子多肽的新技术平台，利用该平台生产小分子多肽，不仅比转基因奶牛和转基因鸡表达系统更安全、无病毒污染，而且容易规模化；比其他植物表达体系具有更高的产量和更低的生产成本。
本发明的第三个目的利用谷物非储藏蛋白为融合蛋白载体在水稻和大麦胚乳表达IGF-1的应用，即将融合蛋白基因和目的基因的遗传密码子转换为水稻偏爱的遗传密码子，从而提高了重组蛋白质的翻译水平，最终提高融合蛋白在水稻胚乳细胞的表达与积累。
下面对本发明的方法进行详细描述A、水稻特异性启动子及信号肽的获得为了获得较强的水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，根据生物信息学分析，采用水稻储藏蛋白的醇溶谷蛋白基因家簇中的一个成员Gt13a基因的启动子具有较高活性。为了获得Gt13a启动子和它的信号肽序列，根据基因数据库的Gt13a(基因库登记号AP003256)合成了一对核苷酸引物(引物序列见专利申请号200510019084.4的序列1和2)用于PCR扩增。为了便于基因克隆，在正向引物的5’端加入了一个粘性末端的酶切位点，在反向引物的5’端加了一个平末端的酶切位点。从水稻品种台北309叶片中提取基因组DNA，以此DNA为模版，按照标准的PCR程序，利用上述引物扩增出了一个1284碱基的DNA片段。经DNA序列分析，此DNA片段具有明显的启动子结构，得到了一种可介导重组蛋白在谷物胚乳中表达的启动子和信号肽，其具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
B、水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建经PCR获得Gt13a启动子和信号肽的序列后，PCR产物经粘性末端和平末端内切酶消化后，将这个片段与经粘性末端和平末端内切酶消化的pBI221片段连接(美国克隆技术(Clontech)有限公司)，然后导入大肠杆菌品系DH10B(美国Invitrogen生物技术公司的产品)，形成了含有Gt13a启动子、Gt13a信号肽和Nos终止子的水稻胚乳特异性表达的基本载体，并将这个载体质粒命名为pOsPMP2，见图1，其具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
C、融合蛋白和目的基因的密码子优化与基因合成从美国生物技术信息中心(NCBI)基因库里获得了水稻Bip(基因库登录号为AAB63469)、小麦的PDI基因(基因库登录号为AJ277377为)和类胰岛素生长因子基因(基因库登录号为CAA01955)的氨基酸序列，由DNA分析软件马克载体(MacVector，英国的阿克尔勒斯(Accelrys)公司产品)将这些基因的氨基酸序列转换成含有优化水稻遗传密码子的核苷酸序列，由美国商业化的BlueHeron Biotechnology公司人工合成了这些基因，这种经水稻密码子优化的水稻Bip基因的C末端片段，其具有SEQ ID NO.3和一种经水稻密码子优化的小麦PDI基因的C末端片段；其具有SEQ ID NO.4和一种经水稻密码子优化的人IGF-1基因；其具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。经密码子优化后的这些基因的核苷酸序列比原始基因序列改变了11.2-21.4％，遗传密码改变了30.5-54.3％，但其氨基酸的序列不变(见表1)。
表1、密码子优化后的融合蛋白基因的比较
在人工合成基因时，在基因合成的引物5’和3’末端分别加上平末端和粘性末端的限制性内切酶，便于基因克隆。
D、各种表达融合蛋白载体的构建1)、pOsPMP25(Gt13a-PDIC-IGF-1-Nos)的构建首先，pOsPMP2质粒DNA用MscI和XhoI进行双酶切，然后将经PCR扩增的密码子优化的人类胰岛素样生长因子(humanIGF-1)基因片段克隆到pOsPMP2载体中。转化E.coli宿主细胞DH10B，产生一个含有IGF-1基因的中间质粒pOsPMP3；用限制性内切酶NaeI和NcoI消化pOsPMP3质粒DNA，将PCR扩增的PDIC的DNA片段克隆到中间质粒载体，最终形成了水稻特异性表达的融合蛋白表达载体pOsPMP25(Gt13a-BipC-IGF-1-Nos)。
2)、pOsPMP26(Gt13a-BipC-IGF-1-Nos)的构建用限制性内切酶NaeI和NcoI消化pOsPMP3质粒DNA，将PCR扩增的BipC DNA片段克隆到pOsPMP3质粒载体，最终形成了水稻种子特异性表达的融合蛋白表达载体pOsPMP26(Gt13A-BipC-IGF-1-Nos)。
3)、选择性标记基因载体的构建为了使选择性标记基因在水稻愈伤组织内高效表达而提高转基因的选择效果，采用水稻半胱氨酸蛋白酶基因(Cysteine proteinase β，CP)的启动子介导选择性标记基因(抗潮草霉素基因--潮霉素磷酸转移酶)在愈伤组织中特异表达。首先，合成了一对PCR引物，请见SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，在PCR引物的两端加了HindIII和SmaI位点；以水稻品种台北309的基因组DNA为模版，采用标准PCR反应，扩增出一个长度为1103碱基含有启动子的片断，PCR产物经HindIII和SmaI消化后，该PCR片段与克隆载体pBI221(美国的克隆技术(Clontech)有限公司.)连接，然后转化大肠杆菌品系DH10B，产生了中间质粒pOsPMP4。选择性标记基因采用潮霉素磷酸转移酶基因(Hygromycin βPhosphotransferas，Hpt)，该基因从质粒pCAMBIA1301(澳大利亚的哥仑比亚(CAMBIA)公司)扩增，在正向引物，请见SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9的5’末端加上了一个平末端限制性内切酶为位点SmaI，在反向引物的5’末端加上了一个粘性末端的限制性内切酶位点XhoI，以pCAMBIA1301质粒为模版，采用标准PCR反应，扩增出潮霉素磷酸转移酶基因片断，PCR产物用SmaI和XhoI消化，pOsPMP4DNA用NaeI和XhoI消化，然后将潮霉素磷酸转移酶基因片断与具有CP(Cysteine proteinase β，CP)启动子的pOsPMP4质粒经NaeI和XhoI消化的DNA片段连接，转化大肠杆菌菌系DH10B，最终产生了水稻组织特异性表达的选择性标记表达载体，命名为pOsPMP5。
水稻基因遗传转化水稻种子去壳后，在20％次氯酸钠中消毒20分钟，用灭菌水漂洗3次，然后在愈伤组织诱导培养基上诱导20-25天，诱导的愈伤组织转移到预处理培养基上生长9-10天后，用于遗传转化。将0.5微克的表达载体质粒pOsPMP25和pOsPMP26和具有选择性标记质粒pOsPMP5的DNA，与50微升的金粉、250微升的1M氯化钙和50微升的0.1M亚精胺混合后，反应30分钟，用酒精洗三次，将DNA包裹在金粉上，然后按照美国杜邦公司的基因枪方法，将两个质粒共转化到台北309产生的愈伤组织。在含有潮霉素B的选择培养基上经45天的筛选，具有潮霉素B抗性的愈伤组织在再生培养基上，在光照下经20天左右的诱导，愈伤组织分化成绿色植株，然后将幼小植株转到生根培养基上，经15-20天的诱导，形成完整的植株，获得转基因植株，这些转基因植株经PCR检测，证明其含有融合蛋白基因后，转到试验田生长发育成成熟的种子，此为T1种子。
高表达转基因植株的筛选转基因水稻经过4个月左右的生长和发育，抽穗开花后，经一个月的时间，形成成熟的转基因水稻T1代种子。其中有50-60％的转基因植株正常结实。当T1种子收获后，从水稻成熟胚乳的粗提取物，采用蛋白质印迹法，筛选高效表达的转基因单株，利用蛋白质定量检测的酶联免疫(ELISA)技术(美国的R&D system公司产品)定量分析表达量，从T1种子中筛选表达融合蛋白高的转基因个体，经T1代的继续选择，形成稳定表达融合蛋白的转基因品系。供大面积生产融合蛋白之用。
本发明是利用水稻、大麦等谷物胚乳作为生物反应器来生产可溶的、具有生物活性的重组小分子多肽的融合蛋白，使其表达水平至少达到水稻种子重量的0.3％以上，即每公斤种子的多肽融合蛋白产量达到3克以上，其表达量是叶绿体表达体系得最高量的～20倍和马铃薯块茎表达体系的最高量的～500倍。
本发明利用水稻、大麦等谷物作物的胚乳细胞作为生物反应器生产小分子多肽，克服了动物、微生物和其他植物表达体系存在的表达量低、生产成本高、可溶性差和安全性低等弊病。
本发明利用谷物作物非重组储藏蛋白作为融合蛋白载体，能有效地克服了现有美国的国际专利—“利用水稻储藏蛋白作为融合蛋白在植物种子高效表达小分子多肽”的技术(美国专利申请号US60/527-753，题目是High-Level Expression ofFusion Polypeptides in Plant SeedsUtilizing Seed-Storage Proteins as Fusion Carriers)所存在的表达融合蛋白的不溶性问题。
本发明利用非储藏蛋白融合蛋白体系由于其表达量高，比现有技术的表达量高20-500倍、重组蛋白可溶性好，有效地解决了在高量表达时的可溶性问题；表达的融合目标多肽可在不经切割的情况下，仍具有生物学活性，可节省生产成本40-50％，其特点是a、谷物作物种子的非储藏蛋白作为融合蛋白载体在谷物种子中表达各种医药或保健用途的多肽，其表达量达到0.3％种子重量以上。
b、利用单子叶作物种子储藏蛋白基因的启动子和信号肽，在种子中特异性表达各种医药、保健用途的多肽，例如在水稻胚乳表达IGF-1融合蛋白达到0.75％的种子干重。
c、在种子中表达各种医药的多肽指氨基酸序列在20-100之间的多肽。包括人血液中各种具有医用和保健用途的多肽、各种抗肿瘤的多肽、各种抗菌多肽和其他具有对人体具有治疗和保健作用的多肽。
d、在水稻/大麦种子中表达重组人的类胰岛素生长因子-1。
将表达载体质粒的代号及其内涵对照如下pOsPMP2----水稻胚乳特异性表达的基本载体pOsBipC-----带有重组Bip-IGF-1融合蛋白基因的载体pOsPDIC-----带有重组PDI-IGF-1融合蛋白基因的载体
pOsPMP3-----带有水稻密码子优化的IGF-1基因的载体pOsPMP25------水稻胚乳特异性表达重组融合蛋白基因(Bip-C-IGF)的载体质粒pOsPMP26------水稻胚乳特异性表达重组融合蛋白基因(PDI-C-IGF)的载体质粒pOsPMP5-----水稻组织特异性表达的选择性标记表达载体
图1、构建的水稻胚乳特异性表达载体pOsPMP2(Gt13a Sp-Stuff-Nos)的限制性内切酶图谱图2、构建的pOsPMP25(Gt13a-BipC-IGF-1)的限制性内切酶图谱图3、构建的pOsPMP26(Gt13a-PDIC-IGF-1)的限制性内切酶图谱图4、构建的水稻愈伤组织特异性表达的选择性标记基因载体pOsPMP05(CP-Hpt-Nos)的限制性内切酶图谱。
图5为考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶染色图谱。箭头显示高效表达的BipC-IGF-1融合蛋白经考马斯亮蓝染色后清晰可见，但在对照样品台北309和遗传分离的单株中缺少对应的蛋白质带；图6为利用IGF-1特异性抗体的蛋白质印迹法图谱。箭头显示高效表达的BipC-IGF-1融合蛋白，融合蛋白在转基因胚乳中显而易见，但在对照样品台北309和遗传分离的单株中缺少对应的蛋白质带。
图7为利用Bip特异性抗体的蛋白质印迹法图谱。箭头显示出高效表达的BipC-IGF-1融合蛋白和内源非融合Bip蛋白，在转基因胚乳中含有内源的Bip蛋白和Bip-IGF-1融合蛋白，而在对照样品台北309和遗传分离单株中只有内源Bip蛋白，而缺少重组的Bip-IGF融合蛋白。
图5、图6、图7显示水稻胚乳中表达重组融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶染色和蛋白质印迹法图谱。从转基因水稻胚乳中提取的重组融合蛋白，从转基因#26-13株系取11粒T1代种子，每粒转基因水稻种子用1毫升蛋白质提取缓冲液提取的总蛋白。取10微升点样在12％聚丙烯酰胺凝胶。电泳后后经考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹法检测。
序列1(SEQ ID No.1)是水稻谷蛋白基因Gt13a的启动子序列；序列2(SEQ ID No.2)是水稻胚乳特异性表达的基本载体。
序列3(SEQ ID No.3)是人工合成的密码子偏爱的Bip的C末端的核苷酸序列序列4(SEQ ID No.4)是人工合成的密码子偏爱的PDI的C末端的核苷酸序列序列5(SEQ ID No.5)是人工合成的密码子偏爱的-IGF-1的的核苷酸序列。
序列6(SEQ ID No.6)是水稻CP启动子的PCR正向引物序列7(SEQ ID No.7)是水稻CP启动子的PCR反向引物序列8(SEQ ID No.8)是抗潮草霉素基因的PCR的正向引物序列9(SEQ ID No.9)是抗潮草霉素基因的PCR的反向引物。
具体实施例方式克隆Gt13a启动子和信号肽为了从水稻基因组序列里克隆醇溶谷蛋白的Gt13a基因的启动子与信号肽，利用序列1的引物，采用标准的多聚酶链(PCR)反应，从台北309品种的基因组DNA中扩增到了1284碱基的DNA片段，扩增的片段经限制性内切酶NaeI和XhoI消化，克隆到载体质粒pBI221中，产生了水稻胚乳细胞特异性表达的表达载体pOsPMP2，见图1，经DNA序列分析，这个DNA片段具有明显的启动子特征和信号肽的序列(SEQ ID NO.1)。
人工合成含有优化水稻遗传密码子的融合蛋白和目的基因。
从NIBC数据库获取了水稻Bip基因(基因库登记号为AAB63469)、小麦PDI基因(基因库登记号为CAI30637)和目的基因人的类胰岛素生长因子-1(基因库登记号为CAA01955)的氨基酸序列，使用DNA分析软件马克载体Mac Vector将融合蛋白基因转换成水稻遗传密码子的核苷酸序列，其优化后的融合蛋白和目的基因的脱氧核苷酸序列和遗传密码改变结果见表1，但其氨基酸序列完全相同。由美国的Blue Heron Biotechnology公司人工合成了这些重组融合蛋白和目的基因。在基因合成过程中，在基因两端加上了MylI和XhoI酶切位点，克隆到p UC119(美国Blue Heron Biotechnology克隆载体)质粒载体，产生了含有水稻密码子优化的BipC、PDIC和IGF-1基因(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)的pOsBipC、pOsPDIC和pOsPMP3质粒。
构建水稻特异性表达融合蛋白的载体。
首先，密码子优化的人类胰岛素样生长因子(human IGF-1)基因通过PCR的方法扩增，克隆到经限制性内切酶MscI和XhoI消化的pOsPMP2质粒DNA，转化E.coli宿主细胞DH10B，产生一个中间质粒pOsPMP3。pOsPMP3质粒D NA用限制性内切酶NaeI和NcoI消化，同时用适合的内切酶消化pOsPMP2(见SEQ ID NO.2)、pOsBipC和pOsPDIC质粒DNA，将融合蛋白基因与表达载体质粒pOsPMP2连接，然后转化大肠杆菌品系DH10B，产生表达载体质粒为pOsPMP25和pOsPMP26。其质粒的限制性内切酶图谱见图2和图3。
克隆水稻半胱氨酸蛋白酶β(Cysteine proteinase β)启动子。
采用PCR的方法从水稻基因组DNA克隆水稻半胱氨酸蛋白酶β基因的启动子，根据基因库的核苷酸序列设计了两个PCR引物，引物序列见SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，利用标准PCR反应，从水稻人工细菌染色体文库中，筛选到一个阳性克隆42M2(BAC克隆编号)。BAC克隆经XhoI消化后，一个5kb的片断Southern杂交证实含有半胱氨酸蛋白酶β基因的全序列，以这个BAC克隆DNA为模板，采用标准PCR反应，获得了一个1113碱基的DNA片段，将这个片段克隆到pBI221载体中，产生了一个中间载体pOsPMP04。
构建选择性标记基因载体。
以pCAMBIA-1301质粒DNA为模版，应用引物(见SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9)，用标准PCR方法，扩增出的PCR片段经SmaI和XhoI消化，然后克隆到经用限制性内切酶NaeI和XhoI消化的pOsPMP4载体上，产生了水稻特异性表达的选择性标记的载体pOsPMP5(图4)。
基因枪介导的基因转化水稻品种台北309种子，脱去谷壳后，经20％的次氯酸钠消毒20分钟，经无菌水漂洗3次，每次10分钟，然后放在愈伤组织诱导培养基上经20-30天的诱导，产生愈伤组织。将0.5微克的质粒pOsPMP25或pOsPMP26和0.5微克具有选择性标记质粒pOsPMP5的DNA，与50微升的金粉、250微升的1M氯化钙和50微升的0.1M亚精胺混合后，在室温(20-25℃)下反应30分钟，用酒精洗三次，然后按照杜邦公司的基因枪方法，将包裹有两个质粒DNA金粉，共转化到台北309愈伤组织的细胞中；在含有50微克/毫升的潮霉素B的选择培养基上经45天的筛选，继续生长的愈伤组织为抗潮霉素B的阳性愈伤组织，潮霉素B抗性的愈伤组织转移到再生培养基上，在光照下经20天左右的诱导，愈伤组织分化成绿色的小植株，然后将幼小植株转到生根培养基上，经15-20天的诱导，形成完整的植株，最后转到温室或试验田生长发育成成熟的种子。
筛选表达融合蛋白高的转基因植株。
转基因植株在温室或大田经生长与发育，然后开花结种子，形成转基因T1代种子，当T1种子收获后，每株转基因植株取10粒种子，加入10毫升的提取缓冲液(50mM Tris，pH8.0，50mM NaCl，10mM EDTA)匀浆，在离心机上每分钟14000转离心10分钟，上清液用ELISA定量药盒进行酶联免疫检测。经检测每粒种子的Bip-IGF-1融合蛋白表达水平达到150微克左右。折合成每克水稻种子含有～7.5mg重组融合蛋白，即占0.75％的种子干重。从T1种子中筛选表达融合蛋白高的转基因个体，经T1代的继续选择，形成稳定表达融合蛋白的转基因品系，供大面积生产融合蛋白之用。
从T1种子中筛选表达重组融合蛋白最高的转基因个体。为了验证高效表达融合蛋白的转基因株系，不同转基因品系的T 1代种子的粗提取液经SDS-PAGE聚丙烯凝胶电泳，考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹法检测。图五-七是转基因植株#26-13的11个单株表达融合蛋白与遗传分离的结果。泳道1-11为转基因单株，其中泳道2，4和10为遗传分离的阴性单株，泳道12为非转基因植株(阴性对照)，融合蛋白在聚丙烯凝胶中清晰可见(见图5箭头所示)，当采用IGF-1抗体检测时，在转基因胚乳可见与预测分子量相同的融合蛋白，而在非转基因台北309和遗传分离的阴性个体中缺乏融合蛋白带，表现出典型的孟德尔的遗传分离比例(见图6)；当利用水稻Bip抗体时，在台北309和分离的个体种子只有内源Bip蛋白质，而在转基因中存在内源Bip和重组Bip-IGF-1融合蛋白两条蛋白质带(见图7)。
SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120>利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达多肽的方法及应用<130>利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达多肽的方法及应用<160>9<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1223<212>DNA<213>Oryza sativa<400>1gaagaacaac tgacggtcat aaggagaggg agcttttcga taggtgccgt gcagttcaaa 60gagttagtta gcagtaggat gaagattttt gcacatggca atgagaagtt aattatggtg 120taggcaaccc aaatgaaaca ccaaaatatg cacaagacag tttgttgtat tctgtagtac 180agaataaact aaagtaatga aagaagatgg tgttagaaaa tgaaacaata ttatgagtaa 240tgtgtgagca ttatgggacc acgaaataaa aaaagaacat ttttatgagc agtgtgttct 300caatgagcct tgaatgttat cacccaggat aagaaaccct taagcaatga aacatgcaag 360cgtttaatgt gcaaagttgg cattctccac gacataatgc aaaagaagat ataatctatg 420acatagcaag tcatgcatca tttcatgcct ctgtcaacct attcatttct agtcatctag 480gtaagtatct taagctaaag tgttagaact tcccatacat aagtcataac tgatgacaat 540tgggtgtaac acatgacaaa ccagagagtc aagcaagata aagcaaaagg atgtgtacat 600aaaactacag agctatatgt catgttgcga aaagaggaga gcttataaga caagccatga 660ctcaaaaaaa attcacatgc ctactgtggc ccatatatca tgcaacaatc caaaaactca 720caggtctcgg tgttgatcgt gtcaacatgt gaccacccta aaaactcttc actaaatatt 780aaagtattgc tagaacagag cttcaagata taagtcatga tcaccaacaa ccatgttcaa 840aaagaaatag aaagctatgg cacagcaaca aaaagcaaaa gcatgcatgg atataatctt 900taacatcatc catgtcatat tgcaaaagaa agaaagagag aacaatacaa atgatgtgtc 960
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1.一种利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达多肽的方法，它包括下列步骤A、水稻特异性启动子及信号肽的获得采用水稻储藏蛋白的醇溶谷蛋白基因家簇中的Gt13a基因的启动子，为了获得Gt13a启动子和它的信号肽序列，根据基因数据库的Gt13a合成了一对核苷酸引物用于PCR扩增，为了基因克隆，在正向引物的5’端加入了一个粘性末端的内切酶位点，在反向引物的5’端加了另一个平末端的内切酶位点，从水稻品种台北309叶片中提取基因组DNA，以此DNA为模版，按照PCR程序，利用上述引物扩增出了一个1284碱基的DNA片段；B、水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建经PCR获得Gt13a启动子和信号肽的序列后，PCR产物经粘性末端内切酶与平末端的内切酶消化后，将这个片段与经同样的内切酶消化的pBI221片段连接，然后导入大肠杆菌品系DH10B，形成了含有Gt13a启动子、Gt13a信号肽和Nos终止子的水稻胚乳特异性表达的载体，这个载体质粒为pOsPMP2；C、融合蛋白和目的基因的密码子优化从基因库里获得水稻遗传密码子的水稻Bip基因C-末端、小麦PDI基因C末端和目的基因类胰岛素生长因子的氨基酸序列，使用水稻偏爱的遗传密码子，由DNA分析软件马克载体将基因的氨基酸序列转换成含有优化的水稻遗传密码子的核苷酸序列，在基因合成时，在5’和3’末端分别加上限制性内切酶MylI和XhoI，便于基因克隆；D、表达融合蛋白载体的构建首先是pOsPMP25的构建，将pOsPMP2质粒DNA用MscI和XhoI进行双酶切，然后经PCR扩增的密码子的人类胰岛素样生长因子基因片段克隆到pOsPMP2载体中，转化E.coli宿主细胞DH10B，产生一个含有IGF-1基因的中间质粒pOsPMP3，再用限制性内切酶NaeI和NcoI消化pOsPMP3质粒DNA，将PCR扩增的PDIC的DNA片段克隆到中间质粒载体，形成了水稻特异性表达的融合蛋白表达载体pOsPMP25；其次是pOsPMP26的构建用限制性内切酶NaeI和NcoI消化pOsPMP3质粒DNA，将PCR扩增的BipC DNA片段克隆到pOsPMP3质粒载体，形成了水稻种子特异性表达的融合蛋白表达载体pOsPMP26；第三是选择性标记基因载体的构建为了使选择性标记基因在水稻愈伤组织内表达，采用水稻半胱氨酸蛋白酶β基因的启动子介导选择性标记基因在愈伤组织中表达，a、合成了一对PCR引物，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，在PCR引物的两端加了HindIII和SmaI位点；b、以水稻品种台北309的基因组DNA为模版，采用标准PCR反应，扩增出一个长度为1103碱基含有启动子的片断，PCR产物经HindIII和SmaI消化后，该PCR片段与克隆载体pBI221连接，然后转化大肠杆菌品系DH10B，产生了中间质粒pOsPMP4；c、选择性标记基因采用潮霉素B磷酸转移酶基因，该基因从质粒pCAMBIA1301扩增，在正向引物，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9的5’末端加上了一个平末端限制性内切酶位点SmaI，在反向引物的5’末端加上了一个粘性末端的限制性内切酶位点XhoI，以pCAMBIA1301质粒为模版，采用PCR反应，扩增出潮霉素B磷酸转移酶基因片断，PCR产物用SmaI和XhoI消化，pOsPMP4DNA用NaeI和XhoI消化，然后将潮霉素B磷酸转移酶基因片断与CP启动子的pOsPMP4质粒经NaeI和XhoI消化的DNA片段连接，转化大肠杆菌菌系DH10B，产生了水稻组织特异性表达的选择性标记表达载体，为pOsPMP5。
2.一种介导重组蛋白在谷物胚乳中表达的启动子和信号肽，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.一种用于植物遗传转化并在谷物胚乳表达的表达载体，其具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
4.一种经水稻密码子优化的水稻Bip基因的C末端片段，其具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
5.一种经水稻密码子优化的小麦PDI基因的C末端片段，其具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
6.一种经水稻密码子优化的人的IGF-1基因，其具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
7.一种利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达IGF-1在水稻种子中的应用。
8.一种利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达IGF-1在大麦种子中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达多肽的方法及应用，首先是水稻特异性启动子及信号肽的获得；其次是水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建；第三是使用水稻偏爱密码子合成作为融合载体的水稻非储藏蛋白Bip基因C－末端和小麦PD1基因C末端以及类胰岛素生长因子－1基因；第四是表达融合蛋白载体的构建。第五是获得融合蛋白表达量达到0.3％以上种子干重的转基因水稻和大麦植株。本发明方法简单，操作方便，成本低廉，此发明可应用于在谷物胚乳中表达各种多肽。
文档编号C12N15/12GK1884517SQ20061001928
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月8日 优先权日2006年6月8日
发明者杨代常, 谢婷婷 申请人:武汉大学