专利名称：蛋白转导域4－凋亡素融合蛋白(PTD4－Apoptin)及其制法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，特别涉及生物技术药物，尤其是用于治疗肿瘤的生物技术药物。
背景技术：
肿瘤是世界上致人死亡的主要疾病，目前对肿瘤的治疗方法有手术治疗、放疗和化疗等措施，手术治疗仅对早期肿瘤有一定疗效，对晚期肿瘤则疗效不佳，放疗和化疗费用高、对人体损伤大，寻找新的安全有效的治疗肿瘤的药物和方法，是当前医药领域面临的重要课题。
来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus，CAV)的VP3蛋白(亦称凋亡素，Apoptin)因其肿瘤特异性凋亡诱导效应而引起了人们的关注。体内外研究结果均表明，VP3(本文中的VP3均指鸡贫血病毒的VP3蛋白，即CAV VP3)能诱导多种肿瘤细胞凋亡[1]，其诱导的凋亡效应为非p53依赖性[2]、不受抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL的抑制[3]。更有意义的是，VP3仅诱导具有致瘤表型细胞或转化表型细胞的凋亡，而对正常细胞无凋亡效应、无细胞毒性[4]，VP3转基因小鼠能正常生长发育[5]，这些特点表明VP3是一种极有应用前景的抗肿瘤制剂，人们为利用VP3治疗肿瘤进行了积极的探索。目前，直接导入外源性vp3基因进行基因治疗仍是人们采取的主要策略；同时，针对不同肿瘤尝试了不同策略以实现靶向性治疗[6-7]，如我们在国际上首次报道了通过受体介导的转移技术实现vp3基因体内肝细胞定向转移和表达，特异性诱导肝癌细胞凋亡，取得了良好的抑瘤效果[8-9]。但是，如何充分发挥VP3“肿瘤细胞特异性诱导肿瘤细胞凋亡”的特性，避免外源基因导入体内后可能出现的潜在风险，如过度表达等，进一步扩展VP3治疗肿瘤的应用范围，仍是亟待解决的问题。
蛋白质转导技术(protein transduction technology)是近年来新兴的一种大分子转移技术，该技术利用一些具有蛋白质转导结构域(protein transduction domain，PTD)(中文简称蛋白转导域)的蛋白质或多肽，直接将具有治疗作用的生物大分子“送”入细胞发挥生物学效应[10]。这种具有穿过细胞膜的能力的多肽称为细胞透膜肽(Cell-Penetrating Peptides，CPPs)，其长度一般不超过30个氨基酸且富含碱性氨基酸，如TAT(11肽、13肽)、Antp(16肽)、VP22(34肽)、Transportan(28肽)、MAP(18肽)。CPP可传送的物质范围很广泛，如蛋白质、DNA、抗体、显像试剂、毒素、纳米药物颗粒、脂质体等[11]。CPP传送系统既是一个很好的研究细胞内生物过程的工具，也是一个在生物药物传送方面具有潜在价值的研究对象。这一技术正成为肿瘤生物治疗的新思路——利用它可直接将治疗物导入癌细胞，使治疗作用更加可控[10]。
目前相关研究多集中在HIV-TAT(trans-activator of transcription)多肽上。TAT蛋白(86肽)是一种转录激活蛋白，1988年Green[11]和Frankel[12]各自独立发现HIV-TAT蛋白具有穿透生物膜的能力[12-13]；随后发现这一透膜能力是由47-57(或48-60)氨基酸残基之间的肽段所介导，而且TAT多肽与其他蛋白形成的融合蛋白也能透过细胞膜，并能发挥这些蛋白质的生物学功能[14-16]。Ho等人[17]利用化学合成法对TAT进行改造，通过氨基酸替换得到了一系列的TAT-PTD多肽，其中PTD4的二级结构更稳定、转导效率更高，可使目标蛋白转导成功率几乎达到100％，且单个细胞的蛋白质导入量是TAT导入量的33倍，但PTD4能否通过生物合成而实现融合蛋白的跨膜运输目前尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗肿瘤的蛋白转导域4-凋亡素融合蛋白(PTD4-Apoptin融合蛋白，或称PTD4-CAV VP3融合蛋白)，使其具有良好的穿透生物膜效应且能诱导肿瘤细胞凋亡、对肿瘤细胞具有较大杀伤力、不损伤正常细胞、不会有导入外源基因的情况发生等特点。同时，本发明还提供这种治疗肿瘤的PTD4-Apoptin融合蛋白的制备方法。
实现本发明的技术方案是制备PTD4-Apoptin融合蛋白，利用PTD4直接将Apoptin蛋白导入细胞，继而利用Apoptin特异性地诱导肿瘤细胞凋亡的特性，从而实现促进肿瘤凋亡、抑制肿瘤生长的目的。
本发明提供的蛋白转导域4-凋亡素融合蛋白具有序列表中序列6或序列7所示的氨基酸序列；本发明提供的表达蛋白转导域4-凋亡素融合蛋白的基因具有序列表中序列5所示的核苷酸序列；本发明提供的制备蛋白转导域4-凋亡素融合蛋白的方法，包括以下步骤a.构建含PTD4序列的原核表达载体pET28a-PTD4；b.构建含PTD4-Apoptin基因的原核表达载体pET28a-PTD4-Apoptin；c.PTD4-Apoptin融合蛋白的表达及纯化。
上述a.中所说的构建含PTD4序列的原核表达载体pET28a-PTD4的方法是根据组成PTD4多肽的11个氨基酸序列，按照原核生物密码子的特点设计编码PTD4多肽的两条寡核苷酸碱基序列，该编码PTD4多肽的两条寡核苷酸碱基序列具有序列表中序列2所示的核苷酸序列，合成该两条寡核苷酸片段，将该两条寡核苷酸片段等摩尔混合，95℃10min，然后室温放置1h复性，形成编码PTD4的双链DNA，将获得的编码PTD4的DNA双链插入到原核表达载体pET28a的Nhe I处。
前述b.中所说的构建含PTD4-Apoptin基因的原核表达载体pET28a-PTD4-Apoptin的方法是构建含Apoptin基因的真核表达载体pcDNA-Apoptin，以5′端分别含有限制性内切酶EcoR I和Xho I识别位点的两条PCR引物5′AGGAATTCATGAACGCTCTCCAAG-3′和5′-GCGTCGACTTACAGTCTTATACGCC-3′进行PCR扩增反应，扩增鸡贫血病毒的Apoptin基因，反应条件为循环参数为94℃5min，94℃55sec、60℃50sec、72℃55sec，循环扩增30次，72℃保温10min；将PCR扩增片段Apoptin和pET28a-PTD4重组质粒分别经EcoR I和Sal I双酶切，回收目的片段，连接、转化DH5 α，扩增提取质粒pET28a-PTD4-Apoptin。
前述c.中所说的PTD4-Apoptin融合蛋白的表达及纯化的方法是将纯化后的重组质粒pET28a-PTD4-Apoptin转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)PlysS，在5ml含0.05mg/ml卡那霉素的LB培养基中37℃震荡培养，到A600＝0.4~0.6时，加入IPTG至终浓度1.0mM诱导8小时，超声破菌，离心收集包涵体，以未诱导菌作对照，经12.5％SDS-PAGE鉴定；将包涵体溶于含8 mol/l尿素的上样缓冲液中，经镍亲和层析柱纯化，SDS-PAGE鉴定洗脱蛋白，合并含目的蛋白的洗脱液，透析、浓缩、过滤除菌，BCA法测定蛋白含量，-80℃保存。
通过蛋白转导实验证实，本发明合成的PTD4具有介导融合蛋白穿透生物膜的功能。通过TUNEL法及DAPI染色证实，本发明提供的PTD4-Apoptin融合蛋白能诱导肿瘤细胞凋亡。本发明提供的PTD4-Apoptin融合蛋白具有良好的穿透生物膜效应且能诱导肿瘤细胞凋亡，对肿瘤细胞具有极大的杀伤能力。
本发明提供的蛋白转导域4-凋亡素融合蛋白(TD4-Apoptin)可用来制备抗肿瘤药物，如用来制备抗肝癌药物，其制备方法是以PTD4-Apoptin融合蛋白为活性成分，加上制药学上可接受的载体和/或添加剂，按常规方法制备成抗肿瘤药物制剂。所述的载体可以是PBS(磷酸盐缓冲液)、甘油或尿素等。
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
图1为本发明重组质粒构建示意图；图2为重组体pET28a-PTD4鉴定结果；图3重组体pET28a-PTD4-VP3鉴定结果；图4重组体pET28a-PTD4-GFP鉴定结果；
图5PTD4-GFP、PTD4-Apoptin融合蛋白PAGE结果；图6PTD4-GFP融合蛋白的透膜效应实验的荧光显微镜观察的结果；图7PTD4-GFP融合蛋白的透膜效应实验的光学显微镜观察的结果；图8PTD4-Apoptin融合蛋白诱导HepG2细胞凋亡的激光共聚焦显微镜观察FITC激发结果；图9PTD4-Apoptin融合蛋白诱导HepG2细胞凋亡的激光共聚焦显微镜观察DAPI激发结果；图10PTD4-Apoptin融合蛋白诱导HepG2细胞凋亡的激光共聚焦显微镜观察FITC和DAPI共激发结果；图11PTD4-Apoptin融合蛋白诱导HepG2细胞凋亡的激光共聚焦显微镜光镜下结果。
具体实施例方式
实施例1构建含PTD4序列的原核表达载体pET28a-PTD41.利用人工合成的寡核苷酸片段退火法制备PTD4序列(1)根据Ho的报道[17]，PTD4多肽由11个氨基酸组成，按照原核生物密码子的特点自主设计其碱基序列如下S15′-CTAGTTATGCCCGCGCGGCAGCACGACAAGCTCGAGCCC-3′S25′-CTAGGGGCTCGAGCTTGTCGTGCTGCCGCGCGGGCATAA-3′两条寡核苷酸片段由上海生物工程公司合成。
将两条寡核苷酸片段等摩尔混合，95℃10min，然后室温放置1h复性，形成编码PTD4的双链DNA。
2.构建重组体pET28a-PTD4(1)原核表达载体pET-28a(+)购置Novagen公司。
(2)构建方法采用常规的基因克隆方法。
将上述方法获得的双链插入到pET28a的Nhe I处，转化DH5α，经酶切鉴定、PCR、测序，证明构建成pET28a-PTD4重组质粒。DNA序列测定由上海博亚完成。PCR鉴定引物为P1GGCAGCACGACAAGCTCGAGP2AACCCCTCAAGACCCGTTTAGAG，片段大小为298bpPCR扩增反应条件循环参数为95℃变性5min，94℃1min、50℃1min、72℃1min，循环扩增次数30次，最后72℃延伸10min。
3.重组质粒构建示意图见图1。
4.重组体pET28a-PTD4鉴定结果见图2，图中M1Mraker，分子量标准，从大到小依次为7000，5500，3500，2000，1000，500bpApET28a-PTD4经Nhe I酶切后结果B由步骤1所获得的PTD4片段CpET28a-PTD4 PCR结果M2Mraker，分子量标准，从大到小依次为600，500，400，300，200，100bp从图2的结果可以判断重组体pET28a-PTD4成功构建。
实施例2构建含Apoptin基因的原核表达载体pET28a-PTD4-Apoptin1.利用PCR方法扩增鸡贫血病毒的Apoptin基因(1)构建含Apoptin基因的真核表达载体pcDNA-Apoptin，构建方法参见王宇哲，田俊，屈伸等，鸡贫血病毒Apoptin基因的构建及体外凋亡诱导效应的研究，同济医科大学学报，2001，30(4)300-4。[18](2)PCR引物序列如下P55′-AGGAATTCATGAACGCTCTCCAAG-3′P65′-GCGTCGACTTACAGTCTTATACGCC-3′两条引物5′端分别含有限制性内切酶EcoR I和Xho I Sal I的识别位点。
(3)PCR扩增反应条件循环参数为94℃ 5min，94℃ 55sec、60℃ 50sec、72℃ 55sec，循环扩增30次，72℃保温10min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定无误。
2.构建含Apoptin基因的原核表达载体pET28a-PTD4-Apoptin(1)原核表达载体pET28a-PTD4的构建见步骤(一)。
(2)构建方法采用常规的基因克隆方法。
PCR扩增片段Apoptin和pET28a-PTD4重组质粒分别经经EcoR I和Sal I双酶切，回收目的片段，连接、转化DH5α，扩增提取质粒。
3.重组体鉴定结果见图3。
图3为重组体pET28a-PTD4-Apoptin鉴定结果，图中M1Marker，分子量标准，从大到小依次为7000，5500，3500，2000，1000，500bp
ApET28a-PTD4-Apoptin经EcoR I酶切BpET28a-PTD4-Apoptin经EcoR I和Sal I酶切CpcDNA-Apoptin的PCR结果M3Mraker，分子量标准，从大到小依次为1500，1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100bp从图3的结果可以判断重组体pET28a-PTD4-Apoptin成功构建。
实施例3构建含GFP基因的原核表达载体pET28a-PTD4-GFP1.利用PCR方法扩增绿色荧光蛋白的GFP基因(1)pEGFP-C1购自CLONETECH公司。
(2)PCR引物序列如下P35′-ACGGATCCATGGTGAGCAAGGGCG-3′P45′-GCGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′两条引物5′端分别含有限制性内切酶BamH I和EcoR I的识别位点。
(3)PCR扩增反应条件循环参数为94℃5min，94℃55sec、62℃55sec、72℃1min，循环扩增30次，最后72℃保温10min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小正确。
2.构建原核表达载体pET28a-PTD4-GFP(1)原核表达载体pET28a-PTD4的构建见步骤(一)。
(2)构建方法采用常规的基因克隆方法。
PCR扩增片段GFP和pET28a-PTD4重组质粒分别经BamH I和EcoR I双酶切，回收目的片断，连接、转化DH5α，扩增提取质粒。
3.重组体pET28a-PTD4-GFP鉴定结果见图4。
图4为重组体pET28a-PTD4-GFP鉴定结果，图中M1Marker，分子量标准，从大到小依次为7000，5500，3500，2000，1000，500bpA步骤1所获得的GFP片段BpET-28a-PTD4-GFP经BamH I和EcoR I酶切CpET-28a-PTD4-GFP经BamH I酶切从图4的结果可以判断重组体pET28a-PTD4-GFP成功构建。
实施例4
PTD4-Apoptin、PTD4-GFP融合蛋白的表达及纯化1.原核表达菌株E.coli BL21(DE3)PlysS购置Novagen公司；镍亲和层析柱购置Promega公司；IPTG购置BBI公司；BCA蛋白测定试剂盒购置Pierce公司。
2.融合蛋白表达过程将纯化后的二种重组质粒pET28a-PTD4-Apoptin和pET28a-PTD4-GFP分别转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)PlysS，在5ml含0.05mg/ml卡那霉素的LB培养基中37℃震荡培养，到A600＝0.4~0.6时，加入IPTG至终浓度1.0mM诱导8小时，超声破菌，离心收集包涵体，以未诱导菌作对照，经12.5％SDS-PAGE鉴定。
3.融合蛋白纯化过程将包涵体溶于含8 mol/l尿素的上样缓冲液中，经镍亲和层析柱纯化，操作步骤按试剂盒要求进行。SDS-PAGE鉴定洗脱蛋白，合并含目的蛋白的洗脱液，透析、浓缩、过滤除菌，BCA法测定蛋白含量，-80℃保存。
4.融合蛋白鉴定结果见图5图中电泳结果分别是1为纯化的PTD4-Apoptin融合蛋白2为IPTG诱导PTD4-Apoptin融合蛋白表达的细菌总蛋白；3为未诱导表达的细菌总蛋白M为蛋白质分子量标准，从大到小依次为116.0kDa，66.2kDa，45.0kDa，35.0kDa，25.0kDa，18.4kDa，14.4kDa。
4为未诱导表达的细菌总蛋白5为IPTG诱导PTD4-GFP融合蛋白表达的细菌总蛋白6为纯化的PTD4-GFP融合蛋白图5的电泳结果说明得到纯的PTD4-Apoptin、PTD4-GFP融合蛋白。
实施例5融合蛋白的体外透膜效应实验1.实验材料(1)PTD4-GFP的PBS(磷酸盐缓冲液0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4)溶液。
(2)实验细胞为人源肝癌细胞系HepG2购置CCTCC。
2.实验方法将人源肝癌细胞HepG2接种于培养板中，细胞贴壁后，用1μmol/L的融合蛋白PTD4-GFP孵育细胞，2h后吸去培养液，PBS洗三次，然后置于荧光显微镜下观察。
3.实验结果PTD4-GFP融合蛋白分别加入到体外培养的HepG2细胞中，2h后在细胞中可见明显的绿色荧光，见图6和图7，图6为PTD4-GFP融合蛋白的透膜效应实验的荧光显微镜观察的结果；图7为PTD4-GFP融合蛋白的透膜效应实验的光学显微镜观察的结果。结合图6、图7的结果，表明PTD4-GFP融合蛋白成功透过细胞膜进入HepG2细胞中，说明本发明提供的合成的PTD4具有介导融合蛋白透膜的能力。
实施例6本发明融合蛋白诱导HepG2细胞凋亡效应的实验1.实验材料(1)PTD4-Apoptin的PBS(磷酸盐缓冲液0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4)溶液。
(2)实验细胞为人源肝癌细胞系HepG2购置CCTCC。TUNEL检测试剂盒购置Promega公司。
2.实验方法将处理过的盖玻片置于六孔板内，人源肝癌细胞HepG2以合适密度接种于六孔板中，细胞贴壁后，用1μmol/L的融合蛋白PTD4-Apoptin及PTD4-GFP-Apoptin孵育细胞4-5天，PBS洗三次，4％多聚甲醛固定30min，TUNEL检测细胞凋亡(FITC染色)并用DAPI复染，操作过程按照说明书进行。置于激光共聚焦显微镜下观察。
3.实验结果融合蛋白PTD4-Apoptin与HepG2细胞孵育4-5天，TUNEL检测细胞凋亡并用DAPI复染，激光共聚焦显微镜下明显可见细胞核皱缩，边集，说明其融合蛋白能引起细胞凋亡，见图8、9、10、11。结合图8、9、10、11的结果，说明PTD4-Apoptin融合蛋白诱导HepG2细胞发生凋亡效应。
实施例7以本发明提供的PTD4-Apoptin融合蛋白为活性成分，加上PBS(磷酸盐缓冲液0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4)溶液，按常规方法制备成抗肿瘤药物制剂。
实施例8
以本发明提供的PTD4-Apoptin融合蛋白为活性成分，加上PBS溶液和10％的甘油，按常规方法制备成抗肿瘤药物制剂。
实施例9以本发明提供的PTD4-Apoptin融合蛋白为活性成分，加上一定量的尿素(如4M)，按常规方法制备成抗肿瘤药物制剂。
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序列表<110>华中科技大学<120>蛋白转导域4-凋亡素融合蛋白及其制法和应用<130>1<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>33<212>DNA<213>Human immunodeficiency virus<220>
<221>CDS<222>(1)..(33)<223>
<400>1tat gcc cgc gcg gca gca cga caa gct cga gcc 33Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala1 5 10<210>2<211>11<212>PRT<213>Human immunodeficiency virus<400>2Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala1 5 10<210>3<211>366<212>DNA<213>Chicken anemia virus<220>
<221>CDS<222>(1)..(366)<223>
<400>3atg aac gct ctc caa gaa gat act cca ccc gga cca tca acg gtg ttc48Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe1 5 10 15agg cca cca aca agt tca cgg ccg ttg gaa acc cct cac tgc aga gag96Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu20 25 30
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Arg Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu115 120<210>5<211>513<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(513)<223>
<400>5atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15cgc ggc agc cat atg gct agt tat gcc cgc gcg gca gca cga caa gct 96Arg Gly Ser His Met Ala Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala20 25 30cga gcc cct agc atg act ggt gga cag caa atg ggt cgc gga tcc gaa144Arg Ala Pro Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu35 40 45ttc atg aac gct ctc caa gaa gat act cca ccc gga cca tca acg gtg192Phe Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val50 55 60ttc agg cca cca aca agt tca cgg ccg ttg gaa acc cct cac tgc aga240Phe Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg65 70 75 80gag atc cgg att ggt atc gct gga att aca atc act cta tcg ctg tgt288Glu Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys85 90 95ggc tgc gcg aat gct cgc gct ccc acg cta aga tct gca act gcg gac336Gly Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp100 105 110aat tca gaa agc act ggt ttc aag aat gtg ccg gac ttg agg acc gat384Asn Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp115 120 125caa ccc aag cct ccc tcg aag aag cga tcc tgc gac ccc tcc gag tac432Gln Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr130 135 140agg gta agc gag cta aaa gaa agc ttg att acc act act ccc agc cga480Arg Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg145 150 155 160ccc cga acc gca aaa agg cgt ata aga ctg taa513
Pro Arg Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu165 170<210>6<211>170<212>PRT<213>人工序列<400>6Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15Arg Gly Ser His Met Ala Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala20 25 30Arg Ala Pro Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu35 40 45Phe Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val50 55 60Phe Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg65 70 75 80Glu Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys85 90 95Gly Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp100 105 110Asn Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp115 120 125Gln Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr130 135 140Arg Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg145 150 155 160Pro Arg Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu165 170<210>7<211>153<212>PRT
<213>人工序列<400>7Gly Ser His Met Ala Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg1 5 10 15Ala Pro Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Phe20 25 30Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe35 40 45Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu50 55 60Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly65 70 75 80Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn85 90 95Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln100 105 110Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg115 120 125Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser LeuIle Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro130 135140Arg Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu145 150
权利要求
1.蛋白转导域4-凋亡素融合蛋白PTD4-Apoptin，具有序列表中序列6或序列7所示的氨基酸序列。
2.表达蛋白转导域4-凋亡素融合蛋白的基因，具有序列表中序列5所示的核苷酸序列。
3.蛋白转导域4-凋亡素融合蛋白的制备方法，包括以下步骤a.构建含PTD4序列的原核表达载体pET28a-PTD4；b.构建含PTD4-Apoptin基因的原核表达载体pET28a-PTD4-Apoptin；c.PTD4-Apoptin融合蛋白的表达及纯化。
4.根据权利要求3所述的制备蛋白转导域4-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所说的构建含PTD4序列的原核表达载体pET28a-PTD4的方法是根据组成PTD4多肽的11个氨基酸序列，按照原核生物密码子的特点设计编码PTD4多肽的两条寡核苷酸碱基序列，合成该两条寡核苷酸片段，将该两条寡核苷酸片段等摩尔混合，95℃10min，然后室温放置1h复性，形成编码PTD4的双链DNA，将获得的编码PTD4的DNA双链插入到原核表达载体pET28a的Nhe I处。
5.根据权利要求4所述的制备蛋白转导域4-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所说的编码PTD4多肽的两条寡核苷酸碱基序列具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求3所述的制备蛋白转导域4-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所说的构建含PTD4-Apoptin基因的原核表达载体pET28a-PTD4-Apoptin的方法是构建含Apoptin基因的真核表达载体pcDNA-Apoptin，以5′端分别含有限制性内切酶EcoR I和Xho I识别位点的两条PCR引物5′-AGGAATTCATGAACGCTCTCCAAG-3′和5′-GCGTCGACTTACAGTCTTATACGCC-3′进行PCR扩增反应，扩增鸡贫血病毒的Apoptin基因，反应条件为循环参数为94℃5min，94℃55sec、60℃50sec、72℃55sec，循环扩增30次，72℃保温10min；将PCR扩增片段Apoptin和pET28a-PTD4重组质粒分别经EcoR I和Sal I双酶切，回收目的片段，连接、转化DH5α，扩增提取质粒pET28a-PTD4-Apoptin。
7.根据权利要求3所述的制备蛋白转导域4-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所说的PTD4-Apoptin融合蛋白的表达及纯化的方法是将纯化后的重组质粒pET28a-PTD4-Apoptin转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)PlysS，在5ml含0.05mg/ml卡那霉素的LB培养基中37℃震荡培养，到A600＝0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度1.0mM诱导8小时，超声破菌，离心收集包涵体，以未诱导菌作对照，经12.5％SDS-PAGE鉴定；将包涵体溶于含8mol/l尿素的上样缓冲液中，经镍亲和层析柱纯化，SDS-PAGE鉴定洗脱蛋白，合并含目的蛋白的洗脱液，透析、浓缩、过滤除菌，BCA法测定蛋白含量，-80℃保存。
8.含PTD4和Apoptin基因的原核表达载体pET28a-PTD4-Apoptin。
9.权利要求1所述的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求1所述的融合蛋白在制备用于治疗肝癌的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种治疗肿瘤的蛋白转导域4－凋亡素融合蛋白，其具有良好的穿透生物膜效应且能诱导肿瘤细胞凋亡，对肿瘤细胞具有较大杀伤力且不损伤正常细胞，不会发生导入外源基因的危险，本发明融合蛋白利用PTD4直接将凋亡素Apoptin蛋白导入细胞，继而利用凋亡素Apoptin特异性地诱导肿瘤细胞凋亡，从而实现促进肿瘤凋亡、抑制肿瘤生长的目的。本发明还提供了该融合蛋白的制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
文档编号C12N15/09GK101081871SQ200610019240
公开日2007年12月5日 申请日期2006年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者屈伸, 孙军, 宗义强 申请人:华中科技大学