专利名称：一次复合pcr反应同时检测马铃薯病毒和类病毒的方法
技术领域：
本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及植物病毒分子检测技术领域。利用PCR技 术， 一次反转录聚合酶链式反应(PCR)同时检测5种马铃薯(类)病毒的方法(m-RT-PCR)。 本发明还涉及到m-RT-PCR反应中引物设计方法，以及同时检测5种马铃薯病毒的反应体系参 数和程序参数。
背景技术：
病毒检测是马铃薯脱毒种薯生产的重要环节，是脱毒种薯的质量保证。目前，植物病毒检 测大多采用基于抗血清的酶联免疫吸附(ELASA),该技术检测时，每一个病毒必须制备相应 的特异抗血清，每个病毒必须独立检测，因而检测成本髙，检测程序烦琐。为了提高病毒检 测效率，近年来，基于PCR技术的病毒检测技术正在形成中(Singh and Singh, Potato virus Y detection: sensitivity of RT-PCR depends on the size of fragment amplified, 1997, Ca". /VaW 尸a,/w/. 19， 149-155; Singh,， Reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of viruses from plants and aphids， 1998， f^ro/jWisiTzocfe. 74: 125-138; Nie and Singh,, Detection of multiple potato viruses using an oligo(dT) as a common cDNA primer in multiplex RT-PCR. 2000， F/ra/她/Zzo(is， 86: 179-185; Sharman等，Development of a multiplex immunocapture PCR with colourimetric detection for viruses of banana. 2000, Mra/ A/"/20A, 75: 75-88; Kuroda等, Multiplex reverse transcription polymerase chain reaction for simultaneous detection of viruses in gentian, 2002，/ Ge". /VaW iWio/, 68: 169-172; Li and Mock,， An improved reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for the detection of two cherry flexiviruses inPrunusspp， 2005, Mro/MeAo血129: 162-169;吴志明等，应用RT-PCR法快速检测马铃薯 巻叶病毒，河北农业大学学报，23: 77-79:路平等，马铃薯巻叶病毒的RT-PCR快速检测， 2005，甘肃农业大学学报，2000， 40: 532-534)。但目前大部分报道的基于PCR检测技术， 一次反应检测的病毒种类在1~3种，仅柑桔有一例报道可以在一次反应中检测6种RNA病毒 禾口 1禾中DNA病毒(Roy等，A multiplex polymerase chain reaction method for reliable, sensitive and simultaneous detection of multiple viruses in citrus trees. ， 2005， P7/"o/Afef/iocfa. 129: 47-55)。
马铃薯中目前最好的结果是Shalaby and Mazyad (2002)和袁青等(2004)报道的在一 次PCR反应中检测3种病毒(Virus detection: PVY, PVX and PLRV multiplex-RT-PCR. recAw'ca/ WeWNo. 12;三重RT-PCR同步检测马铃薯多种病毒影响因素，微生物学通报，31: 1-4)。但 他们的报道均为PCR扩增条件的研究，还没有形成稳定的实用技术。在袁青等(2004)的报 道中，其病毒样品是根据田间表型确定而不是采用的标准毒源，而马铃薯病毒往往是几种病 毒同时侵染，根据表型很难准确确定病毒种类，因此，该报道的结果很难确定所检测的即为 目的病毒。同时，在复合PCR病毒检测中，同时检测多种病毒，需要所设计的引物的扩增条
件一致，而扩增片段又有显著差异才能在一个凝胶电泳中呈现出差异带型，因此，在PCR扩 增中，不同引物要实现相同的退火温度和扩增条件往往是十分困难的。正因为如此，在一次 检测中每增加一种病毒，在引物设计和建立扩增条件上就增加了一个级别的难度，这也是目 前所报道的复合PCR检测马铃薯病毒最多还只能检测3种病毒的原因。在中国，马铃薯主要 病毒检测病毒为马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯巻叶病毒(PLRV)、 马铃薯S病毒(PVS)和马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTV)。目前，种薯质量检测采用ELISA 技术对这些病毒进行检测，其主要步骤是，首先必须根据病毒制备不同的抗血清，抗血清的 制备与PCR引物的合成相比，其过程复杂，成本高；其次，ELISA检测由于灵敏度的关系， 不能对潜伏期的低浓度病毒进行检测，只能在生长季节取植物叶片进行，而不能对种薯(块 茎)进行直接检测，因此检测中心需要在生长季节到实地取材，再带回实验室检测，远距离 大批量取样(叶片)十分不便。利用特异引物和适当条件，PCR技术可以对单个分子进行特 异扩增，因此可以对块茎潜伏病毒进行检测，其样品取样、携带和贮藏均十分方便，从而使 大批量种薯质量检测成为可能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，针对我国马铃薯多种主要侵染病毒的一次性检测 问题，本发明包括设计具有相同退火温度、且扩增产物片段大小差异明显的不同病毒引物，建 立一种新的PCR反应体系和扩增体系，从而实现一次PCR反应同时检测4种马铃薯病毒(例 如马铃薯X病毒PVX;马铃薯Y病毒PVY;马铃薯巻叶病毒PLRV;马铃薯S病毒PVS) 和1种类病毒即马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTV)的检测效果。。
本发明通过以下技术方案实现
第一步PCR引物设计
从NCBI库中搜索目前已登记的马铃薯PVX, PVY， PLRV， PVS所有序列，根据CLUSTAL 序列分析(version 1.82)结果，应用引物设计软件(见version 5.0， premier Biosoft International) 分别设计引物。设计引物通过不断调整，直到在一次反应中可以扩增出不同病毒差异明显的
特异带。
表1_本发明中所设计的PCR引物_
引 物 序 列5'-3' 扩增片段长度(bp)
PVY(正向) TGTGATGAATGGGCTTATG
181
(反向) TCTGCAAC ATCTGAGAAA
PVS (正向) GCTGTTYaARbATGGAAATCC
275
(反向) CRTACARCCTRCACACYTT PSTV(正向) AAACTCGTGGTTCCTGTGG 341
(反向) CGGTTCCAAGGGCTAAAC
PLRV(正向) GGA AATGTC AATGGTGGT
(反向) GGGGTCCAACTCATAAGC
P VX(正向) YACTGC AGGCGC AACTCC
(反向) GTCGTTGGATTGYGCCCT
391
565
第二歩样品总RNA小量抽提
叶片样品总RNA抽提采用改良酚/SDS小量提取法将300—500mg叶片冻干粉(液氮研 磨)置入5ml离心管中，随即加入lml叶片抽提变性液(0.1M NaCl; 2% SDS 50 mM Tris-HCl， pH9;10mM EDTA)，混匀后冰上保留10min，再加入200pl苯酚和200^1氯仿，混匀后离心 5min.，上清液转入另一干净离心管中，加入50nl乙酸钠(pH4.6)和lml乙醇，混匀置于一 7tTC保留20min.后离心15min，沉淀RNA，最后RNA溶解在25^1去核酸酶的无菌水中。所 有离心均在12000rpm， 4'C下进行。
马铃薯块茎样品总RNA提取采用本申请人马铃薯实验室创建的方法目卩，将300 — 500mg 马铃薯块茎冻干粉(液氮研磨遣入5ml离心管中，随即加入lml块茎抽提变性液(4M Guanidine Hydrochloride, 4M Urea and 1.5%. Thiourea)混匀，再加入7pl巯基乙醇，lml乙醇，200pl氯 仿，5(Hxl异戊醇和乙酸钠，充分混匀后冰上保留15min， 4。C下10000rpm离心25min.， 上清液转入另一离心管中，加入等体积异戊醇，-2(TC保留lh.。 4t下8600rpm离心25min.， 弃出上清液后用500|11去核酸酶的无菌水溶解，再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : 1) 充分混匀，然后4。C下13000rpm离心20min.，上清液再转入另一离心管中加入等体积氯仿/异 戊醇(24:1)混匀，然后4。C下13000rpm再离心20min.，取上清液在另一离心管中，同时加 入100nl乙酸钠和lml异戊醇，混匀后-20'C保留15min.，再用前一次同样的条件离心，弃上 清液后用乙醇洗一次，RNA最后溶解在25pl的去核酸酶的无菌水中。
所述的叶片样品总RNA抽提变性液为0.1M NaCl; 2% SDS 50 mM Tris-HCl, pH 9; 1 OmM EDTA。所述的马铃薯块茎样品总RNA抽提变性液为4M Guanidine Hydrochloride, 4M Urea and 1.5%. Thiourea。 第三步反转录合成cDNA
cDNA合成按照如下体系完成在一个反应管中加入l]iil50pmol的随机引物，lng第二步 抽提的RNA, 8pldNTP混合物(每种核甘酸2.5mM)， 0.5plRNase抑制剂(20U)和lpl反 转录酶(AMV),混匀室温保留10min,后再在42'C下保留lh.，最后在冰上保留2min.即可用 于下一步操作。第四步复合PCR扩增
复合PCR反应体系为2pl的PCR buffer, 1.5)^1的25mM MgCl2， 2plde的2mM dNTP， 0.2pl的DNA聚合酶，1 ^第三步合成的cDNA和第一步中的病毒引物，其中PVX, PVS, PLRV 各0.3pl， PVY,PSTV各0.5^1，反应体系总体积20^d 。 PCR扩增程序为94°C 1.5min.; 94 °C 45s; 53°C 45s; 72°C lmin.; 72°C 5min， 4'C终止反应。
第五步检测结果判定
制备2c/。的琼脂糖EB胶，EB胶加入浓度为0.5ng/ml,取第四步扩增产物lOpl点样，电泳 电压设置5V/cm，电泳时间为1.5h.。电泳结束后，在凝胶仪下直接观察照相。本发明的优点 在于
本发明所检测的5种马铃薯(类)病毒是我国各马铃薯产区广泛侵染的病毒，也是我国 脱毒马铃薯种薯必须检测的病毒，因此，本发明具有广泛的实用性；其次，本发明的方法一 次检测所需的时间短，从样品RNA提取到结果检出，只需4小时，而目前所用的ELISA检 测通常需要2天；第三，ELISA检测需要不同病毒的抗血清，每个病毒单个检测，而本发明 只需目前分子生物学常用试剂，在一次反应中检测5种病毒。本发明还具有检测效率高，灵 敏性强，成本低的特点；第四，本发明可以直接对种薯(块茎)进行检测，取样方便，样品 容量大，可以实现真正意义的种薯检测，而不是种薯植株检测；第五，本方法采用样品总RNA 反转录cDNA为模板，只要样品携带病毒即可检出，勿需进行病毒RNA纯化富集。
图1.本发明操作流程图。
图2.是本发明的其中实施例的试验结果，含有标准马铃薯病毒病毒源的叶片样品，经一次复 合PCR同时检测4种病毒(PVX, PLRV， PVS, PVY)和1种类病毒(PSTV)的电泳结果图。
图3.是本发明的其中实施例的试验结果，不同海拔实地取样，抽提叶片总RNA，每一叶片 采用一次复合PCR扩增后的电泳结果图。
图中实地取样地点在中国湖北省恩施地区，图3中自上至下，M-为分子量标准；其它分 别为取自不同海拔的不同品种样品，括号中标注的是该品种的取样地海拔高度。
图4.华中农业大学试验地收获的马铃薯块茎，采用一次复合PCR扩增后的电泳结果图。
具体实施例方式
实施例l:马铃薯病毒和类病毒基本检测方法的建立
第一步引物合成
将本发明所设计的5种病毒引物序列(见表l),提交给"中国上海生工生物工程技术服 务公司"合成引物， 一般合成量为每引物10OD (可稀释体积2500p1,用于5000—8000次反应)。
第二步叶片样品总RNA小量抽提
将含有马铃薯PVY、 PVX、 PVS、 PLRV、 PSTV毒源的试管苗，在MS基本培养基附加 3%蔗糖的培养基中繁殖，待试管苗生长4周后，每一毒源分别取500mg左右叶片，独立提取 总RNA。 RNA抽提方法是500mg叶片样品立即投入液氮中研磨成粉状，然后将其置入5ml 离心管中，随即加入lml叶片变性液(如上所述)，混匀后冰上保留lOmin.,再加入200pl苯 酚和200^1氯仿，混匀后离心5min.，上清液转入另一干净离心管中，加入50|il乙酸钠(pH4.6) 和lml乙醇，混匀置于一7(TC保留201^11.后离心15min,沉淀RNA,最后RNA溶解在25^1去 核酸酶的无菌水中。所有离心均在12000rpm， 4。C下进行。 第三步反转录合成cDNA
cDNA合成按照如下体系完成在一个反应管中加入lpl50pmol的随机引物，lng第二步 抽提的RNA， 8(aldNTP混合物(每种核甘酸2.5mM)， 0.5^1 RNase抑制剂(20U)和lpl反 转录酶(AMV)，混匀室温保留10mia后再在42t:下保留lh.，最后在冰上保留2min.即可用
于下一步操作。
第四步复合PCR扩增检测
复合PCR反应体系为2^1的PCRbuffer, 1.5pl的25mMMgCl2， 2plde的2mM dNTP， 0.2^的DNA聚合酶，第三步合成的cDNA和第一步中的病毒引物，其中PVX, PVS， PLRV 各0.3ial， PVY，PSTV各0.5ial，反应体系总体积2(Hil 。 PCR扩增程序为94°C 1.5min.; 94 。C 45s; 53°C 45s; 72°C lmin.; 72°C 5min.， 4t终止反应。
第五步检测结果判定
制备2%的琼脂糖EB胶，EB浓度为0.5^ig/tnl加入，取第四步扩增产物10^1点样，5V/cm 设置电泳电压，电泳时间为1.5h.。电泳结束后，在凝胶仪下直接观察照相。
本实施例的试验结果见附图2。
实施例2:不同海拔种植的马铃薯叶片中马铃薯病毒和类病毒的检测
第一步引物合成
操作步骤同实施例1第1步。
第二步异地叶片取样
取样地点为湖北恩施，共4个不同海拔高度(IOOM、 500M、 IIOOM、 1640M)。在马铃
薯种植地选择有病毒表现症状的植株，用剪刀剪取植株顶端向下的展开叶片，取样量为5片 叶左右，每取完一个植株样品，剪刀用75%酒精消毒，再进行下一个取样。每一样品单独装 入一聚乙烯食品袋中，再投入取样盒保存带回实验室。取样盒冰袋在取样前一天置于冰箱预冷。
第三步各地叶片样品总RNA小量抽提
操作步骤同实施例l第2步。 第三步反转录合成cDNA
同实例1第3步。 第四步复合PCR扩增检测
同实例1第4步。
第五步结果检测
同实例1第5步。 本实施例的试验结果见附图3。
实施例3:马铃薯块茎中马铃薯病毒和类病毒的检测
第一步引物合成 同实施例1第1步。 第二步块茎取样
马铃薯块茎病毒检测取样地点在中国湖北省武汉市华中农业大学进行，本实验共检测了 10个品种，其中5个为温室钵载种植块茎，5个为实验地种植块茎。温室种植的5个品种取 样，采取每钵取l个块茎，实验地种植的5个品种取样方法是，每品种随机选取5株，每株 取1个块茎。块茎带回实验室后，先用自来水洗去泥土，然后用双蒸水再清洗2次，室温晾 干水分。用小刀将每个品种5个块茎切成小块混合后，取500mg用于抽提总RNA。 第二步马铃薯块茎样品总RNA小量抽提
取500mg上述马铃薯块茎样品在液氮中研磨成粉状，然后将其置入5ml离心管中，随即 加入lml变性液混匀，再加入7ial巯基乙醇，lml乙醇，20(^l氯仿，50^1异戊醇和150^1乙 酸钠，充分混匀后冰上保留15min., 4"下10000rpm离心25min.，上清液转入另一离心管中， 加入等体积异戊醇，-20°<:保留111.。 4'C下8600rpm离心25min.，弃出上清液后用500pl去核 酸酶的无菌水溶解，再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : 1)充分混匀，然后4"C下 13000rpm离心20min.，上清液再转入另一离心管中加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)混匀，然 后4。C下13000rpm再离心20min.,取上清液在另一离心管中，同时加入,1乙酸钠和lml
异戊醇，混匀后-2(TC保留15min.，再用前一次同样的条件离心，弃上清液后用乙醇洗一次， RNA最后溶解再25pl的去核酸酶的无菌水。 第三步反转录合成cDNA
同实施例1第3步。 第四步复合PCR扩增检测
同实施例1第4步。
第五步结果检测
同实施例1第5步。 本实施例的检测结果见附图4。
权利要求
1、一次复合PCR反应同时检测马铃薯病毒和类病毒的方法，其步骤包括1)依次合成马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯卷叶病毒、马铃薯X病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒的特异引物；2)抽提待测马铃薯样品的总RNA，反转录合成cDNA；3)将所述的引物置于一个PCR反应体系中，以步骤2)所述的cDNA为模板，进行PCR扩增；4)用琼脂糖EB凝胶电泳，根据检测带型判定样品是否携带所述的马铃薯病毒或类病毒。
2、 根据权利要求1所述的方法，其中马铃薯Y病毒扩增引物对如下 正向TGTGATGAATGGGCTTATG;反向TCTGCAACATCTGAGAAA; 扩增片段长度为181bp。
3、 根据权利要求1所述的方法，其中马铃薯S病毒扩增的引物对如下-正向GCTGTTYaARbATGGAAATCC;反向CRTAC ARCCTRC AC AC YTT;扩增片段长度为275bp。
4、 根据权利要求1所述的方法，其中扩增马铃薯巻叶病毒的引物对如下正向GGAAATGTCAATGGTGGT; 反向GGGGTCCAACTCATAAGC; 扩增片段长度为391bp。
5、 根据权利要求l所述的方法，其中扩增马铃薯X病毒的引物对如下 正向YACTGCAGGCGC AACTC ;反向GTCGTTGGATTGYGCCCT;扩增片段长度为565bp。
6、 根据权利要求1所述的方法，其中马铃薯纺锤块茎类病毒扩增的引物对如下 正向AAACTCGTGGTTCCTGTGG; 反向CGGTTCCAAGGGCTAAAC; 扩增片段长度为341bp。
7、 根据权利要求1所述的方法，其中所说的块茎总RNA抽提变性液为4M Guanidine Hydrochloride, 4M Urea and 1.5%. Thiourea。
8、 根据权利要求1所述的方法，其中所说的PCR反应体系为lpl的PCRbuffer, 1.5^1 的25mMMgCl2， 2plde的2mM dNTP， 0.2^il的DNA聚合酶，1^1步骤2)所述的cDNA和 权利要求2-6所述的引物，其中PVX,PVS,PLRV各0.3^， PVY， PSTV各0.5^1，反应体系总 体积20nl ;PCR扩增程序为94。C 1.5min,; 94°C 45s; 53°C 45s; 72°C lmin; 72°C 5min, 4'C终 止反应。
全文摘要
本发明属于植物病毒分子检测技术领域，具体涉及马铃薯病毒和类病毒分子检测。本发明的特征是，通过一次复合PCR，同时检测四种马铃薯病毒和一种马铃薯类病毒。本发明还公开了马铃薯病毒和类病毒的特异引物设计及其检测方法。可用于马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯S病毒(PVS)和马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTV)的特异检测，具有特异性强，检测效率高和成本低等优点。
文档编号C12Q1/70GK101096702SQ20061001948
公开日2008年1月2日 申请日期2006年6月28日 优先权日2006年6月28日
发明者M.佩蒙, 宋波涛, 俊 柳, 聂碧华, 谢从华 申请人:华中农业大学