一种农杆菌介导的培育悬铃木转基因植株的方法

专利名称：一种农杆菌介导的培育悬铃木转基因植株的方法
技术领域：
本发明属于园林树木基因工程技术领域。具体涉及一种利用农杆菌介导的培育悬铃木转基因植株的方法。
背景技术：
木本植物大多为多年生植物，相对于农作物等一、二年生草本植物而言，其一般具有生命周期长、成熟开花晚、遗传背景复杂(基因高度杂合)等特点。由此，采用常规的育种方法对其进行改良很难在短期内达到预期目的，致使木本植物遗传育种进展缓慢。近些年来，植物基因工程的开展及其在木本植物中的应用为木本植物的遗传改良带来了无限生机。
总体而言，由于木本植物自身的特点所限，其分子生物学与遗传转化研究相对于农作物等较为落后。然而，随着分子生物学研究技术的不断成熟以及植物遗传转化技术的不断完善，尤其是近年来对于木本植物遗传转化的大量研究，致使木本植物基因工程取得了飞速发展。1987年Fillatti等人利用根癌农杆菌的Ti质粒为载体将nptII基因和抗除草剂草甘磷基因aroA导入银白杨×大齿杨(P.al6-BAx P.grandidentata)无性系NC-5339中，获得完整再生植株，经Southern blot及Western杂交证明外源基因已整合到植物基因组中并得到正常表达，这是首例以树木为转化受体获得的转基因植株。随后几年里，人们义相继在苹果、核桃、李等其它木本植物遗传转化研究中取得了成功，充分证实了遗传转化技术在木本植物中应用的可行性，从而加快了木本植物基因工程研究的前进步伐。到目前为止，已在杨、柳、桉、松杉类、刺槐、枫香、桦木、榆树、金合欢、鹅掌楸、橡胶树、柑橘、苹果、葡萄、板栗、核桃、扁桃、李、杏、桃、猕猴桃、番木瓜、樱桃、柿树、荔枝、龙眼、咖啡、芒果、越橘、黑醋栗、悬钩子等40余种林木和木本果树上建立了遗传转化体系(曾黎辉，吕柳新。木本果树遗传转化研究进展。果树学报，2002，19(3)191-198；黄敏仁，饶红宇。林木基因工程。见王明庥主编。林木遗传育种学。北京，中国林业出版社，2001b，310-335；Ahuja M R.Genetic engineering of forest trees.InJain S M，Minocha S C(Eds).Molecular Biology of WoodyPlants，Volume 1.Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，Netherlands，1999，31-50)。
此外，人们在改善木本植物遗传转化条件、提高转化效率、促进外源基因在受体植物体内的高效稳定表达等方面进行了深入研究(Hand K H，Ma C-P.Strauss S H.Matrix attachment regions(MARs)enhancetransformation frequency and transgene expression in poplar.Transgenic Res，1997，6415-420；Minocha S C.Optimization of the expression of a transgene in plants.InJain S M，Minocha S C(Eds).Molecular Biology ofWoody Plants，Volume 1.Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，Netherlands，1999，1-30)，为木本植物基因工程改良的广泛应用奠定了坚实的基础。尽管如此，相对于农作物而言，木本植物基因转化技术仍在诸多方面存在较大的问题，如基因转化频率低、转基因植株再生困难、来自木本植物本身可用的目的基因少、目前获得的转基因植株中来自对有性材料的转化多、外源基因在转化植株中的表达水平低或不稳定等，因此要使木本植物基因工程改良达到实用化、商品化水平，尚需在多个方面做进一步深入研究。
迄今为止，国内外均未见到有关悬铃木转基因植株培育的报道。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过农杆菌介导的遗传转化方法获得悬铃木转基因植株的方法，为园林绿化树木悬铃木的进一步改良提供技术平台。
本发明是这样实现的一种利用农杆菌介导的培育转基因悬铃木植株的方法，其步骤包括遗传转化，用无菌的甘露醇溶液预处理过的悬铃木无菌苗叶片作为遗传转化的受体材料，通过农杆菌介导将GUS报告基因导入受体，利用卡那霉素作为选择剂对转化后的受体细胞进行筛选，通过PCR、GUS基因表达和Southern杂交检测筛选得到转基因悬铃木植株。
本发明的具体方法如下1)用无菌的甘露醇溶液预处理悬铃木的无菌苗叶片，所述的甘露醇溶液的浓度为0.4M，将悬铃木无菌苗叶片浸泡在所述的甘露醇溶液中，于100r/min下振荡6h。
2)将步骤1)的叶片用农杆菌侵染，将上述预处理的悬铃木的无菌苗叶片用刀刻伤造成伤口，置于OD600为0.6-0.8农杆菌菌液中浸泡8-10min，将侵染后的叶片依次转移至共培养、恢复、选择和生根培养基上培养，筛选获得候选转基因植株；其中所述的共培养的步骤包括，用农杆菌侵染过的叶片，接入共培养培养基中，在26±1℃黑暗条件下培养5d，所述的共培养基成分如下MS基本培养基+4.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA+100或200μmol/L乙酰丁香酮，附加蔗糖30g/L；琼脂7g/L，pH5.8-6.0。
其中所述恢复培养步骤包括，用上述共培养过的叶片，接入恢复培养基，在50-100lux光照下培养10-15d，所述的恢复培养基成分如下MS基本培养基+6.0mg/L6-BA+0.5mg/L IBA+300或400mg/L Timentin，附加蔗糖30g/L；琼脂7g/L，pH5.8-6.0。
其中所述的选择培养步骤包括，用上述恢复培养过的叶片，接入选择培养基，在1000-1500lux光照下诱导不定芽，每隔2周更换一次新鲜培养基直至不定芽分化，所述选择培养基成分如下MS+6.0mg/L6-BA+0.5mg/LIBA+300或400mg/L Timentin+20或25mg/L卡那霉素，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8-6.0。
其中所述生根培养步骤包括，将分化培养过的叶片，接入生根培养基，对抗性植株进行筛选，从而获得候选转基因抗性植株，所述生根培养基成分如下1/2MS基本培养基+0.1mg/L IBA+20或25mg/L卡那霉素，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8-6.0。
3)PCR检测候选转基因植株，具体方法如下用nptII报告基因设计引物，5’端引物5′-CCA TCG GCT GCT CTG ATG CCG CCG T-3′；3’端引物5′-AAG CGA TAG AAG GCG ATG GCT GC-3′，PCR扩增nptII基因特异DNA片段，片段长度为693bp。
4)检测GUS基因的表达将转化的外植体用无菌滤纸吸干表面液体，放入1.5ml的离心管中，加入反应缓冲液(每100ml含88.9mg X-Gluc、1ml 10％Triton-100、10g氯霉素、5ml 1M的NaH2PO4、20％的甲醇、pH调至7.5)，37℃保温过夜；然后用枪头吸出反应缓冲液，再加入75％乙醇37℃水浴浸泡1h以脱去色素；在立体显微镜下观察有无蓝色反应。同时比较不同处理的GUS反应强度。对通过2个月的选择培养，有外植体分化出的对卡那霉素表现稳定抗性的小芽进行GUS基因的染色反应。
5)提取经PCR检测呈阳性的悬铃木植株的总DNA，用限制性内切酶EcoR I酶切，将酶切过的DNA片段转移到Hybond-N+尼龙膜上，并用32P制备探针，对转好的膜进行分子杂交、洗膜、压片，筛选阳性植株。
更详细的技术方案如下1)外植体的准备选择较健壮的悬铃木无菌苗在扩繁培养基A(见表1)上培养1个月后，在不加任何激素的MS(MurashigeT，Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with to6-BAcco tissue cultures.Physiol Plant，1962，15473-497)基本培养基或者生根培养基B(见表1)上培养15天左右，然后选择最顶部三枚叶片中大小约2cm的叶片作为转化的外植体。
2)菌液的制备转化前取一小管菌液用灭菌的接种针刮拭培养皿，划线于含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，28℃倒置培养，使菌种复苏并形成单菌落，此盘作为菌种盘。从菌种盘中挑取单菌落划线涂满新的LB固体培养基，倒置培养在28℃下1～2d，使农杆菌增殖，然后用灭菌小刀将菌体收集到含AS(乙酰丁香酮)的AB液体培养基(王关林等，植物基因工程第三版，2002，科学出版社)中，180-200r/min重新悬浮菌体，待菌液OD600值达0.6-0.8后进行侵染。
3)甘露醇预处理将步骤1)中悬铃木无菌苗叶片(以下简称叶片)浸泡在灭过菌的0.4M的甘露醇溶液中，置于100r/min摇床振荡6h。
4)侵染将步骤3)中叶片置于无菌滤纸上，用手术刀片在叶背垂直主脉方向划伤3-4刀后，置于农杆菌菌液中浸泡8-10min。
5)共培养将步骤4)中叶片取出并用无菌滤纸吸去表面多余的菌液，叶背面向下接入共培养培养基D(见表1)中，26±1℃条件下黑暗(0lux)培养5d。
6)恢复培养将步骤5)中叶片转到恢复培养基E(见表1)上，置于相应的弱光条件下(50-100lux)培养10-15d。
7)选择培养将步骤6)中叶片转入选择培养基F(见表1)上，强光下(1000-1500lux)进行不定芽的诱导，此后，每隔2周换一次新鲜培养基直至不定芽分化。
8)抗性芽的筛选将步骤7)中再生出小芽的叶片从培养基中取出，切下带芽茎段，转入带有25mg/LKan+300或400mg/LTimentin扩繁培养基A(见表1)中进行抗性芽筛选。
9)抗性苗的扩繁与生根将步骤8)中经过筛选的组培苗进行继代扩繁至形成大量的组培苗，取苗高超过2cm的组培苗切下转入含卡那霉素20mg/L的生根培养基B(见表1)中进行生根培养，从而获得候选转基因抗性植株。
上述培养基按照常规报道的方法，在高压蒸汽121℃下灭菌20min备用。
10)抗性植株的PCR检测将步骤9)中抗性植株进行PCR检测，利用PCR分子鉴定技术(具体程序参见梁国栋主编，最新分子生物学实验技术，科学出版社，2001)，参照Xu等(Xu QH，Zhang XL & Nie YC(2002)Genetic diversity evaluation of cultivars(G.hirsutum L)resistant to Fusarium wilt by RAPD markers.Sci.Agricult.Sin.35272-276)报道，根据报告基因(nptII)的序列资料设计引物5’端引物5′-CCA TCG GCTGCT CTG ATG CCG CCG T-3′；3’端引物5′-AAG CGA TAG AAG GCG ATG GCT GC-3′。PCR循环反应参数94℃变性4min，然后依次在94℃变性1min，57℃复性1min，72℃延伸1min，循环35次后在72℃保温10min，最后4℃保存。取10μL扩增产物在含溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，紫外荧光下观察结果并照相。
11)PCR阳性株系的Southern杂交检测提取步骤10)中经PCR检测呈阳性的植物总DNA，取10-20μg转基因悬铃木植株DNA，根据样品数配制酶切反应混合液每个反应体系含10×Buffer 5μL，限制性内切酶EcoR I 2μL含(20u)，水28μL，混匀，分装至0.5mL的离心管中，每管35μl，加入总DNA 15μL，酶切体系为50μL，小心弹匀，瞬时离心，置于37℃水浴中过夜(12-18h)，第二天上午取3μL电泳检测酶切效果，酶切充分后加入5μL溴酚蓝缓冲液终止酶切，置于4℃，直至电泳。
用0.7％琼脂糖(Sigma公司产品)凝胶电泳，0.8-1.0V/cm电泳18-24h。将胶切成膜一样大小和形状；用0.2mol/L HCl变性10min，置于转膜台上，用0.4mol/L NaOH作为转移缓冲液，将DNA片段转移到Hybond-N+尼龙膜上，转移约24h。转好的膜用2×SSC漂洗两次，各5min；用滤纸垫夹，80℃真空烘膜2h以上；取出冷却，置于4℃冰箱保存备用。
32P探针制备、分子杂交、洗膜、压片的操作按萨姆布鲁克、拉塞尔编著的分子克隆试验指南(第三版)(2002，科学出版社)所述方法进行。
表1，列举了本发明所涉及的用于悬铃木转基因植株培育的各类培养基的配方表1本发明采用的培养基一览表

备注实验中所用培养基，均附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8-6.0本发明的积极效果是本发明是在国内外首次获得悬铃木转基因植株，为今后悬铃木等园林树木的遗传改良如利用转基因技术培育无球果悬铃木提供了新的技术平台。


图1.本发明技术路线2.是本发明应用的一个报道的质粒pCAMBIA2301的物理图谱图3.悬铃木GUS基因抗性植株的PCR检测结果图4.是本发明的实施例中PCR阳性株系的Southern杂交检测结果图5.不同浓度的卡那霉素对悬铃木无菌苗叶片再生的影响图6.不同种类和浓度的抑菌剂对悬铃木无菌苗叶片再生的影响图7.不同生理状态的叶片对于农杆菌侵染的敏感性以及对不定芽分化的影响图8.GUS瞬间表达检测图9.抗性芽的GUS稳定表达检测图10.外植体的经选择分化及抗性芽成苗图11.卡那霉素抗性芽的PCR检测叶片大小对农杆菌侵染悬铃木的影响图12.高渗处理时间及方式对瞬间表达率的影响图13.共培养时间对GUS瞬间表达率的影响图14.菌液浓度对瞬间表达率的影响图15.侵染时间对瞬间表达率的影响具体实施方式
以下实施例进一步定义本发明。根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1悬铃木转基因植株的培育方法1、转化受体材料及培养方法在中国湖北省武汉市华中农业大学校园采集悬铃木种子为诱导材料，经下胚轴诱导产生的试管苗为实验材料。试管苗增殖、生根和叶片再生培养方法参考刘国锋和包满珠(Liu G，Bao M，Adventitious shootregeneration from in vitro cultured leaves of London plane tree(Platanus acerifoliaWilld.)Plant Cell Rep，2003，21640-44)报道的方法。
除特别说明外，本发明的培养基成分如表1所示。pH值调至5.8-6.0，按常规方法灭菌。
2、转化载体材料及培养方法包含报道质粒pCAMBIA2301(见Genebank，基因登录号gi7638149，该质粒的物理图谱参见附图2)的根癌农杆菌菌株为EHA105由中国科学院植物研究所惠赠，该质粒携带GUS报告基因和nptII选择基因，其中GUS基因含有一个内含子，以确保GUS基因只在植物细胞中表达，而不在农杆菌中表达。以LB(王关林利方宏筠，1998)作培养基，分别称取蛋白胨10g、酵母浸膏5g，氯化钠10g，定容至1L，pH调至7.0-7.2，固体培养时加13g/L琼脂粉，按前述方法灭菌。
(1)菌株的活化从-70℃冰箱取出所保存的菌种，用接种环划取后直接划平板，平板为LB培养基，培养农杆菌附加卡那霉素(Kan)50mg/L。将平板放入28℃温箱，培养至单菌落产生。
(2)菌株的保存将平板放入4℃冰箱保存，每半个月活化一次。若要在一70℃下保存，则从平板上挑单菌落于附加相应100mg/L Kan的液体LB培养基中，放入恒温摇床上28℃ 150rpm/min摇菌至OD600＝1.0，在已灭菌的1.5mLEppendorf管中加入0.85mL农杆菌菌液和0.15mL甘油，放入冰箱长期保存。
3、农杆菌介导的遗传转化方法1)甘露醇预处理选择悬铃木无菌苗最顶部三片中大小约2cm的叶片浸泡在灭过菌的0.4M的甘露醇溶液中，置于100r/min振荡6h。
2)侵染将步骤1)中叶片置于无菌滤纸上，用手术刀片划伤叶片3-4刀(优选的方法是在在叶背垂直主脉方向用刀刻伤)后，置于OD600为0.6-0.8的农杆菌菌液中浸泡8-10min。
3)共培养将步骤2)中叶片取出并用无菌滤纸吸去表面多余的菌液，叶背面向下接入共培养培养基D(见表1)中，26±1℃条件下黑暗培养5d。
4)恢复培养将步骤3)中叶片转到恢复培养基E(见表1)上，置于相应的弱光条件下(50-100lux)培养10-15d。
5)选择培养将步骤4)中叶片转入选择分化培养基F(见表1)上，强光下(1000-1500lux)进行不定芽的诱导。此后，每隔2周换一次新鲜培养基。
6)抗性芽的筛选将步骤5)中再生出小芽的叶片从培养基中取出，切下带芽片段，转入带有25mg/LKan+300或400mg/L Timentin扩繁培养基A(见表1)中进行抗性芽筛选。
转化中设接种未经农杆菌侵染的叶片和经农杆菌侵染但不加选择两种处理作对照。
3、GUS基因瞬间表达的组织化学法检测共培养过的叶片，用无菌滤纸吸干表面液体后，放入1.5ml的离心管中，加入反应缓冲液(每100ml含88.9mg X-Gluc、1ml 10％Triton-100、10g氯霉素、5ml 1M的NaH2PO4、20％的甲醇、pH调至7.5)，37℃保温过夜。然后吸出反应缓冲液，加入75％乙醇37℃水浴浸泡1h脱去色素。在Nikon-AFX-II立体显微镜下观察有无蓝色反应，同时比较不同处理的GUS反应强度。每处理观测10个外植体，统计产生蓝色反应的外植体数目及每外植体上出现的蓝点(或蓝斑)数。
外植体经过选择培养后，分化出抗性芽，取1-2片幼嫩叶片或部分幼芽，放入1.5ml的离心管中，加入反应缓冲液(同上)，37℃保温过夜。然后吸出反应缓冲液，加入75％乙醇37℃水浴浸泡1h以脱去色素，观察有无蓝色反应。
以上试验均设5次重复，每次重复采用至少10片叶片，将百分数结果换算成反正弦后用ANOVA进行统计分析，最小显著性差异水平P＝0.05。
GUS基因的瞬间表达情况见图8，图8表明，部分叶片的GUS表达部位集中在叶脉处，尤其是伤口处表达较强。而悬铃木的叶片再生部位也主要是在叶片主脉伤口处出芽，因此，从GUS瞬间表达的结果看来，悬铃木再生细胞部位与转化感受态细胞部位一致。不同组合的处理，GUS表达强弱不同，染色结果显示，用0.4mol/L的甘露醇预处理6h，以OD值为0.6-0.8的菌液侵染10min，共培养5d的处理，经GUS染色后，染蓝叶片表达出的蓝斑最多、最亮(见图8-1)。
4、抗性芽的生根筛选取经过选择培养2-3个月的叶片外植体分化的抗性小芽，接入附加300mg/L Timentin和20mg/L Kan的悬铃木增殖培养基中，两个月后转入附加300mg/L Timentin和25mg/L Kan生根培养基。经过观察发现，部分假转化芽在增殖和生根的过程中开始出现叶片发黄，停止生长，直至最后变褐、死亡(见图10-6)。可见在选择培养的过程中还是会有假阳性抗性芽的出现，因此，在后期的增殖和生根过程中继续施加选择压力是非常必要的，可以筛选掉一部分假的抗性芽。
另外，和对照植株相比，抗性芽生根要晚15-20天左右，且根系没有对照粗壮，次生根也明显减少。
5、GUS基因稳定表达的组织化学检测对通过2个月的选择培养，有外植体分化出的对卡那霉素表现稳定抗性的小芽进行GUS基因的染色反应(见图9)，结果发现，抗性芽的显色部位不同，有的抗性芽整体呈现淡淡的蓝色，有的是幼叶表现出淡蓝色，而还有的在整个抗性芽上只有某个芽点出现很亮的蓝斑。
6、转基因植株的PCR检测参照Xu等(Xu QH，Zhang XL & Nie YC(2002)Genetic diversity evaluation of cultivars(G.hirsutum L.)resistant to Fusarium wilt by RAPD markers.Sci.Agricult.Sin.35272-276)报道的方法，根据报告基因(npt II)的序列资料设计引物，引物序列如下5’端引物5′-CCA TCG GCT GCT CTG ATG CCG CCG T-3′3’端引物5′-AAG CGA TAG AAG GCG ATG GCT GC-3′。
反应体系为去离子水 12.75μldNTP(2mM)2μlPrimerl(10mM)1μlPrimer2(10mM)1μlIOXBuffer2μlTaq(5U/L)0.25 μl模板DNA(20ng/μl)1μl总体积 20 μlPCR循环反应参数94℃变性4min，然后依次在94℃变性1min，57℃复性1min，72℃延伸1min，循环35次后在72℃保温10min，最后4℃保存。取10μL扩增产物在含溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，紫外荧光下观察结果并照相。
依初步建立的转化体系，对236个外植体进行转化，得到12株抗性植株，从叶片提取植物基因组DNA作为模板，以农杆菌质粒DNA作为阳性对照，以未转化的无菌苗DNA作为阴性对照，进行PCR扩增，结果如图3所示，未转化的植株基因组未出现PCR特异扩增片段，转基因的植株经PCR扩增，得到一条和预期长度大小一样的693bp的片段。对12株抗性植株进行PCR检测，其中有8株呈阳性反应(图3)。
7、转基因植株的Southern杂交检测取10-20μg转基因悬铃木植株DNA，根据样品数配制酶切反应混合液每个反应体系含10×Buffer5μL，限制性内切酶EcoRI 2μL含(20u)，水28μL，混匀，分装至0.5mL的离心管中，每管35μl，加入总DNA 15μL，酶切体系为50μL，小心弹匀，瞬时离心，置于37℃水浴中过夜(12-18h)，第二天上午取3μL电泳检测酶切效果，酶切充分后加入5μL溴酚蓝缓冲液终止酶切，置于4℃，直至电泳。
用0.7％琼脂糖(购自Sigma公司)凝胶电泳，0.8-1.0V/cm电泳18-24h。将胶切成膜一样大小和形状；用0.2mol/L HCl变性10min，置于转膜台上，用0.4mol/L NaOH作为转移缓冲液，将DNA片段转移到Hybond-N+尼龙膜上，转移约24h。转好的膜用2×SSC漂洗两次，各5min；用滤纸垫夹，80℃真空烘膜2h以上；取出冷却，置于4℃冰箱保存备用。
32P制备探针、分子杂交、洗膜、压片的操作按萨姆布鲁克、拉塞尔编著的分子克隆试验指南(第三版)(2002，科学出版社)所述方法进行。
PCR阳性的8个株系中，62.5％(5个株系)Southern杂交呈阳性，转化率为2.12％(5/236)。Southern杂交结果显示npt-II基因随机插入，拷贝数为1-2个，其中60％为单拷贝，40％为双拷贝。另外3个PCR呈阳性，但Southern杂交为阴性的株系说明GUS基因未能稳定插入悬铃木基因组中，可能在继代过程中丢失(图4)。

实施例2对比试验实施例1、卡那霉素(Kan)有效选择压力的实验以悬铃木无菌苗叶片为外植体，确定其再生时相应的卡那霉素(Kan)的选择压力。分别将划伤的悬铃木叶片接种于附加不同浓度Kan的分化培养基C(见表1)上，比较不同浓度抗生素对外植体诱导不定芽分化的抑制作用，以确定合适的筛选浓度用于遗传转化。根据预备实验结果，对悬铃木叶片外植体设0，12.5，20，25，50mg/L五种Kan浓度梯度。每15天更换一次新的培养基，60天后统计外植体的褐化率和分化率。
植物遗传转化过程中，尤其是以器官发生途径再生植株的转化系统，往往会产生较多的嵌合体或假转化体，因此，在转化苗生根时施用适当浓度的选择剂对于转基因植株的进一步筛选具有重要作用。取带3-4片叶的试管苗分别接种于添加不同浓度Kan(0，12.5，20，25，50mg/L)的生根培养基B(见表1)中，观察不同浓度的选择剂对试管苗生根及生长的影响，以确定生根时筛选转化苗的合适选择压力。每处理浓度接种5瓶，每瓶接5个外植体。2个月后，统计试管苗的生根率、平均根数及根长。
本实施例所用质粒为pCAMBIA2301，该质粒携带标记基因为nptII，被转化外植体表现为卡那霉素抗性。转化的细胞在附加一定浓度的卡那霉素的选择培养基F(见表1)上能正常生长、分化而获得再生植株。本发明将未转化的悬铃木无菌苗叶片、试管苗分别接入含不同浓度的卡那霉素的培养基中，观察并统计不同浓度的选择剂对不同外植体生长的影响，以确定不同外植体在不同选择剂中相应的选择浓度。
由表2可以看出，悬铃木的叶片对卡那霉素非常敏感。从实验的外植体中观察到悬铃木的叶片本身比较容易褐化，在没有附加卡那霉素的培养基上时，伤口处就有较高的褐化率，培养40天后，对照培养基中的叶片褐化率也达到16.0％。当叶片接种到含12.5mg/L卡那霉素的分化培养基C(见表1)时，褐化率达到24.0％，多数叶片虽然仍保持浅黄绿色，但无明显膨大，基本不形成愈伤，出芽率也仅为0.2％；当卡那霉素浓度增加到20mg/L时，已经完全抑制愈伤的形成和芽的分化，而在25mg/L以上的卡那霉素中，悬铃木的叶片多数变为黑褐色，最终死亡(见图5)。
因此本发明的选择培养基中卡那霉素的最适浓度为20mg/L。
表2不同浓度的卡那霉素(Kan)对悬铃木叶片再生的影响

注表中数据为平均值±标准误，同一列数字的右上标的英文字母表示数据间存在的显著差异(P＝0.05)。
将悬铃木的试管苗分别转入含0，12.5，20，25，50mg/L卡那霉素的生根培养基B(见表1)，由表3可以看出，在含12.5mg/L卡那霉素的生根培养基中，试管苗的生根率下降到52％；而当卡那霉素为20mg/L时，试管苗的生根能力则立即下降到12％，幼苗的生长也明显减慢；当卡那霉素为25mg/L以上时，试管苗完全不能生根。而随着Kan浓度的增加，幼苗逐渐停止生长，叶片出现黄化、褐化现象。在对悬铃木转化苗进行生根筛选时，卡那霉素优选浓度为25mg/L。
表3不同浓度的卡那霉素(Kan)对悬铃木试管苗生根的影响

注表中数据为平均值±标准误，同一列数字的右上标的英文字母表示数据间存在的显著差异(P＝0.05)。
2、不同抑菌剂敏感性实验共培养后的外植体表面及浅层组织中有大量共生的农杆菌，如不能及时有效的控制和抑制菌的生长，会严重影响外植体的生长和分化，因此必须进行脱菌培养。而不同抑菌剂对于不同植物外植体产生的影响不同。在本实施例中申请人选择了两种抑菌剂进行对比试验，从中选出最适的抑菌剂。将悬铃木无菌试管苗的叶片划伤后，分别接种于不同浓度(0，100，300，500mg/L)头孢霉素或(0，100，300，500mg/L)Timentin的分化培养基C(见表1)中，观察不同浓度的头孢霉素或Timentin对叶片不定芽诱导的影响，60天后统计其分化率。
头试验结果显示，头孢霉素对悬铃木叶片的再生具有明显的抑制作用。如表4所示，当悬铃木的叶片接种到含有不同浓度头孢霉素的培养基中时，其不定芽的分化均受到不同程度的影响。其中，100mg/L的头孢霉素便将不定芽的诱导频率由70％以上降低到55％左右，随着头孢霉素浓度的不断增加，不定芽的诱导率逐渐下降，外植体褐化也更为严重(见图6)，当头孢霉素增加到500mg/L时，叶片的分化频率只有10％左右；当悬铃木的叶片培养于含头孢霉素300mg/L以上的培养基时，其分化的不定芽丛多呈浅绿色的包含多数芽点的分化细胞团，难以直接成苗(见图6-8)。
Timentin(购自美国Glaxo SmithKline公司商品，公司地址Research Triangle Park，NC27709))是替卡西林(Ticarcillin)和克拉维酸钾的混合物，通常有效的抑菌浓度为300mg/L，从本实验结果中可以看出，当Timentin浓度到达300mg/L时，对于悬铃木叶片的再生不仅没有不良影响，还有促进作用，从表4中看到，当Timentin达到300mg/L时，分化率不仅没有下降，反而超出对照的64％。而且在附加Timentin100mg/L和300mg/L的培养基中，每片叶的出芽率都高于对照，特别是300mg/L的组合，出芽率接近对照的2倍。
因此申请人建议在悬铃木的遗传转化中不宜采用头孢霉素作为农杆菌的生长抑制剂，而Timentin不仅对于悬铃木叶片的再生无太大影响，甚至当浓度为300mg/L时还有一定促进作用。
表4不同种类不同浓度的抑菌剂对悬铃木叶片再生的影响

注表中数据为平均值±标准误，同一列数字的右上标的英文字母表示数据间存在的显著差异(P＝0.05)。3、不同叶片生理状态对农杆菌侵染的影响取不同大小(0.5，1，2，3cm)的叶片作为外植体，在相同转化条件下进行农杆菌侵染试验，经共培养、脱菌培养，观察叶片对于农杆菌侵染后的耐受力及恢复培养后再生的能力变化，脱菌培养后统计其褐化率，每15天换一次脱菌培养基，2个月后统计分化率。
用于转化的外植体除了要有高频的再生率作为转化的基础外，还应对于农杆菌、选择抗生素以及抑菌剂有一定的耐受力，以此作为转化后续培养阶段的保证。
基于前人的研究经验，本实施例所使用的悬铃木叶片的高效再生体系越幼嫩的叶片分化率越高，其中无菌苗第一枚叶片在MS+6.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA中的再生频率高达90％以上，但幼嫩叶片的耐受力通常也较低。
本实施例中将叶片分为0.5cm以下，1cm，2cm，3cm四个等级，用OD值为0.8的根癌农杆菌菌液进行的侵染试验，共培养5天后，用无菌蒸馏水洗净表面菌体，用无菌滤纸吸干，接入脱菌培养基中，实验结果表明，大小叶片耐受力的差异明显。褐化是影响转化成功的重要因素，一般情况，转化细胞仅在伤口处形成，此时如果褐化会导致转化细胞死亡，因此可以说一个伤口褐化的外植体很难产生转化细胞，所以褐化率的高低也是衡量的一个基因转化系统优劣的重要指标，从图11可以看到，小叶片对于农杆菌的耐受力明显低于其他叶片，农杆菌侵染后很快就会发黄、变褐，经过脱菌培养后褐化率高达83.3％，基本上不产生愈伤，严重影响分化率，仅为13.3％。从图7中分析可知，2cm和3cm左右的叶片，褐化率较低分别为23.3％和13.3％，而2cm的叶片分化率最高，达到60.0％，而3cm以上的叶片可能由于其木质化程度较高，叶片分化率明显降低。由此得出结论，2cm左右的叶片是最适合农杆菌转化的外植体。
4、高渗处理对GUS瞬间表达率的影响取适合侵染的同等大小和叶龄的叶片，分两种进行预处理实验，一组将取好的叶片直接浸泡于0.4mol/L灭过菌的甘露醇溶液中；另一组取下叶片时即用灭菌的手术刀在叶背划伤，再用0.4mol/L灭过菌的甘露醇溶液浸泡。将两组均置于摇床上，100r/min振荡，设置不同的处理时间(0，2，4，6，8，10，12h)；然后在相同条件下进行农杆菌侵染试验，观察侵染后叶片生活力变化，经过共培养后统计其瞬时表达率。
高渗处理被用于小麦等禾本科的植物的遗传转化中提高转化率的方法，已多次在文献中报道，但对于不同物种，不同外植体，不同转化方式的处理时间及方式也不尽相同。本实验设计两种处理方式组合，在其它条件均相同的情况下，分两组用0.4mol/L的甘露醇进行渗透处理一组为完整叶片直接浸泡，高渗预处理结束后再用无菌刀片划伤进行农杆菌菌液侵染；另一组从无菌苗上取下叶片后，立即用无菌刀片在叶背面划伤，再浸泡到甘露醇溶液中处理，处理结束后用农杆菌菌液侵染。
从实验结果中看到，未经甘露醇处理的叶片，完全检测不到GUS基因的瞬时表达，而用甘露醇处理4h以上的组合，均检测到GUS基因的瞬间表达，经过8h的处理时间，两种处理方式的瞬间表达率都达到最高，而继续延长处理时间后发现，瞬间表达率明显下降，究其原因可能是过长的高渗透压对外植体的细胞造成了不可恢复性的质壁分离，产生严重伤害(图12)。在4-8h的处理时间内，对比两种处理方式发现未经划伤的叶片其瞬间表达率均高于划伤叶片，这可能是由于悬铃木叶片本身比较薄，而且纸质化，伤口周围的细胞容易在短时间内死亡，因此，当处理几个小时后，再用农杆菌侵染，伤口处的细胞已经较难恢复生活力。在后续的培养过程中，我们还发现经过8h处理的外植体，生活力明显不如处理6h和4h的，叶片通常软化，在脱菌培养基上生长缓慢，褐化严重。综上所述，申请人认为用甘露醇进行转化前的预处理是是否成功转化悬铃木的关键因素，确定悬铃木叶片预处理的最佳时间为6h。
5、不同农杆菌菌液浓度GUS瞬间表达率的影响设置OD值分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0五种不同浓度的农杆菌菌液。在其他转化参数相同的情况下，通过比较共培养过后的叶片的生理状态以及检测到的GUS瞬间表达率，选择最适合的OD值最为侵染的最佳浓度。
植物细胞的转化首先需要一定数量的农杆菌与细胞壁的接触即贴壁，所以菌液浓度对转化频率有一定的影响。本实施例中用不同浓度的菌液在相同条件下对悬铃木的无菌苗叶片进行侵染，时间为8min，共培养时间为5天。实验结果表明，随着菌液浓度的提高，瞬间表达率略有变化，当OD值低于0.4时，瞬间表达率为0，当OD值在0.6-1.0之间时，瞬间表达率较高，且三种不同浓度之间没有明显差异。总的来说，高的菌液浓度对于瞬间表达率的提高有一定作用。但菌液浓度过高，易引起外植体叶片被农杆菌感染，经多次清洗不净，最终致死的情况。由于共培养的结果确定悬铃木必须经过4天以上的共培养才能出现GUS的瞬间表达，因此，我们认为在农杆菌介导的悬铃木遗传转化实验中，选择0.6-0.8的菌液浓度较为适宜(图13)。
6、不同侵染时间GUS瞬间表达率的影响将经过预处理的叶片用相同浓度的农杆菌菌液侵染，侵染时间设置成不同梯度，分别为2，4，6，8，10，20min。观察不同侵染时间对叶片外植体的生活力影响，统计GUS瞬间表达率。
在转化过程中，叶片在菌液中侵染时间对转化效率有一定影响，侵染时间低于6min时，瞬间表达率为0，不能实现转化目的；侵染时间超过10min时，虽然瞬间表达率也较高，但叶片褐化严重，且在后续培养过程中，经过多次清洗仍然有大量菌体包围悬铃木无菌苗叶片生长，甚至覆盖整片叶，导致外植体叶片最终死亡，严重影响外植体的分化率。因此，我们确定8-10min为适宜的侵染时间，瞬间表达率可达63.6％和70.0％，经过5d共培养后，外植体能被洗净，并且对后续培养阶段没有造成太大影响(图14)。
7、不同共培养时间对GUS瞬间表达率的影响将经过相同条件的农杆菌转化的叶片外植体，分别经过2，3，4，5，6d的共培养，进行GUS瞬间表达率的检测，统计瞬间表达率。
在本实施例中，最佳共培养时间的确定主要采用GUS基因的瞬时表达测定法，即共培养后定时测定外植体的GUS基因显色反应，统计表达率及表达面积，以表达率高，表达面积大为优。同时还要考虑到外植体的受伤害程度，以保证外植体的旺盛生长为宜。
实验结果表明，共培养低于4d，无法检测到瞬间表达率，共培养5d时，瞬间表达率即有明显提高，达到66.7％，共培养6d的瞬间表达率最高，但经过6d共培养的外植体，褐化程度提高，且菌体经过多次清洗不净，对于外植体的正常生长、分化有很大影响。综合考虑以上因素，申请人认为5d为农杆菌介导悬铃木叶片转化的最佳时间(图15)。
本说明书用到的一些化学或生物化学物质的简称如以下的缩略表所示表5本发明应用的化学或生物化学物质的缩略表

权利要求
1.一种利用农杆菌介导的培育转基因悬铃木植株的方法，其步骤包括遗传转化，其特征在于，用无菌的甘露醇溶液预处理过的悬铃木无菌苗叶片作为遗传转化的受体材料，通过农杆菌介导将GUS报告基因导入受体，利用卡那霉素作为选择剂对转化后的受体细胞进行筛选，通过PCR、GUS基因表达和Southern杂交检测筛选得到转基因悬铃木植株。
2.权利要求1所述的方法，其步骤如下1)、所述的甘露醇溶液的浓度为0.4M，将悬铃木无菌苗叶片浸泡在所述的甘露醇溶液中，于100r/min下振荡6h；2)将步骤1)的叶片用农杆菌侵染，将侵染后的叶片依次转移至共培养、恢复、选择和生根培养基上培养，筛选获得侯选转基因植株；3)、采用Southern杂交检测PCR阳性株系，获得转基因植株。
3.权利要求1或2所述的方法，其中步骤2)所述步骤包括，将预处理过的叶片用刀刻伤，置于OD600为0.6-0.8的农杆菌菌液中浸泡8-10min；将侵染过的叶片，接入共培养培养基中，在26±1℃黑暗条件下培养5d；共培养过的叶片，转入恢复培养基，在50-100lux光照下培养10-15d；再将恢复培养基培养的叶片，转入选择培养基，在1000-1500lux光照下诱导不定芽，每隔2周更换一次新鲜培养基直至不定芽分化；最后将分化培养基培养的叶片，转入生根培养基，筛选抗性植株，获得候选转基因抗性植株，所述的培养基成分如下共培养培养基MS基本培养基+4.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA+100或200μmol/L乙酰丁香酮，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8-6.0；恢复培养培养基MS基本培养基+6.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA+300或400mg/L Timentin，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8-6.0；选择培养培养基MS+6.0mg/L6-BA+0.5mg/LIBA+300或400mg/L Timentin+20或25mg/L卡那霉素，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8-6.0；生根培养培养基1/2MS基本培养基+0.1mg/L IBA+20或25mg/L卡那霉素，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8-6.0。
4.权利要求1或2所述的方法，其中步骤3)所述的步骤如下提取经PCR检测呈阳性的悬铃木植株的总DNA，用限制性内切酶EcoR I酶切，将酶切过的DNA片段转移到Hybond-N+尼龙膜上，并用32P制备探针，对转好的膜进行分子杂交、洗膜、压片，筛选阳性植株。
5.权利要求1-4任一项的方法在培育悬铃木转基因植物上的应用。
全文摘要
本发明属于植物转基因技术领域，具体地，本发明涉及园林树木悬铃木的转基因植株的培育方法。本发明公开了一种利用农杆菌介导的培育转基因悬铃木植株的方法，其步骤包括遗传转化、PCR检测、Southern杂交检测，其特征在于，通过农杆菌介导将GUS报告基因导入受体悬铃木，利用卡那霉素作为选择剂，添加到基本培养基中，对转化后的受体细胞进行筛选，通过PCR检测、GUS基因检测和Southern杂交等方法筛选得到转基因悬铃木植株。本发明为树木特别是悬铃木的基因改良提供了技术平台。
文档编号C12N15/82GK1900291SQ20061001968
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月24日 优先权日2006年7月24日
发明者包满珠, 刘国锋, 李志能, 方芳, 张俊卫 申请人:华中农业大学