专利名称：一种新型α－醇溶蛋白基因的核酸序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，特别涉及到一种新型小麦α-醇溶蛋白基因的核酸序列，以及基于该序列通过生物技术方法改良小麦品质的应用。
背景技术：
小麦储藏蛋白量大而且具有重要的经济价值。醇溶蛋白是其主要成分之一，大约占储藏蛋白的40-50％。根据在A-PAGE(酸性聚丙烯酰氨凝胶电泳)中迁移率的差异，醇溶蛋白可被分成α(最快)、β、γ和ω(最慢)4个区域，分子水平的研究显示只存在α(α和β区)、γ和ω三种类型，其中α-醇溶蛋白含量最高。目前的研究已发现二倍体、四倍体和六倍体小麦及近缘的山羊草物种中均有这种蛋白。
α-醇溶蛋白的一级结构(图1)包括一个19/20个氨基酸残基的信号肽(signalpeptide，不出现在成熟蛋白中)，接着分别是重复区(repetitive domain)，多聚谷氨酰胺区I(polyglutamine I)，特征区I(unique I)，多聚谷氨酰胺区II(polyglutamine II)，特征区II(unique II)。一些学者从重复区又分出一个包含5-14个氨基酸残基的N末端(N-terminal)。α-醇溶蛋白序列的差异主要是在于两个多聚谷氨酰胺区谷氨酰胺残基数目不同。重复区由若干重复单元组成，已有报道称重复单元是PQPQPFP和PQQPY。绝大多数α-醇溶蛋白有六个保守的半胱氨酸残基，分布在两个特征区，它们之间形成分子内二硫键；极少数α-醇溶蛋白包括奇数个半胱氨酸残基。
小麦α-醇溶蛋白的编码基因位于第6同源群染色体的短臂上(Gli-A2、Gli-B2和Gli-D2)，六倍体普通小麦中α-醇溶蛋白基因拷贝数大于100，其中大约50％是假基因，仅有一些能被转录、翻译，因此认识和利用这类重要基因有相当的难度。α-醇溶蛋白与面粉品质的关系目前争议很大，不同学者通过品质测验分别得出负相关、正相关甚至没有关系的结论。之所以有如此不同的结论，很大程度上可能是因为它组成的复杂性和品质测验时制备方法本身的局限。由于α-醇溶蛋白在种子储藏蛋白中含量较高，所以在人类摄入的总蛋白中比例很高，但其特定肽段对一些人有毒性，表现为乳糜泻。
本发明呈现的α-醇溶蛋白基因与已报道的所有基因有明显不同，是潜在的优异基因资源。本发明通过本发明人长期反复的对小麦α-醇溶蛋白编码基因的详细研究，首次成功的获得了一种新型α-醇溶蛋白基因。迄今为止，还没有相关的报道在国内外出版物上发表过。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种新型α-醇溶蛋白的编码基因序列和氨基酸序列。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下本发明以普通小麦中国春第6同源群缺体-四体材料N6BT6D总DNA为材料，根据GenBank数据库中已知α-醇溶蛋白编码基因保守片段设计引物，利用PCR技术扩增得到目的片段，并将目的片段克隆入pBluescript SK(+)载体中。获得一个新型α-醇溶蛋白基因序列，命名为Gli-cs。
一种新型α-醇溶蛋白的编码基因序列(Gli-cs)，其核酸序列如下atgaagacct ttctcatcct tgccctcgtg gcgaccaccg ccacaactgc agttagagtt 60ccagtgccac aattgcagcc acaaaatcca tctcagcaac agccacaaga gcaagttcca 120ttggtacaac aacaacaatt tccagggcag caacaacaat ttccaccaca acagccatat 180ccgcagccgc aaccatttcc atcacaacaa ccatatctgc agctgcaacc attcccgcag 240ccgcaaccat ttctgccaca actaccatat ccgcagccgc aatcatttcc accacaacaa 300ccatatccac aacagcgacc aaagtatcta caaccacaac aaccaatttc gcagcaacaa 360gcacaacaac aacaacaaca acaacaacaa ccgtcaagcc aggtctcctt ccaacagcct 420cagcagcaat atccatcaag ccaggtctcc ttccagccat cttagctaaa cccacaagct 480cagggctccg tccaacctca acaactgccc cagttcgcgg aaataaggaa cctagcgcta 540cagacgctac ctgcaatgtg caatgtctac atccctccac attgctcgac caccattgcg 600ccatttggca tcttcggtac caactga以上序列为小麦α-醇溶蛋白的编码基因序列(Gli-cs)，运用基因工程的方法可对结构进行改造，得到小麦α-醇溶蛋白的编码基因序列(Gli-cs)的衍生序列，该衍生序列包括新分离的具有与以上所述结构同样基本结构的基因序列及使用体外DNA操作技术通过碱基的置换、插入、缺失获得的该基因序列的各种变构体。
根据小麦α-醇溶蛋白的编码基因序列(Gli-cs)，得到其氨基酸序列，该序列如下MKTFLILALV ATTATTAVRV PVPQLQPQNP SQQQPQEQVP LVQQQQFPGQ QQQFPPQQPY 60PQPQPFPSQQ PYLQLQPFPQ PQPFLPQLPY PQPQSFPPQQ PYPQQRPKYL QPQQPISQQQ120AQQQQQQQQQ PSSQVSFQQP QQQYPSSQVS FQPS*LNPQA QGSVQPQQLP QFAEIRNLAL180QTLPAMCNVY IPPHCSTTIA PFGIFGTN*209“*”表示终止密码子本发明的有益效果为本发明所述的新型基因Gli-cs可以通过点突变技术将基因编码区内的提前终止密码子TAG变为CAG，利用转基因技术导入小麦，培育出满足要求的小麦品种和种质资源。同时可以构建Gli-cs的原核和酵母表达载体，通过本领域共知的研究方法将Gli-cs分别导入大肠杆菌和酵母中，然后纯化该基因编码的蛋白并将其添加到面粉中改变面团的品质指标。
本发明的测序结果表明Gli-cs是不同于已经公布的所有α-醇溶蛋白基因的新的基因类型。与其它已知基因相比，它缺少特征区I，另外可能有一个多聚谷氨酰胺区也缺失了。该序列特征显示该基因的独特之处和导致优质的潜在因素。
图1α-醇溶蛋白模式结构。信号肽，N末端，重复区，多聚谷氨酰胺区I，特征区I，多聚谷氨酰胺区II，特征区II分别表示各个结构域；S指代半胱氨酸，中间的连线表示二硫键。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例11、提取基因组DNA采用CTAB法提取基因组DNA，提取步骤①取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65℃的2×CTAB提取液(2％CTAB；1.4M NaCl，0.1 MTris-HCl，PH8.0，0.1M EDTA，PH8.0，临用前加2％β-巯基乙醇)15ml，混匀。
②65℃水浴30-45min，其间轻摇混匀冷却至室温后加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000rpm离心10min
③取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴沉淀DNA④勾出DNA，用70％酒精洗2次，无水乙醇洗一次气干DNA，溶于适量pH8.0的1×TE溶液中。加入RNA酶至终浓度100μg/μl⑤100V恒定电压下，1％琼脂糖凝胶电泳30分钟，检测DNA浓度及质量。
2、根据已知相关序列的保守区域设计了以下引物F5’GG/CTCAATACAAATCCAC/TCATG-3’R5’-TTCTCTTCTCAGTTA/GGTACCA/G-3’(“/”表示简并)3、PCR扩增反应体系如下DNA100-150ngdNTPs100μM引物P15pmol引物P25pmolTaq plus聚合酶 1U10×PCR缓冲液2.5μLMg2+1.5mMddH2O加至终体积25μLPCR反应程序(1)94℃ 4分钟(2)94℃ 45秒(3)55℃ 1分钟(4)72℃ 40秒重复(2)→(4)35次(5)72℃10分钟PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳30分钟。
4、PCR产物回收和纯化使用北京天为的回收试剂盒，所有操作均按照说明书进行。
5、连接和转化将回收产物连接到PMD-18T载体的反应体系如下PMD-18T载体1μl(约50ng)
10×连接酶缓冲液 2μlT4DNA连接酶 350U回收PCR产物 加至终反应体积20μl16℃连接10小时转化大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备①取在无抗生素平板上生长良好的单个DH5α菌落，接种于2μl LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养(220rpm)。
②取500μl活化过夜的菌液于50ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.3③将菌液倒入50ml离心管中，冰浴放置10min。
④在预冷至4℃的离心机中，4000rpm离心10min后去掉上清液，收集菌体。
⑤加入20ml冰冷的0.1M CaCl2于离心管中，均匀悬浮菌体后，冰浴中30min。
⑥4℃下，4000rpm离心10min后去掉上清液，收集菌体，加入2ml冰冷的0.1MCaCl2溶液均匀悬浮菌体后，放入冰中待用。
转化步骤如下①将连接产物加入200μl感受态细胞中，充分混匀置于冰上30min。
②42℃热击2min 30s，冰浴1min后加入预热至37℃的LB液体培养基400μl。
③37℃低速(100rpm)振荡培养40min。
④在每个含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB固体培养基平板上加200μl菌液，0.1 M IPTG 4μl和20mg/ml的X-gal 40μl均匀涂于平板上。
⑤37℃培养箱中培养16小时。
6、阳性克隆的筛选①挑取培养平板上生长良好的白色单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB固体培养基平板上划线，扩大培养(37℃培养12小时)。
②挑取扩大培养后的菌进行PCR扩增，反应体系如下DNA 少许菌体dNTPs100μM引物P15pmol
引物P25pmolTaqplus聚合酶1U10×PCR缓冲液2.5μLMg2+1.5mMddH2O加至终体积25μL③PCR反应程序同前。扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳30分钟，检测有无目的片段。
7、序列测定与比较分析随机选取阳性克隆进行测序，序列测定由北京华大完成，测序结果比较分析采用NCBI网址中的blast(http://www.ncbi.nlm.nib.gov/BLAST/)程序、MEGA3.1和DNAman 5.2.2软件进行。
序列表<110>四川农业大学<120>一种新型α-醇溶蛋白基因的核酸序列及其应用<130>061129<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>627<212>DNA<213>小麦属(Triticum L.)<400>1atgaagacct ttctcatcct tgccctcgtg gcgaccaccg ccacaactgc agttagagtt 60ccagtgccac aattgcagcc acaaaatcca tctcagcaac agccacaaga gcaagttcca120ttggtacaac aacaacaatt tccagggcag caacaacaat ttccaccaca acagccatat180ccgcagccgc aaccatttcc atcacaacaa ccatatctgc agctgcaacc attcccgcag240ccgcaaccat ttctgccaca actaccatat ccgcagccgc aatcatttcc accacaacaa300ccatatccac aacagcgacc aaagtatcta caaccacaac aaccaatttc gcagcaacaa360gcacaacaac aacaacaaca acaacaacaa ccgtcaagcc aggtctcctt ccaacagcct420cagcagcaat atccatcaag ccaggtctcc ttccagccat cttagctaaa cccacaagct480cagggctccg tccaacctca acaactgccc cagttcgcgg aaataaggaa cctagcgcta540cagacgctac ctgcaatgtg caatgtctac atccctccac attgctcgac caccattgcg600ccatttggca tcttcggtac caactga627<210>2<211>207<212>PRT<213>小麦属(Triticum L.)<400>2Met Lys Thr Phe Leu Ile Leu Ala Leu Val Ala Thr Thr Ala Thr Thr1 5 10 15Ala Val Arg Val Pro Val Pro Gln Leu Gln Pro Gln Asn Pro Ser Gln20 25 30
Gln Gln Pro Gln Glu Gln Val Pro Leu Val Gln Gln Gln Gln Phe Pro35 40 45Gly Gln Gln Gln Gln Phe Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Pro Gln50 55 60Pro Phe Pro Ser Gln Gln Pro Tyr Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln65 70 75 80Pro Gln Pro Phe Leu Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Ser Phe85 90 95Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Gln Arg Pro Lys Tyr Leu Gln Pro100 105 110Gln Gln Pro Ile Ser Gln Gln Gln Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln115 120 125Gln Gln Pro Ser Ser Gln Val Ser Phe Gln Gln Pro Gln Gln Gln Tyr130 135 140Pro Ser Ser Gln Val Ser Phe Gln Pro Ser Leu Asn Pro Gln Ala Gln145 150 155 160Gly Ser Val Gln Pro Gln Gln Leu Pro Gln Phe Ala Glu Ile Arg Asn165 170 175Leu Ala Leu Gln Thr Leu Pro Ala Met Cys Asn Val Tyr Ile Pro Pro180 185 190His Cys Ser Thr Thr Ile Ala Pro Phe Gly Ile Phe Gly Thr Asn195 200 20权利要求
1.一种新型α-醇溶蛋白基因的核酸序列，其特征在于，所述基因序列为序列表中SEQ ID No.1所示的核酸序列。
2.一种新型α-醇溶蛋白基因的氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.一种新型α-醇溶蛋白基因的核酸序列的衍生序列，其特征在于，该衍生序列为权利要求1所述的基因序列的一个或几个碱基的置换、插入或缺失获得的该基因序列的变构体。
4.一种新型α-醇溶蛋白基因的氨基酸序列的衍生序列，其特征在于，该衍生序列与权利要求3所述的一种新型α-醇溶蛋白基因的核酸序列的衍生序列相对应，为在相应蛋白质的氨基酸序列基础上经过一个或几个氨基酸的一个或几个碱基的置换、插入或缺失获得的该基因序列的变构体。
5.一种表达载体，其特征在于，它是由权利要求1或3所述的核苷酸序列与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体。
全文摘要
本发明公开了一种新型α－醇溶蛋白基因的核酸序列和氨基酸序列，分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，属于生物基因工程技术领域。该新型基因序列可以通过转基因技术导入小麦，培育出满足要求的小麦品种和种质资源。同时可以构建原核和酵母表达载体，导入大肠杆菌和酵母中进行表达，纯化该基因编码的蛋白并将其添加到面粉中，具有潜在的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK1970568SQ20061002250
公开日2007年5月30日 申请日期2006年12月14日 优先权日2006年12月14日
发明者郑有良, 祁鹏飞, 魏育明, 颜泽洪, 蒲至恩 申请人:四川农业大学