专利名称：低分子量尿激酶突变体及其表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及低分子量尿激酶突变体及其表达载体，属于生物制药领域。
背景技术：
心肌梗死、脑血栓和肺栓塞等血栓病是一种严重危害人类健康的常见病，在发达国家心脑血管疾病已成为死亡人数最多的疾病，我国每年死于心脑血管疾病的人数仅次于癌症，列第二位。尿激酶(UK)是我国最常用的溶栓药物，但目前全球还没有基因重组人尿激酶产品批准上市，我国批准上市的尿激酶产品主要是从人尿液中提取，美国FDA2002年批准上市的Abbott(雅培)公司生产的低分子量尿激酶Abbokinase，是人胎肾细胞培养产物，这些产品存在来源受限、可能污染病原体如乙肝病毒、丙肝病毒、产品的质量控制较难(常常是高分子量和低分子量UK的混合物)等不足，尤其是胎肾细胞是来自流产胎儿原代细胞，不能无限传代，来源极其有限，事实上Abbokinase虽然已批准上市，并且具有较好的溶栓效果，但在溶栓临床治疗中几乎没有Abbokinase产品可供使用。因此研制基因工程尿激酶以替代尿源或胎肾细胞培养来源的尿激酶是一种理想的选择。
尿激酶(也称双链尿激酶型纤溶酶原激活剂，tcu-PA)是尿激酶原(pro-UK，也称单链尿激酶型纤溶酶原激活剂，scu-PA)在纤溶酶、胰蛋白酶和激肽释放酶等作用下，Lys158-Ile159间的肽键断裂后形成的有激活纤溶酶原功能的酶，由于Lys158-Ile159间的肽键断裂后形成的A链和B链仍通过二硫键Cys148-Cys279连接，分子量与pro-UK相同，故称为高分子尿激酶(HMW-UK)，高分子尿激酶是由411个氨基酸组成的糖蛋白，有12对二硫键，一个N-糖基化位点(Asn302)和一个O-糖基化位点(Thr18)，具有三个蛋白结构区(1)类表皮生长因子区(EGF-like区，第5-49位氨基酸残基组成)，主要负责与uPA受体(uPAR)结合；(2)Kringle区(50-136aa)；(3)丝氨酸蛋白酶活性部位区，其中His204、Asp255和Ser356构成酶的活性中心。纤溶酶继续水解HMW-UK，在Lys135-Lys136断裂失去EGF-like区和Kringle区，成为低分子量尿激酶(LMW-UK)，或者在金属蛋白酶(metalloproteinase pump-1)的作用下，在Glu143-Leu144断裂失去EGF-like区和Kringle区，形成由HMW-UK第144-411位氨基酸残基组成的另一种LMW-UK。此外，pro-UK的Arg 156-Phe157肽键可被凝血酶水解产生由二硫键相连的双链分子，其活性只有双链UK活性的1/500，对人工合成的底物及纤溶酶原几乎没有酶催化活性。高分子量尿激酶和低分子量尿激酶，在临床治疗中溶栓效果相同(www.abbott.com)，并且在体内的半衰期也非常近似，尿激酶的糖基对其活性和半衰期影响甚小。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种低分子量尿激酶突变体。
本发明要解决的第二个问题是提供该低分子量尿激酶突变体的表达载体。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案低分子量尿激酶突变体，具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
编码具有序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列的低分子量尿激酶突变体的基因。运用本领域公知技术，可以依据所采用的表达系统而设计其偏好的编码核苷酸序列以提高表达效率，例如可采用酵母表达系统或大肠杆菌表达系统的偏好密码子等。所有能够表达序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列的编码核苷酸序列均属于对本发明的等同替换。
在本发明中，编码具有序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列的低分子量尿激酶突变体的基因为具有序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
本发明构建的低分子量尿激酶突变体缺失了高分子量pro-UK的第1-143位氨基酸残基以去除纤溶酶作用位点Lys135-Lys136和金属蛋白酶的作用位点Glu143-Leu144，并将Arg156突变为Lys以消除凝血酶酶切位点，另外将Asn302突变为Ala以去除糖基化位点。
弱化的dhfr双顺反子真核表达载体pIRES-dhfr，保藏号为CGMCC No.1623。
将二氢叶酸还原酶基因(dhfr)克隆至pIRES载体中弱化的脑心肌炎病毒(ECMV)内部核糖体进入位点(IRES)的下游，构建了含有弱化dhfr筛选标记和可用氨甲呤(MTX)加压提高表达水平的双顺反子真核表达载体pIRES-dhfr，该表达载体在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存(北京市海淀区中关村北一条13号，100080，电话010-62542758)，保藏日为2006年2月24日，保藏号为CGMCC No.1623，参据的微生物株为pIRES-dhfr/HMW-ProUK，建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli)。理论上pIRES-dhfr可用于任何蛋白的表达，根据要求，我们在保存该载体(质粒)时，将编码一种无糖基化、凝血酶抗性的高分子的尿激酶原突变体的基因(氨基酸序列和编码蛋白的核苷酸序列分别如序列SEQ ID No.3和序列SEQ ID No.4所示)利用Nhe I/Xho I双酶切插入至该载体的多克隆位点(Multiple Cloning Site，MCS)，构建了pIRES-dhfr/HMW-ProUK载体(图2(b))，并转化至大肠杆菌中保存该质粒(保藏号为CGMCC No.1623)。
表达载体CGMCC No.1623所表达的低分子量尿激酶突变体。
利用pIRES-dhfr表达载体表达了一种无糖基化、具有凝血酶抗性的低分子量尿激酶(LMW-UK)突变体(缺失尿激酶原的1-143位氨基酸，Arg156→Lys，Asn302→Ala)，具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其编码基因序列具有序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，其蛋白质一级结构示意图如图1所示，表达低分子量尿激酶的真核表达载体pIRES-dhfr/LMW-UK如图2(c)所示。
含有序列表SEQ ID No.1所示低分子量尿激酶突变体的表达载体的细胞为dhfr缺陷型CHO细胞株，转染pIRES-dhfr/LMW-UK(图2(c))载体后，将dhfr基因带入了dhfr缺陷型CHO中，因此转染了pIRES-dhfr/LMW-UK的CHO细胞将能在含MTX的DMEM/F12培养基(Hyclone)中生存，而未转染的CHO细胞在含MTX的DMEM/F12培养基无法生存，逐渐被淘汰。
含有序列表SEQ ID No.1所示低分子量尿激酶突变体的表达载体的细胞。
所述细胞为dhfr缺陷型CHO细胞株。
利用自行构建的pIRES-dhfr/LMW-UK真核表达载体，在CHO细胞中稳定高表达这种低分子量尿激酶突变体。用脂质体转染方法将表达载体pIRES-dhfr/LMW-UK转染CHO-dhfr-细胞后经过一轮氨甲碟呤(MTX)筛选，几乎所有获得的单克隆细胞株都表达LMW-UK，其中约50％为表达水平较接近(500-5000IU/106cells/d)的高表达阳性克隆。用转瓶无血清培养表达水平约为17.5μg/106cells/d的rCHO细胞系LB2-UK，收集的上清经过阳离子交换柱和凝胶过滤层析两步纯化后，获得的重组蛋白的纯度可以达到99％。用S-2444发色底物法检测，所获得的突变体双链UK比例占到98％在本研究中表达的突变体双链比例达到98％，主要以酶而非酶原的形式存在。
本发明研究结果表明经过一次单克隆筛选，获得的细胞株上清中目的蛋白的表达水平达到约3-22μg/106cells/d，并且单克隆细胞的阳性率达到95％，证明该载体具有高表达基因重组蛋白的潜力。如果不需要大量生产重组蛋白，用该载体表达蛋白可以不经过单克隆筛选培养就可快速高效获得重组蛋白满足该蛋白的性质研究的需要。此外，由于MTX加压可以扩增dhfr两翼基因，经过多轮MTX加压并提高MTX的加压筛选浓度，可以进一步提高目的基因的表达量。
本发明的优点是与天然HMW-uPA相比，凝血酶抗性无糖基化的LMW-uPA具有以下特点(1)消除凝血酶酶切位点，一可提高产品的稳定性，使产品更均一，有利于产品的质量控制，二可避免体内凝血酶对pro-UK的灭活作用。HMW-pro-UK生产的难点是其不稳定性，酶切位点多，可导致HMW-pro-UK多处内部肽键断裂而影响产品的均一性；(2)无N-糖链结构，一不影响活性，也有利于产品的均一性，并且是否糖基化，并不影响UK在体内的稳定性，非糖基化pro-UK与天然的pro-UK体内半衰期非常相似，约8-12min延长其半衰期；(3)缺失HMW-pro-UK的1-143aa，一是消除了pro-UK在体内与细胞膜上uPAR的结合，与低分子t-PA突变体rPA一样，可以提高血药浓度以提高溶栓效率；二是可能延长药物的体内半衰期，有文献报道，缺失EGF-domain的pro-UK突变体在大鼠体内的半衰期是HMW-pro-UK的3倍；(4)可提高蛋白质的比活性，减少用药量。本发明表明，LMW-UK突变体保留了HMW-UK的酶催化活性部位，其激活纤溶酶原的比活性(约160000IU/mg)较HMW-UK(约104000IU/mg)高60％，由于一般溶栓治疗给药剂量都是按照激活纤溶酶原的活性来计算，因此，临床治疗时，在给药总活性相同的情况下，可较大减少尿激酶的剂量(mg)，例如，目前尿激酶治疗心肌梗死的临床用量为150万IU/人次，如果是HMW-UK，需要的剂量为15mg，而改用LMW-UK，则只需9.4mg。分子量较小的LMW-UK不仅容易表达，并且临床剂量还可减少，非常有利于哺乳动物细胞表达的生物技术药物的产业化。
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作出的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为凝血酶抗性、无糖基化的LMW-UK突变体蛋白质一级结构示意图。
图2(a)为真核表达载体pIRES-dhfr的示意图。
图2(b)为真核表达载体pIRES-dhfr/HMW-proUK(CGMCC No.1623)的示意图。
图2(c)为真核表达载体pIRES-dhfr/LMW-UK的示意图。
图3为真核表达载体pIRES-dhfr/LMW-UK的构建过程。
图4(a)为真核表达载体pIRES-dhfr/LMW-UK经Nhe I/Xho I双酶切鉴定图，lane 1genemarker；lane 2Nhe I/Xho I双酶切。
图4(b)为插入pIRES-dhfr载体多克隆位点Nhe I/Xho I之间的凝血酶抗性、无糖基化的LMW-UK突变体基因序列。插入pIRES-dhfr载体多克隆位点Nhe I/Xho I之间的LMW-UK突变体基因序列；斜体字碱基分别Nhe I和Xho I的酶切位点；方框中碱基为Kozak序列；下划线部分为pro-UK信号肽； 阴影字部分分别是突变thrombin酶切位点和糖基化位点。
图5表达LMW-UK突变体的基因重组CHO细胞阳性克隆的筛选结果。
图6(a)为基因重组LMW-UK突变体的纯化，阳离子层析后SDS-PAGE结果。
图6(b)为基因重组LMW-UK突变体的纯化，凝胶层析后SDS-PAGE结果。
图6(c)为两步纯化后蛋白样品非还原电泳扫描结果。
图7为用S-2444法测定UK浓度的标准曲线。
具体实施例方式
试验材料及来源感受态大肠杆菌DH5α购自天为时代公司，dhfr缺陷型CHO细胞株(ATCC No.CRL9096)、dhfr基因、pro-UK基因本研究室保存(中国专利CN96119836.2)、质粒pUC19(TakaraBiotechnology Co.，产品号No.D3219)，pIRES真核表达载体购自Biosciences Clontech公司。
限制性内切酶Nhe I、Xho I、Xma I和Not I等购自NEB公司，T4DNA连接酶及高保真Taq酶Pyrobest购自宝生物工程有限公司(TaKaRa)。质粒提取、PCR产物回收及酶切产物回收试剂盒均购自Promega公司。DNA Marker购自天为时代公司。
DMEM培养基、DMEM/F12培养基及加强型小牛血清购自Hyclone公司；无血清培养基添加物为本室配制(中国专利CN200310124257.X)；G418购自Sigma公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；氨甲碟呤(MTX)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)，胸腺嘧啶(Thymidine)、嗜热杆菌蛋白酶(Thermolysin)以及发色底物S-2444均购自Sigma。尿激酶标准品(National Institute for Biological Standards and Control，英国)；酶联检测仪为Bio-Rad550；SP Sepharose Fast Flow阳离子交换介质和Sephacryl S-200凝胶过滤介质均购自Amersham Bioscience。
所有寡核苷酸的引物合成均由上海博亚生物技术公司完成。
实施例1.pIRES-dhfr真核表达载体的构建以pUC19/dhfr质粒为模板，以引物dhfr1和引物dhfr2为上下游引物，PCR扩增dhfr基因，PCR反应体系为8μL dNTP(2.5mmol/L)、0.5μL Pyrobest聚合酶、10μL ATR(1-18)模板、10μL 10×Buffer、2μL dhfr1上游引物(10μmol/L)、2μL dhfr2下游引物(10μmol/L)、67.5μL水，总反应体系为100μL，PCR反应条件94℃，2min(预变性)→[94℃，30s→60℃，60s→72℃，1min]×25循环→72℃，5min→4℃，5min。用0.8％-1％低熔点琼脂糖胶回收PCR产物(Promega，Agarose LMP)。
PCR产物回收试剂盒回收的dhfr基因用Xma I和Not I双酶切，同时pIRES载体用XmaI和Not I双酶切，在T4连接酶作用下将上述两段DNA连接成pIRES-dhfr表达载体，转化大肠杆菌DH5α，挑出的克隆经摇瓶培养，提取质粒后用引物dhfr1和dhfr2做PCR鉴定，经确认插入了dhfr基因的质粒进行基因全序列测定。测序正确的重组质粒命名为pIRES-dhfr(图2(a))。
引物dhfr15’-CTACCCGGG CCACCATGGTTCGACCGCTGAA CTG-3’引物dhfr25’-CGATGCGGCCGCTTAGCCTTTCTTCTCATAGACT-3’实施例2.低分子量尿激酶真核表达载体的构建一.方法利用定点突变技术，将天然高分子量尿激酶原分子中的Arg156突变为Lys以消除凝血酶酶切位点，另外将Asn302突变为Ala以去除糖基化位点，并将此HMW-proUK突变体基因插入pIRES-dhfr载体获得表达凝血酶抗性非糖基化的HMW-proUK突变体的载体pIRES-dhfr/HMW-proUK(CGMCC No.1623)。
为使LMW-UK分泌表达，在其编码基因的上游引入pro-UK的信号肽，具体方法是(1)PCR重叠延伸引物HMW1和引物SIG生成pro-UK信号肽序列LMWfrag1，重叠延伸PCR反应体系为2μL dNTP(2.5mmol/L)、0.125μL Pyrobest聚合酶、2.5μL 10×Buffer、寡核苷酸片段HMW1和SIG各5μL(5μmol/L)、纯净水10.375μL，总反应体系为25μL。PCR反应条件94℃，预变性2min→[94℃，30s→60℃，30s→72℃，50s]×20循环→72℃，5min→4℃，5min；(2)以pIRES-dhfr/HMW-proUK载体(CGMCC No.1623)为模板，以引物LMW1和引物HMW6做上下游引物PCR扩增编码144-411aa LMW-UK的基因LMWfrag2，PCR反应条件94℃，2min(预变性)→[94℃，30s→60℃，60s→72℃，1min]×25循环→72℃，5min→4℃，5min。用0.8％-1％低熔点琼脂糖胶回收PCR产物(Promega，Agarose LMP)；(3)将LMWfrag1和LMWfrag2重叠延伸，重叠延伸PCR反应体系为2μL dNTP(2.5mmol/L)、0.125μL Pyrobest聚合酶、2.5μL 10×Buffer、寡核苷酸片段LMWfrag1和LMWfrag2各5μL(5μmol/L)、纯净水10.375μL，总反应体系为25μL。PCR反应条件94℃，预变性2min→[94℃，30s→60℃，30s→72℃，50s]×20循环→72℃，5min→4℃，5min；并以此重叠延伸产物为模板，以引物HMW1和引物HMW6做上下游引物，PCR扩增基因，回收获得含有分泌信号肽、Kozak序列，以及Nhe I(位于基因上游)和Xho I(位于基因下游)酶切位点的LMW-UK突变体基因。(4)Nhe I和Xho I分别双酶切回收的LMW-UK突变体基因(SEQ ID No.2)和pIRES-dhfr载体，并在T4连接酶作用下将上述两段DNA连接成pIRES-dhfr/LMW-UK表达载体，转化大肠杆菌、提取质粒Nhe I/Xho I酶切鉴定(图4(a))，并送博亚公司测序。
引物HMW15’-TGCGCTAGCCCACCATGAGAGCCCTGCTG GCGCGCCTGCTTCTCTGCGTCCTGG-3’引物SIG5’-GCCTTTGGAGTCGCTCACGACCAGGACGCAGAGAAGCA GG-3’引物LMW15’-TCGTGAGCGACTCCAAAGGCTTAAAATTTCAGTGTGGCCAAAAG-3’引物HMW65’-CTACTCGAGTCAGAGGGCCAGGCCATTCTCTTC-3’二.结果我们构建的表达LMW-UK突变体的载体pIRES-dhfr/LMW-UK，含有G418(Neor基因)和MTX(dhfr基因)双重筛选标记(图2(c))，该载体利用弱化的IRES连接目的基因和筛选/扩增标记基因dhfr基因，使两段基因共用一个启动子，一个启动子下的两段基因同时得到翻译，并能通过提高MTX浓度加压以提高目的蛋白的表达水平。载体构建过程见图3，在pIRES-dhfr载体的多克隆位点A(MCS A)插入LMW-UK突变体基因，载体经Nhe I/XhoI双酶切鉴定(图4(a))，可见大小为900bp和6700bp处有明显条带，分别与LMW-UK突变体基因和插入了dhfr基因的pIRES-dhfr载体的大小一致，表明目的基因LMW-UK正确插入了pIRES-dhfr真核表达载体中。
用含编码人天然pro-UK基因的载体为模板，利用PCR方法定点突变了pro-UK中的凝血酶酶切位点和糖基化位点，即将Arg156(CGC)突变为Lys156(AAG)，Asn302(AAT)→Ala302(GCT)，并将HMW-proUK突变体基因克隆至pIRES-dhfr表达载体连接成pIRES-dhfr/HMW-proUK(图2(b))，转化大肠杆菌、提取质粒测序结果证明，HMW-proUK突变体基因的序列与设计的基因完全一致，pIRES-dhfr载体连同HMW-pro-UK突变体基因组成的pIRES-dhfr/HMW-proUK载体已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存(CGMCC No.1623)。HMW-pro-UK突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其编码基因序列具有序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
以pIRES-dhfr/HMW-proUK为模板，利用PCR方法扩增编码pro-UK第144-411aa的基因(即LMW-UK基因)，并在其上游连接pro-UK的信号肽，Nhe I/Xho I双酶切LMW-UK突变体基因并与pIRES-dhfr表达载体连接成pIRES-dhfr/LMW-UK。测序表明插入pIRES-dhfr载体中Nhe I/Xho I之间的LMW-UK基因与预期的完全一致(图4(b))，该基因含有酶切位点(斜体)、Kozak序列(方框中)、pro-UK信号肽序列(双划线)以及编码凝血酶抗性、无糖基化的LMW-UK突变体基因，其蛋白质一级结构如图1所示，虚圆框中的20个氨基酸(aa)残基为信号肽，在翻译后被切除，成熟的LMW-UK突变体由268aa组成，其中Arg13突变为Lys，消除了凝血酶的酶切位点，而Asn159被Ala取代消除了糖基化位点(图1中阴影部分)。该LMW-UK突变体的分子量约为31kD。
实施例3.脂质体转染与细胞培养一.方法采用LipofectamineTM2000阳离子脂质体转染试剂盒，按照试剂盒说明书操作。转染的CHO-dhfr-细胞培养于5％CO2、37℃温箱。转染12h后，换含10％加强型小牛血清的DMEM/F12培养基。48h后，采用含3％小牛血清、200nmol/L MTX(Sigma)的DMEM筛选培养基加压筛选，每2d换液一次，加压约10d后，将MTX的浓度提高至1000nmol/L，继续加压培养7-10d。之后，用含5％加强型小牛血清的DMEM/F12培养基(Hyclone)继续培养，待长出MTX抗性的细胞克隆后用0.25％的胰酶消化，用有限稀释法在96孔微孔细胞培养板(NUNC公司)中进行单克隆化培养，2周后出现细胞克隆。取细胞培养上清用改进的琼脂糖-纤维蛋白-平板法(高丽华，于芳，肖成祖.尿激酶原测定方法的改进及对GL-11G工程细胞表达尿激酶原水平稳定性观察.生物技术，1999，9(4)42)测定上清中的UK活性，以筛选表达水平较高的细胞系。
选择表达水平最高的基因重组CHO工程细胞系LMWUK-LB2于1000mL转瓶中先用含2％小牛血清的DMEM/F12培养基培养，培养温度为37℃，待细胞长满瓶壁时(约3天)，换为无血清培养基(中国专利CN200310124257.X)，隔天收液，可连续收液3-4次(培养方法请参考高丽华，胡显文，陈薇等.炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白在CHO细胞中的表达.生物工程学报，2005，21(5)826)，收集上清纯化目的蛋白。
二.结果真核表达载体pIRES-dhfr/LMW-UK用LipofectamineTM2000阳离子脂质体转染CHO-dhfr-细胞后，用MTX加压筛选，将不表达或低表达二氢叶酸还原酶的细胞淘汰，MTX的浓度从100nmol/L逐渐提高至1000nmol/L，经过一轮约20d的MTX加压筛选后，出现分散的细胞抗性克隆，将抗性克隆消化并稀释细胞接种到96孔微孔细胞培养板中，进行单克隆培养。培养2周后出现由一个细胞扩增形成的细胞集落，收集培养上清用纤溶板法测定UK活性(图5)。实验结果表明，用弱化的IRES序列将目的基因LMW-UK和筛选标志基因dhfr连接，二者共用一个启动子，筛选得到的24株单克隆细胞全部为阳性克隆，而约有50％左右的细胞克隆表达水平比较接近，在500-3500IU/106cells/d左右，按LMW-UK的比活性约为160000IU/mg计算，这些细胞的表达水平约3-22μg/106cells/d。经过一轮MTX加压筛选，就能获得表达水平大于20μg/106cells/d高表达rCHO细胞系，说明该载体具有较好的表达重组蛋白质的特性。
实施例4.重组蛋白的纯化一.方法rCHO细胞系LMWUK-LB2的无血清培养上清用HCl调节pH至5.8-6.0，经0.45μm的膜过滤后，用SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱纯化，平衡缓冲液为pH6.0、0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS)，洗脱缓冲液为pH＝7.0，0.5mol/LNaCl，0.01mol/L PBS，洗脱蛋白经聚乙二醇(PEG)浓缩至10ml，经0.45μm的膜过滤后，上Sephacryl S-200凝胶色谱，上样及洗脱缓冲液均为pH＝7.0，0.4mol/L NaCl，，0.05mol/L PBS，纯化产物的纯度用SDS-PAGE电泳胶薄层扫描确定，Lowry’s法测定蛋白浓度。
二.结果图6(a)为用阳离子层析法纯化细胞培养上清的结果，SDS-PAGE结果显示，除目的蛋白外，尚存在较多的杂蛋白。图6(b)为经凝胶过滤第二步纯化后的SDS-PAGE结果，所有杂蛋白均被去除，电泳结果经薄层扫描证明，经过两步纯化后样品的纯度可以达到99.10％(图6(c))，其分子量约31kD，与理论值一致。两步纯化的LMW-UK突变体回收率约50％。
实施例5.生物活性检验一.方法采用发色底物酶水解法(S-2444法)定量分析提纯蛋白以及培养上清中低分子量UK突变体的总活性及其单双链酶原的比例，实验方法见参考文献(胡显文，高丽华，李世崇等.发色底物法定量测定重组u-PA产品的总活性和单链比例.军事医学科学院院刊，2003，27(5)349)。
二.结果发色底物S-2444(pGlu-Gly-Arg-pNA)(Sigma公司产品)是UK的特异性底物，在UK催化作用下可水解生成对硝基苯胺(pNA)而产生淡黄色，在底物过量的情况下，一定浓度范围内尿激酶的活性与在405nm处测得的吸光度OD值的变化率成正比。而单链尿激酶原没有酶催化活性，不能催化水解S-2444生成对硝基苯胺。嗜热杆菌金属蛋白酶(thermolysin，Sigma公司产品)可激活单链pro-UK转变为双链UK，通过比较激活与非激活条件下蛋白产物水解S-2444的活性，可以测定u-PA中单链比例及总活性。用S-2444法的测定UK活性的标准曲线为(图7)y＝0.0002539x+0.0005857，相关系数R2＝0.9967，式中y＝d(OD405nm)/dt，即显色速率(ΔOD405nm/min)，x为样品中UK浓度(IU/ml)。
用S-2444法测定了纯度大于99％的LMW-UK突变体的比活性及单链酶原的比例，并测定了rCHO细胞系LMWUK-LB2的表达水平(表1)，结果表明，蛋白浓度为1.021mg/ml(Lowry’s法)LMW-proUK突变体在thermolysin激活后，其活性为162200IU/ml，计算得到其比活性为158864IU/mg，天然HMW-UK，其蛋白质分子量为46368.2，比活性为104000IU/ml，本发明构建的LMW-UK突变体蛋白质分子量为30185.5，理论上其比活性为159753IU/mg，实测得到的结果与理论值相当，表明突变UK的糖基化位点基本不影响其纤溶活性。值得注意的是，该突变体非激活和激活条件下的活性非常接近，单链酶原的比例只有1.8％，我们得到的LMW-uPA大部分为有活性的酶，这也是命名该LMW-uPA突变体为LMW-UK突变体的原因。
由于编码LMW-uPA突变体的基因在翻译时蛋白质应该是单链酶原，即Lys15-Ile16之间的肽键应没有断裂，但纯化得到的蛋白表明，该突变体Lys15-Ile16之间的肽键已断裂，转化成有催化活性的双链UK，为确认Lys15-Ile16肽键断裂的原因是由于细胞培养还是在纯化过程中条件不当造成的，测定了细胞培养上清中LMW-uPA的单链比例，为尽量减少细胞死亡释放某些内源性蛋白酶对产物降解的影响，缩短分泌至上清中的LMW-uPA在37℃环境中的停留时间以减少其转化成双链的可能，测定时保持方瓶中培养的LB2细胞的密度较低(0.79×106cells/ml)以保持细胞活力，并在1天内取出培养上清，结果表明，细胞培养上清中LMW-uPA在激活和非激活条件下测定的活性也非常接近(表1)，与纯化得到的纯品LMW-UK一样，单链酶原的比例也只有1.8％左右，提示该突变体翻译后在细胞内或分泌到胞外很快就断裂Lys15-Ile16肽键，转化为双链酶的形式(低分子量尿激酶)。从LB2细胞系培养上清的活性推测，该细胞系的表达水平约为17.5μg/106细胞/天。
表1 S-2444法测定LMW-UK突变体生物学活性
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120>低分子量尿激酶突变体及其表达载体<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>288<212>PRT<213>人属，人种<220>
<221>信号肽<222>(1)..(20)<400>1Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser1 5 10 15Asp Ser Lys Gly Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro20 2530Lys Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro35 40 45Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr50 55 60Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr65 7075 80
His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu85 90 95Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu100 105 110Val Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala115 120 125His His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg130 135 140Cys Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met145 150 155 160Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly165 170 175Lys Glu Ala Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr180 185 190Val Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr195 200 205Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp210 215 220Lys Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser225230 235 240Leu Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly245 250 255Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe260 265 270Leu Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu275 280 285<210>2<211>867
<212>DNA<213>人属，人种<220>
<221>信号肽编码序列<222>(1)..(60)<400>2atgagagccc tgctggcgcg cctgcttctc tgcgtcctgg tcgtgagcga ctccaaaggc 60ttaaaatttc agtgtggcca aaagactctg aggcccaagt ttaagattat tgggggagaa 120ttcaccacca tcgagaacca gccctggttt gcggccatct acaggaggca ccgggggggc 180tctgtcacct acgtgtgtgg aggcagcctc atcagccctt gctgggtgat cagcgccaca 240cactgcttca ttgattaccc aaagaaggag gactacatcg tctacctggg tcgctcaagg 300cttaactcca acacgcaagg ggagatgaag tttgaggtgg aaaacctcat cctacacaag 360gactacagcg ctgacacgct tgctcaccac aacgacattg ccttgctgaa gatccgttcc 420aaggagggca ggtgtgcgca gccatcccgg actatacaga ccatctgcct gccctcgatg 480tataacgatc cccagtttgg cacaagctgc gagatcactg gctttggaaa agaggcttct 540accgactatc tctatccgga gcagctgaaa atgactgttg tgaagctgat ttcccaccgg 600gagtgtcagc agccccacta ctacggctct gaagtcacca ccaaaatgct gtgtgctgct 660gacccacagt ggaaaacaga ttcctgccag ggagactcag ggggacccct cgtctgttcc 720ctccaaggcc gcatgacttt tgactggaat gtgagctggg gccgtggatg tgccctgaag 780gacaagccag gcgtctacac gagagtctca cacttcttac cctggatccg cagtcacacc 840aaggaagaga atggcctggc cctctga 867<210>3<211>431<212>PRT<213>人属，人种
<220>
<221>信号肽<222>(1)..(20)<400>3Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser1 5 1015Asp Ser Lys Gly Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp20 25 30Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile35 40 45His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile5055 60Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly65 70 7580Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser85 9095Ala Thr Val Leu Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu100105110Gln Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg115120125Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln130 135 140Glu Cys Met Val His Asp Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro145 150 155160Pro Glu Glu Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Lys165170175Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp180185190
Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val195200 205Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His210 215 220Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly225230235 240Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val245250255Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His260 265270His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys275 280285Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr290 295 300Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys305 310 315 320Glu Ala Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val325 330 335Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly340345350Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys355360365Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu370375380Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys385390395400Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu405 410415Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu420425430
<210>4<211>1296<212>DNA<213>人属，人种<220>
<221>信号肽编码序列<222>(1)..(60)<400>4atgagagccc tgctggcgcg cctgcttctc tgcgtcctgg tcgtgagcga ctccaaaggc60agcaatgaac ttcatcaagt tccatcgaac tgtgactgtc taaatggagg aacatgtgtg 120tccaacaagt acttctccaa cattcactgg tgcaagtgcc caaagaaatt cggagggcag 180cactgtgaaa tagataagtc aaaaacctgc tatgagggga atggtcactt ttaccgagga 240aaggccagca ctgacaccat gggccggccc tgcctgccct ggaactctgc cactgtcctt 300cagcaaacgt accatgccca cagatctgat gctcttcagc tgggcctggg gaaacataat 360tactgcagga acccagacaa ccggaggcga ccctggtgct atgtgcaggt gggcctaaag 420ccgcttgtcc aagagtgcat ggtgcatgac tgcgcagatg gaaaaaagcc ctcctctcct 480ccagaagaat taaaatttca gtgtggccaa aagactctga ggcccaagtt taagattatt 540gggggagaat tcaccaccat cgagaaccag ccctggtttg cggccatcta caggaggcac 600cgggggggct ctgtcaccta cgtgtgtgga ggcagcctca tcagcccttg ctgggtgatc 660agcgccacac actgcttcat tgattaccca aagaaggagg actacatcgt ctacctgggt 720cgctcaaggc ttaactccaa cacgcaaggg gagatgaagt ttgaggtgga aaacctcatc 780ctacacaagg actacagcgc tgacacgctt gctcaccaca acgacattgc cttgctgaag 840atccgttcca aggagggcag gtgtgcgcag ccatcccgga ctatacagac catctgcctg 900ccctcgatgt ataacgatcc ccagtttggc acaagctgcg agatcactgg ctttggaaaa 960gaggcttcta ccgactatct ctatccggag cagctgaaaa tgactgttgt gaagctgatt 1020tcccaccggg agtgtcagca gccccactac tacggctctg aagtcaccac caaaatgctg 1080tgtgctgctg acccacagtg gaaaacagat tcctgccagg gagactcagg gggacccctc 1140
gtctgttccc tccaaggccg catgactttg actggaattg tgagctgggg ccgtggatgt1200gccctgaagg acaagccagg cgtctacacg agagtctcac acttcttacc ctggatccgc1260agtcacacca aggaagagaa tggcctggcc ctctga 129权利要求
1.低分子量尿激酶突变体，具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
2.编码具有序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列的低分子量尿激酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的编码具有序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列的低分子量尿激酶突变体的基因，具有序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
4.弱化的dhfr双顺反子真核表达载体pIRES-dhfr，保藏号为CGMCC No.1623。
5.权利要求4所述的表达载体CGMCC No.1623所表达的低分子量尿激酶突变体。
6.根据权利要求5所述的低分子量尿激酶突变体，具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
7.含有权利要求4所述的低分子量尿激酶突变体的表达载体CGMCCNo.1623的细胞。
8.含有权利要求7所述的含有低分子量尿激酶突变体的表达载体的细胞，其特征在于所述细胞为dhfr缺陷型CHO细胞株。
全文摘要
本发明公开了低分子量尿激酶突变体及其表达载体，属于基因工程领域。低分子量尿激酶突变体，具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明的优点是与天然HMW－uPA相比，(1)可提高产品的稳定性，使产品更均一，有利于产品的质量控制；(2)可避免体内凝血酶对pro－UK的灭活作用，提高血药浓度以提高溶栓效率；可能延长药物的体内半衰期；(3)可提高蛋白质的比活性，减少用药量。分子量较小的LMW－UK不仅容易表达，并且临床剂量还可减少，非常有利于哺乳动物细胞表达的生物技术药物的产业化。
文档编号C12N5/10GK1880449SQ20061006581
公开日2006年12月20日 申请日期2006年3月24日 优先权日2006年3月24日
发明者胡显文, 高丽华, 陈惠鹏, 潘淑媛, 殷亮, 杨波, 张正光 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所