专利名称：一种人肝素酶的表达方法及其专用工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶的表达方法及其专用工程菌，特别是涉及一种人肝素酶的表达方法及其专用工程菌。
背景技术：
硫酸肝素，即线形阴离子糖胺聚糖，广泛存在于各种细胞表面，介导蛋白质之间的相互作用，如参与细胞因子(FGF-1，2、HGF、TGFβ、PDGF)与受体的结合，调节抗凝血酶与凝血酶之间的作用，并是细胞间质和血管内皮下基底膜的重要组成部分。在肿瘤形成过程中，细胞外间质包裹肿瘤形成的与正常组织的分隔，以及血管内皮下的基底膜构成了阻止肿瘤向相邻组织浸润和血行转移的生理屏障。
肝素酶-β-1，4葡萄糖苷内切酶，特异性地作用于硫酸肝素的特定位点，将其降解为小分子片段。有关肝素酶的研究已二十余年，研究表明肝素酶对机体的发育、炎症过程、血管生成、肿瘤转移均有重要作用。目前被人们普遍关注的是恶性肿瘤的发生和发展均伴有肝素酶的高表达，这意味着①基底膜的完整性遭到破坏，肿瘤细胞将突破局限转移至它处或穿透基底膜进入血管；②肝素酶促血管生成作用为侵袭、转移的肿瘤细胞提供了定居、生长所需营养。因此，肝素酶对肿瘤的发生、发展具有重要作用。肝素酶降解血管基底膜中的硫酸肝素，使基底膜通透性增加，是肝素酶参与炎症反应的机理，当肝素酶超表达时将引发自身免疫性疾病。由此可见，肝素酶与肿瘤的发生、发展及转移以及自身免疫性疾病密切相关。因此研制一种肝素酶抑制剂对于恶性肿瘤和自身免疫病的治疗具有重大意义，但建立一种肝素酶抑制剂的筛选模型是首要问题。目前国内尚无肝素酶抑制剂筛选模型的报道，研究进度明显落后于临床研究的需要。
目前，国内、外制备人肝素酶的方法主要是从血小板、胎盘等高表达肝素酶的组织中提取，Vlodavsky等利用基因重组CHO细胞表达肝素酶，具有表达量低、纯化困难、原料生物体生长周期长、生产及提取成本高等缺点(Vlodavsky I，Friedmann Y，Elkin M，et al.Mammalian heparanasegene cloning，expression and functionin tumor progression and metastasis.Nat Med.1999，5(7)793-802)。
发明内容
本发明的目的是一株可高效表达人肝素酶的专用工程菌。
本发明所提供的高效表达人肝素酶的专用工程菌，名称为GS115/HPA1，该菌株已于2006年01月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1585。
表达人肝素酶的专用工程菌GS115/HPA1 CGMCC No.1585为革兰氏阴性杆菌，无芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，能运动。菌体大小为(0.5-0.9)×(1.0-3.0)微米，在不同环境中生长的菌体形态各异。在培养条件下，该菌呈小的短杆状，菌体染色不均匀，形成着色与不着色部分的环状体，不着色的部分脂类含量高。在酵母汁甘露醇琼脂培养基平面上生长的菌落呈圆形，边缘整齐，稍突起，无色半透明或浅乳白色，菌苔较浓。
本发明的第二个目的是提供一种上述工程菌GS115/HPA1 CGMCC No.1585的构建方法。
本发明所提供的构建方法，包括以下步骤1)PCR扩增去除信号肽的人肝素酶的编码序列，所述去除信号肽的人肝素酶具有序列表中序列2的氨基酸残基序列；2)将步骤1)获得的去除信号肽的人肝素酶的编码序列导入载体pPIC9K中，得到重组毕赤酵母表达载体；3)将步骤2)构建的重组毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母菌株GS115，筛选，得到人肝素酶的专用表达工程菌GS115/HPA1 CGMCC No.1585。
在上述构建方法中，步骤2)中的重组毕赤酵母表达载体可按照生物工程领域中的常规方法构建；步骤3)中将重组毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母的方法优选为电击转化法，但也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，例如，氯化锂转化法、原生质体转化法等。
本发明的另一个目的是提供一种的人肝素酶的表达方法。
本发明所提供的人肝素酶的表达方法，是发酵上述人肝素酶的专用表达工程菌GS115/HPA1 CGMCC No.1585，得到人肝素酶。
发酵上述重组毕赤酵母时需加入甲醇诱导剂，所加入甲醇的浓度为0.8-1.2％，优选为1％。
为补偿甲醇的挥发损失，每24小时还要补加甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.8-1.2％，诱导温度为28℃。
所述百分浓度均为体积百分浓度。
本发明提供了一种人肝素酶的表达方法及其专用工程菌。用本发明的工程菌进行人肝素酶的表达，弥补了传统人肝素酶制备方法以及原核表达系统表达方式的不足；此外，若将本发明应用于工业化人肝素酶的生产，则具有原料生物体生长周期短，生产规模大，提取成本低，酶活性高的优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为不同阳性克隆的人四唑蓝测活结果具体实施方下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述培养基中的溶剂均为水，所述引物合成及测序工作均由三博生物技术有限公司完成。
实施例1、表达人肝素酶的专用工程菌GS115/HPA1 CGMCC No.1585的获得及人肝素酶的表达一、去除信号肽的人肝素酶编码序列的克隆1、引物的设计及合成经Blast查询得到人肝素酶全长的cDNA序列(编码序列表中序列1的氨基酸残基序列，参考文献Vlodavsky I，Friedmann，Y，Elkin M，et al Mammalianheparanasegene cloning，expression and function in tumor progression andmetastasis Nat Med，1999，5793-802)，再根据去除编码信号肽碱基的人肝素酶的cDNA序列(序列表中的序列2)设计引物，并在引物序列中引入限制性内切酶EcoR I和AVR II的识别位点，引物序列如下P1(上游引物)5’-ccgaattccaggacgtcgtggacc-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I的识别位点)P2(下游引物)5’-cgcctaggtcagatgcaagcagca-3’(带下划线碱基为限制性内切酶AVR II的识别位点)。
2、模板的获得先用TRIZOL试剂提取人肝癌HePG2细胞的总RNA，具体方法为将人肝癌HePG2细胞培养至一满瓶，收集，用PBS清洗2次，吸干，加入TRIZOL 1.5mL，转入2mL EP管，加入300μl氯仿，振摇30分钟，静置10分钟，12000rpm离心15分钟，将上清转入1.5mL EP管，加入等体积异的丙醇混匀，室温静置5分钟，12000rpm离心10分钟，用75％乙醇500μl清洗，12000rpm离心5分钟，干燥后加入20μl DEPC水。对提取物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明获得了纯度较高的RNA。再以提取的RNA为模板，使用INVITROGEN公司的反转录试剂盒并参照试剂盒说明书反转录合成其cDNA。
3、PCR扩增去除信号肽的人肝素酶的编码序列以步骤2反转录合成的cDNA为模板，在引物P1和P2的引导下，PCR扩增去除信号肽的人肝素酶编码序列，25μl PCR反应体系为10×PCR缓冲液2.5μl，25mM MgCl21.5μl，10mM dNTPs 0.5μl，引物P1和P2各1μl，Taq酶0.2μl，cDNA模板1μl，DEPC水17.3μl。PCR反应条件为先95℃ 2min；然后94℃ 30sec，58℃ 35sec，72℃ 90sec，共30个循环；最后72℃ 7min，4℃保存。反应结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR扩增获得了长度约为1527bp的DNA片段，与预期结果相符。
4、构建含有目的片段的克隆载体参照试剂盒说明书进行操作，将步骤3 PCR扩增的目的片段直接亚克隆入载体pGEM T-Easy(Promega公司)中。
5、转化大肠杆菌及阳性克隆转化子的筛选及测序将步骤4获得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，具体方法为将10μl步骤4的连接产物与20μl大肠杆菌DH5α感受态细胞混匀，冰浴30min，42℃热激90sec，冰浴10min，然后加入800μl含0.05g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基(胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，水285mL)中，180rpm、37℃振摇90min，涂于含0.05g/mL氨苄青霉素的LB抗性培养平板(胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，琼脂粉4.5g，水285mL，16μl X-gal和4μl IPTG/平板)进行蓝白筛选，37℃培养12-24小时。挑取白斑并以此为模板，用引物P1和P2进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系及反应条件与步骤3相同。反应结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，可含转化子的阳性克隆。将筛选获得的阳性克隆转至4mL含0.05mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、300rpm振摇12-24小时，将菌液交由三博生物技术有限公司进行测序，测序结果表明所克隆的去除信号肽的人肝素酶的编码序列与Blast报道的序列完全一致，将步骤4构建的含有目的片段的克隆质粒命名为pGEM-hpa。
二、重组毕赤酵母表达载体的构建使用Promega公司的DNA纯化试剂盒并参照试剂盒说明书提取含目的基因的T质粒pGEM-hpa。使用限制性内切酶EcoR I和AVR II(TaKaRa公司)对质粒pGEM-hpa与pPIC9K进行双酶切。对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，分别切下含目的基因与线性质粒pPIC9K的胶块，使用上海申能博采公司的琼脂糖胶纯化试剂盒分别对目的基因和线性质粒pPIC9K进行回收。然后将目的基因和线性质粒pPIC9K用T4DNA连接酶(Promega公司)进行连接，4℃连接12-24小时，得到重组毕赤酵母表达载体，命名为pPIC9K-hpa。
三、转化酵母菌及高拷贝转化菌株的筛选将毕赤酵母菌GS115培养至OD600为1.5左右，4℃、1500rpm离心6min，弃上清，加入50mL双蒸水离心(条件同前)，弃上清，再加入50mL水，离心(条件同前)，弃上清，加入4mL冰冷的山梨醇溶液(1M)，离心(条件同前)弃上清，加入200μl山梨醇(1M)，取80μl加入17μl经限制性内切酶Sal I含目的基因的重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-hpa，进行电击转化(1500伏，400欧，9毫秒，Biorad公司仪器)，然后加入1mL冰冷的山梨醇，混匀，取200μl涂于MD培养平板(3g琼脂粉，160mL双蒸水高压冷却后，加入经过滤的13.4％YPD培养基(称取134g Yeast Nitrogen Basew/o Amino Acid溶于1L水中，用0.22μm滤膜(MILLIPORE)过滤)20mL，20％D-葡萄糖20mL，20％B-生物素0.4mL，0.05g/mL氨苄青霉素)进行培养。挑取在MD培养平板上长出的单菌落，接种于G418培养平板(酵母提取物1g，peptone 2g，双蒸水70mL，琼脂粉1.5g，高压冷却后加入10mL 1M pH6.0的磷酸盐缓冲液，13.4％酵母含氮培养基10mL，20％B-生物素0.2mL，10％甘油10mL，4mg/mL G418)筛选高拷贝转化菌株。
四、肝素酶的表达挑取于G418培养平板上生长旺盛的34和56号单菌落，以转化有空白载体pPIC9K的重组毕赤酵母菌株为阴性对照，接种于5mL BMGY培养基(酵母提取物1g，peptone2g，双蒸水70mL，琼脂粉1.5g高压冷却后加入10mL 1M pH6.0的磷酸盐缓冲液，10×YNB10mL，20％B-生物素0.2mL，10％甘油10mL)中，30℃、300rpm振摇12-24小时(保存一部分菌种)，3000rpm离心弃上清，加入5mL BMMY培养基(酵母提取物1g，peptone2g，双蒸水70mL，琼脂粉1.5g，高压冷却后加入10mL 1M pH6.0的磷酸盐缓冲液，13.4％酵母含氮培养基10mL，20％B-生物素0.2mL，甲醇10mL)，28℃、300rpm振摇12-24小时，之后每天加入50μl甲醇(使甲醇的体积百分浓度保持在1％)进行诱导，诱导72小时，然后9000rpm离心10min留取上清。
五、表达产物的鉴定1、四唑蓝测活将步骤四获得的34和56号菌株的发酵液上清超滤后，以转化有空白载体pPIC9K的重组毕赤酵母菌株的发酵液上清为阴性对照，超滤置换为酶解缓冲液，再与肝素钠混合后37℃孵育3小时，然后加入四唑蓝60℃保温3小时，反应体系如表1所示(酶解缓冲液20mM磷酸盐—柠檬酸缓冲液，1mM CaCl2溶液，1mM NaCl溶液(pH5.4))，最后测OD570值，绘制成标准曲线，如图1所示，表明上述菌株的发酵表达产物具有较高的肝素酶活性，特别是56号菌株。
表1 反应体系
2、肝素酶抗体检测用ELISA的方法对发酵表达的肝素酶做进一步检测首先将34和56号菌株的发酵液上清超滤置换为包被液(NaCO31.59g，NaHCO32.93g，加蒸馏水定容至1L)，然后进行下述步骤1)包被酶联板用50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)将置换为包被缓冲液的发酵液上清，每孔100μl，4℃放置12-24小时；2)用10％的小牛血清封闭已包被的酶联板，100μl/孔，37℃温浴30分钟；3)添加按常规方法制备的(吴雄文、梁智辉，《实用免疫学实验技术》，第一章，1-2页)兔抗人肝素酶多克隆抗血清，100μl/孔，37℃温浴1小时，然后用10mM PBS洗三遍；4)添加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔第二抗体(购自军事医学科学院)，50μl/孔，37℃温浴30分钟，然后用10mM PBS洗三遍；5)添加辣根过氧化物酶底物溶液，50μl/孔，37℃显色15分钟；6)加入2N H2SO4终止反应，50μl/孔；7)测定OD450值。
检测结果表明56号菌株的发酵液上清的OD450值为1.288，证明所制备的发酵液上清确实含有肝素酶蛋白，将改株活性较高的菌株命名为GS115/HPA1，该菌株已于2006年01月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1585。
序列表<160>2<210>1<211>543<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)<400>1Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro Gly Ala Leu Pro Arg Pro20 25 30Ala Gln Ala Gln Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro35 40 45Leu His Leu Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn50 55 60Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu65 70 75 80Arg Thr Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly85 90 95Thr Lys Thr Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe100 105 110Glu Glu Arg Ser Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys115 120 125Tyr Gly Ser Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp130 135 140Pro Tyr Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe145 150 155 160Lys Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe165 170 175
Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu180 185 190Arg Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu195 200 205Asp Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn210 215 220Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser225 230 235 240Gln Leu Gly Glu Asp Phe Ile Gln Leu His Lys Leu Leu Arg Lys Ser245 250 255Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg260 265 270Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu275 280 285Val Ile Asp Ser Val Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr290 295 300Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile305 310 315 320Ser Ser Val Gln Lys Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly325 330 335Lys Lys Val Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala340 345 350Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys355 360 365Leu Gly Leu Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val370 375 380Phe Phe Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro385 390 395 400Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr405 410 415Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg420 425 430
Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly435 440 445Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu450 455 460Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu465 470 475 480Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn485 490 495Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met500 505 510Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser515 520 525Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile530 535 540<210>2<211>508<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)<400>2Gln Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro Leu His Leu1 5 10 15Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ala Thr20 25 30Asp Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu Arg Thr Leu35 40 45Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly Thr Lys Thr50 55 60Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe Glu Glu Arg65 70 75 80Ser Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys Tyr Gly Ser
85 90 95Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp Pro Tyr Gln100 105 110Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe Lys Asn Ser115 120 125Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe Ala Asn Cys130 135 140Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu Arg Thr Ala145 150 155 160Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu Asp Tyr Cys165 170 175Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro Asn180 185 190Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser Gln Leu Gly195 200 205Glu Asp Phe Ile Gln Leu His Lys Leu Leu Arg Lys Ser Thr Phe Lys210 215 220Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg Arg Lys Thr225 230 235 240Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile Asp245 250 255Ser Val Gln Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro Leu1 5 10His Leu Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn Leu15 20 25 30Ala Thr Asp Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu Arg35 40 45Thr Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly Thr50 55 60Lys Thr Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe Glu65 70 75Glu Arg Ser Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys Tyr
80 85 90Gly Ser Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp Pro95 100 105 110Tyr Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe Lys115 120 125Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe Ala130 135 140Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu Arg145 150 155Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu Asp160 165 170Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn Glu175 180 185 190Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser Gln195 200 205Leu Gly Glu Asp Phe Ile Gln Leu His Lys Leu Leu Arg Lys Ser Thr210 215 220Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg Arg225 230 235Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val240 245 250Ile Asp Ser Val Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr Ala255 260 265 270Thr Arg Glu Asp Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile Ser275 280 285Ser Val Gln Lys Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly Lys290 295 300Lys Val Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Pro305 310 315Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu320 325 330Gly Leu Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val Phe
335 340 345 350Phe Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro Leu355 360 365Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr Lys370 375 380Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg Val385 390 395Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly Asp400 405 410Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu Arg415 420 425 430Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu Arg435 440 445Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn Gly450 455 460Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met Glu465 470 475Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser Tyr480 485 490Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile495 500 50权利要求
1.表达人肝素酶的专用工程菌GS115/HPA1 CGMCC No.1585。
2.一种工程菌GS115/HPA1 CGMCC No.1585的构建方法，包括以下步骤1)PCR扩增去除信号肽的人肝素酶的编码序列，所述去除信号肽的人肝素酶具有序列表中序列2的氨基酸残基序列；2)将步骤1)获得的去除信号肽的人肝素酶的编码序列导入载体pPIC9K中，得到重组毕赤酵母表达载体；3)将步骤2)构建的重组毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母菌株GS115，筛选，得到人肝素酶的专用表达工程菌GS115/HPA1 CGMCC No.1585。
3.一种人肝素酶的表达方法，是发酵权利要求1所述的人肝素酶的专用表达工程菌GS115/HPA1 CGMCC No.1585，得到人肝素酶。
4.根据权利要求3所述的表达方法，其特征在于所述发酵时加入甲醇诱导剂，甲醇的体积百分浓度为0.8-1.2％。
5.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于所述甲醇诱导剂的体积百分浓度为1％。
6.根据权利要求4或5所述的表达方法，其特征在于所述诱导温度为28℃。
全文摘要
本发明公开了一种人肝素酶的表达方法及其专用工程菌。该人肝素酶的表达方法，是发酵人肝素酶的专用表达工程菌GS115/HPA1 CGMCC No.1585，得到人肝素酶。用本发明的工程菌进行人肝素酶的表达，弥补了传统人肝素酶制备方法以及原核表达系统表达方式的不足；此外，若将本发明应用于工业化人肝素酶的生产，则具有原料生物体生长周期短，生产规模大，提取成本低，酶活性高的优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。
文档编号C12N9/42GK1948461SQ20061006575
公开日2007年4月18日 申请日期2006年3月15日 优先权日2006年3月15日
发明者宫锋, 章扬培, 刘至玄, 田曙光, 徐丽娟 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所