专利名称：通气搅拌式培养槽的制作方法
技术领域：
本发明涉及通气搅拌式培养槽，该通气搅拌式培养槽设有便于装入培养液的立式筒形容器，在该容器内具有支承在其轴心同轴上的转轴和、安装在所述转轴上的用于搅拌培养液的搅拌桨叶和、用于向所述容器内送入空气的空气导入管，在所述容器顶部设有用于投入培养基原料和菌体的投入口。
背景技术：
一直以来，已知控制微生物培养生产性能的参数如搅拌桨叶的叶端速度、雷诺准数、氧转移系数(KLA)等可以作为指标。但是关于这些参数的探讨一直在培养槽的高度/槽内径(HT/D)的比值为2.0左右的情况下进行，在HT/D比值高的情况下没有进行过研究。
其原因在于，如果提高HT/D比值，有可能产生诸如上下方向上的混合不好、溶解二氧化碳过多等各种各样的问题(参考非专利文献1)。
因此，一般而言，以往培养槽形状的HT/D比值多数为1.8，HT/D比值高的也就大概3.8。
另外，考虑到气含量、发泡等，在大多情况下向培养槽中装入占总容量0.6～0.8的培养液，因此，此时培养液深度(＝HL)与槽内径(＝D)的比值高估时也就大概3.0。
Nienow et al.，Cytotechnology，22，87-94，1996发明内容培养需氧微生物时，往往因为溶解氧浓度(DOdisolved oxgen)的不同，使其代谢受到很大的影响。为了控制培养，控制溶解氧浓度变得很重要。
关于控制DO的方法，代表性的方法有控制搅拌、控制通气量或控制氧分压等。
通过控制搅拌来控制DO的方法是通气搅拌式培养槽中常用的方法。该方法通过搅拌来分散被导入的空气，促进氧向液体中转移，通过增减搅拌转数来增减氧转移速度，从而达到控制的目的。
但当采用此方法时，搅拌转数的增加会对菌体造成损伤或压力等，有可能影响其生产性能。在这种情况下，转数不能提高到某一转数或某一转数以上，因此，根据培养的种类不同，上述方法有时无效。
于是，考虑通过控制通气量或通气中的氧分压来控制DO。但是，此方法在进行放大时，为了提高生产性能，必须增加向培养槽内供给的通气量或增加通气中的氧分压。无论是哪一种情况，从运行成本等经济层面考虑都不是很现实。尤其是前者，其可能导致培养基发泡增多。
进而，在该方法中，培养的规模越大，单位液量所对应的表面积越小，因此光靠外部的夹套很难进行培养时的温度调节。因此，培养槽的内部需具有调温盘管等结构。但调温盘管等结构妨碍液体搅拌，从清洗性上看，是不利于清洗的结构。
鉴于上述实际情况，完成了本发明。本发明提供通气搅拌式培养槽，其在进行放大时，不需要特意增加搅拌桨叶的转数、通气量等，可以提高菌体的生产性能，也不需要在内部新安装调温盘管等，其结构简单，而且在清洗性等方面有利。
本发明的第一特征构成是，通气搅拌式培养槽设有便于装入培养液的立式筒形容器，在该容器内具有支承在其轴心同轴上的转轴和、安装在所述转轴上的用于搅拌培养液的搅拌桨叶和、用于向所述容器内送入空气的空气导入管，在所述容器顶部设有用于投入培养基原料和菌体的投入口，所述容器的直筒部高度(HT)与内径(D)的比值(HT/D)大于3.8，为了在被搅拌的培养液中产生涡流，在所述容器的周壁内侧附设有挡板。
通过采用上述构成，搅拌桨叶转动并搅拌从容器顶部投入口投入的培养基原料和菌体的培养液，同时，由空气导入管向上述容器内通入空气。这样，菌体的通气搅拌培养成为可能。但是，上述容器呈立式筒形，其直筒部高度(HT)与内径(D)的比值(HT/D)大于3.8，因此，即使是相同的通气量，与以往形状的培养槽相比，其可以增大通气线速度(通气量(m3/s)/截面积(m2)＝m/s)。即，被导入的空气与培养液的接触时间延长，使氧转移速度增加，不需要为了维持DO而特意地增加通气量、搅拌转数等。此外，还附设挡板，使被搅拌的培养液中产生涡流，更高效地进行上下方向上的搅拌，从而消除纵长的培养槽的缺点。进而又因为培养槽的纵向长，所以与以往的培养槽相比其表面积变大。因此，只靠培养槽外部的夹套就足以进行温度调节。这样就不需要在容器的内部新安装调温盘管等，能够更大更有效地利用容器内的培养空间。还可以使容器内部的结构变得简单，因而在清洗性等方面有利。
本发明的第二特征构成是，在转轴上安装有数片前述搅拌桨叶，且各搅拌桨叶分别易于安装和拆卸。
如果采用上述构成，因在转轴上安装有数片搅拌桨叶且各搅拌桨叶分别易于安装和拆卸，所以能够自由地调节单位液量的搅拌力。例如，根据需要，增加搅拌桨叶的数目，可以在不改变转数的情况下增加单位液量的搅拌力。因此，从结果上看，还可以达到降低搅拌功率的效果。
本发明的第三特征构成是，搅拌桨叶的间距(I)不到前述搅拌桨叶直径(d)的2倍。
如果采用上述构成，在多层搅拌桨叶时，使搅拌桨叶的间距(I)不到2d，从而使搅拌桨叶之间不易产生混合不均匀的区域，可以促进上下方向上的混合。
本发明的第四特征构成是，前述搅拌桨叶为倾斜叶片。
如果采用上述构成，倾斜叶片的转动而形成的纵向流动与纵长的培养槽形状产生协同作用，因此，即使在低搅拌所需功率、搅拌转数等的情况下，也能发挥良好的流动形成效果。
本发明的第五特征构成是，空气导入管的端部插入前述容器底部并开口，该空气导入管的基部侧设在前述容器的外部，且将基部侧的外周绝热包覆。
如果采用上述构成，只有空气导入管的端部插入容器底部并开口，因此，能够更大地利用容器内的培养空间。此外，还可以使容器内部的结构变得简单，因而在清洗性等方面有利。另外，一般情况下，空气导入管的基部侧设在容器的外部，当向空气导入管中送入加压蒸汽对前述通气搅拌式培养槽及培养基进行灭菌时，其放热效果可能使灭菌效果下降。但是在本构成中，因前述容器的外周实施了绝热包覆，所以放热效果得以抑制，不会降低灭菌效果。
本发明的第六特征构成是，使用上述特征构成五所述的通气搅拌式培养槽来培养微生物的方法。
如果采用上述构成，因使用上述通气搅拌式培养槽来培养微生物，所以在放大培养时，不需要特意增加搅拌桨叶的转数、通气量等就可以维持培养液中的DO。其结果可以保护微生物使其免受由搅拌桨叶造成的损伤和压力等，可以实施控制了通气量等运行成本且生产效率很高的培养。
本发明的第七特征构成是，其特征在于，前述微生物是丝状菌。
如果采用上述构成，可以高效地培养以曲霉(Aspergillus)属、青霉(Penicillium)属、根霉(Rhizopus)属、红曲(Monascus)属、被孢霉(Mortierella)属、毛霉(Mucor)属等为代表的丝状菌。这些丝状菌类容易附着在培养槽上部的上部空间(无培养液的空间)的壁面上，且附着后的丝状菌的生产性能低。因此，培养时，附着在壁面上的丝状菌在培养槽中培养的总丝状菌中所占的比例越高，其生产性能越低。
但前述通气搅拌式培养槽可以减少培养槽上部形成的上部空间，使其比以往的培养槽小。其结果使附着在壁面上的丝状菌所占的比例变小，生产性能不会下降。
本发明的第八特征构成是，其特征在于，前述丝状菌是被孢霉(Mortierella)属丝状菌。
如果采用上述构成，通过使用前述通气搅拌式培养槽，可以更高效地培养代表被孢霉(Mortierella)亚属微生物的花生四烯酸生产菌。这样就可以提高最近作为婴幼儿营养成分的作用而受到人们关注的花生四烯酸的生产效率。
涉及本发明实施方式的通气搅拌式培养槽的纵剖面示意图。
涉及本发明实施方式的通气搅拌式培养槽的底部横截面示意图。
通过本发明的实施例1及2得到的在各培养条件下的花生四烯酸生产量示意图。
通过本发明的实施例4得到的在各培养条件下的花生四烯酸生产量示意图。
符号说明1通气搅拌式培养槽2容器3转轴4搅拌桨叶5空气导入管
6投入口7直筒部8挡板9液体排出口10机械组件11电动机台座12电动机13减速机14顶部主体封头15底部主体封头16夹套壳体板17绝热材料具体实施方式
下面，结合附图，说明本发明的实施方式。
图1是适用了本发明的通气搅拌式培养槽1的纵剖面示意图，图2是通气搅拌式培养槽1的底部横截面示意图。如图1所示，立式筒形的容器2由直筒部7、顶部主体封头14以及底部主体封头15构成，在该容器2内具有支承在其轴心同轴上的转轴3和、安装在该转轴上且易于安装和拆卸卸的多层搅拌桨叶4(垂直叶片)和、其底部的空气导入管5，该空气导入管的端部形成有分布器(多孔喷嘴)。
搅拌桨叶4的直径约是培养槽内径的一半，而且，搅拌桨叶的上下间距不到搅拌桨叶直径(d)的2倍，优选等于搅拌桨叶的直径(d)。
而且，虽未在图中显示，空气导入管5在通气搅拌式培养槽1的外部与能够自由地控制空气供给量的压缩机连接。
进而又将在通气搅拌式培养槽1外部的空气导入管5基部侧的外周用绝热材料17包覆，可以抑制灭菌效果的降低。
在顶部主体封头14或直筒部7上设有用于投入培养基原料、菌体等的投入口6，在底部主体封头15上设有用于排出培养液、清洗液等的液体排出口9。
转轴3的上方通过设置在顶部主体封头14的外侧中央的机械组件10，与电动机台座11、电动机12以及减速机13连接，形成能够自由调节转速的结构。
在直筒部7的周壁外侧，设有用于调节培养槽温度的夹套壳体板16等。
此外，直筒部高度(HT)与内径(D)的比值(HT/D)大于3.8，进而又在直筒部7的周壁内侧附设4层挡板8，以使被搅拌的培养液中产生涡流，每层挡板中的3块挡板以一定的间隔(例如，0度、120度、240度)沿周壁内周并朝着培养槽的半径方向突出设置。
1.构成本发明通气搅拌式培养槽的容器2不限于圆柱形，其形状也可以是椭圆柱形或方柱形等。
2.根据需要，在本发明的通气搅拌式培养槽上还可以附加设置如培养基入口、植菌口、用于调节培养基pH的酸或碱的投入口、消泡剂投入口、排气口、空气入口、破裂盘、压力计、压力传感器、液位传感器、消泡传感器、pH传感器、DO传感器、DCO2传感器、各种传感器座、入口(manhole)、蒸汽入口、冷凝水排出口(drain)、窥孔、灯孔、防震配件、起吊配件、密封水容器(seal water tank)、垫片(gasket)、悬挂式支座(lug support)、法兰等。
3.构成本发明通气搅拌式培养槽的搅拌桨叶4可以不是垂直桨叶，只要能够获得充分的搅拌效果，可以是任意的形状(例如，倾斜桨叶中的倾斜涡轮桨叶)，而且，也可以不是装卸自如的结构。
4.在本发明的实施方式中，虽然挡板8分多层设置，但不限于此，也可以沿直筒部的全长附设一连串挡板，在圆周方向上附设的挡板数不限于3块，可以是1块或1块以上，优选2块～8块，挡板形状可以是长方形、直角三角形等，只要不降低搅拌效果，可以是任意的形状。
下面，通过实施例，更具体地说明本发明。但是，本发明不限于实施例。
实施例1(生产花生四烯酸、液量的放大)用花生四烯酸生产菌Mortierella alpina 1S-4作为要培养的菌体。在容量为500mL的锥形瓶内，制备酵母提取物1％、葡萄糖2％、pH6.3的培养基100mL，在该培养基上接种保藏菌株。在往复振荡100rpm、28℃的条件下，开始种培养(第一阶段)，培养了3天。
接着，在容量为50L的通气搅拌培养槽内，制备酵母提取物1％、葡萄糖2％、大豆油0.1％、pH6.3的培养基30L，在该培养基上接种前述种培养(第一阶段)液。在搅拌转数200rpm、28℃、槽内压150kPa的条件下，开始种培养(第二阶段)，培养了2天。
本培养中使用的培养槽具有槽内径(＝D)与搅拌桨叶直径(＝d)的比值d/D等于0.5的涡轮桨叶。还采用了直筒部高度(＝HT)与槽内径(＝D)的比值HT/D等于8的培养槽。
如下所示，在条件(1-1)下进行了培养。
将1200L培养基(培养基A大豆粉84.24kg、KH2PO43.9kg、MgCl2·6H2O0.65kg、CaCl2·2H2O 0.65kg、大豆油1.3kg)的pH调到4.5，在121℃下灭菌20分钟。将100L另一培养基(培养基B含水葡萄糖26kg)在121℃下灭菌20分钟。将此培养基B添加到前述培养基A中，制备培养基C。将培养基C的pH调到6.3后，接种种培养液(第二阶段)，合计为1300L初始培养液量(培养槽容积为2kL)。进而又在培养时适宜地流加培养基，进行了本培养。而且，此时培养液深度(＝HL)与槽内径(＝D)的比值HL/D等于5.2。设置了8层搅拌桨叶并使搅拌桨叶的间距(＝I)与搅拌桨叶的直径(＝d)相等(I＝d)，最大通气量为1.7m3/min，进行了本培养。
以往，在进行放大时，按照相似形状扩大培养罐。而本发明人等直接采用实施例1(条件(1-1))中使用的培养槽，只在高度方向上改变液量，进行一系列实验，从而探讨了高度方向上放大的效果。
在条件(1-2)即在液量为1000L(HL/D＝4.0)且其组成与条件(1-1)中培养基C的组成相同、6层搅拌桨叶(I＝d)的条件下，进行了培养。在条件(1-3)即在液量为650L(HL/D＝2.6)、4层搅拌桨叶(I＝d)的条件下，进行了培养。在条件(1-4)即在液量为300L(HL/D＝1.2)、2层搅拌桨叶(I＝d)的条件下，进行了培养。条件(1-1)～(1-4)的任一条件中的培养基组成浓度、最大通气量、单位液量所需的搅拌功率均与前述一样，进行了本培养。如图1所示，所有搅拌桨叶均以90°的叶片安装角安装在转轴上。
培养结束后，采集培养液，分析了单位培养液量中的花生四烯酸生成量，其结果为条件(1-1)为14.1g/L、条件(1-2)为13.4g/L、条件(1-3)为13.1g/L、条件(1-4)为11.5g/L。上述培养条件及结果在图3中显示。
此外，刮取附着在培养液上部气相部即上部空间的壁面上的菌体，测定其干重。壁面菌体/液体菌体的比率(＝壁面上附着的总干燥菌体重量/培养液中的总干燥菌体重量)条件(1-1)为2.8％、条件(1-2)为3.5％、条件(1-3)为5.5％、条件(1-4)为11.8％。
本发明人等发现在HL/D比值越高的条件下培养，花生四烯酸的生成量越多，且附着在壁面上的菌体的比例越小。而且，因为一系列实验均在相同的通气条件下进行，所以还发现HL/D比值越高，单位供给通气量对应的花生四烯酸的生成收率越好。
实施例2(生产花生四烯酸、增加搅拌桨叶)接着，在与实施例1相同的条件下，进行种培养，本培养液量也为1300L(HL/D＝5.2)且培养基组成浓度与实施例1相同，最大通气时的绝对通气量为3.4m3/min，进行了一系列本培养(条件(2-1)～(2-5))。
条件(2-1)中搅拌桨叶的层数为8层(I＝d)，条件(2-2)为4层(I＝2d)，条件(2-3)为2层(I＝4d)，条件(2-4)为1层，条件(2-5)中无搅拌桨叶，在上述条件下进行了本培养。培养结束后，采集培养液，分析了单位培养液量中花生四烯酸的生成量，其结果条件(2-1)为14.5g/L、条件(2-2)为8.9g/L、条件(2-3)为9.1g/L、条件(2-4)为9.1g/L、条件(2-5)为4.3g/L。上述培养条件及结果在图3中显示。
如条件(2-5)的结果所示，即使无搅拌桨叶，也有花生四烯酸生成。但是，从条件(2-1)～(2-4)的结果中可知，在安装有搅拌桨叶的条件下花生四烯酸的生成量多。而且，更优选搅拌桨叶的间距(I)不到搅拌桨叶直径(d)的2倍但越接近于2倍，此时的效果好。
实施例3(比较液体中的菌体和壁面上附着的菌体的质量)用花生四烯酸生产菌Mortierella alpina 1S-4作为要培养的菌体。在容量为500mL的锥形瓶内，制备酵母提取物1％、葡萄糖2％、pH6.3的培养基100mL。在该培养基上接种保藏菌株，在往复振荡100rpm、28℃的条件下，开始前培养，培养了3天。
接着，在容量为50L的通气搅拌培养槽内，制备酵母提取物1％、葡萄糖2％、大豆油0.1％、pH6.3的培养基25L。在该培养基上接种前培养(第一阶段)液，在搅拌转数200rpm、28℃、槽内压150kPa的条件下，培养了7天。在培养过程中，适宜地流加葡萄糖，以维持培养液中葡萄糖浓度为0.5～4.0％。
培养结束后，分别回收培养液中的菌体以及附着在上部空间壁面上的菌体，分析了脂肪酸组成。花生四烯酸在总脂肪酸中所占的比例在培养液菌体中为44.0％，而在壁面上附着的菌体中为37.3％。
结果证实当壁面上附着的菌体在培养槽内总菌体中所占的比例增加时，培养槽整体的平均花生四烯酸含量下降，对含有花生四烯酸的油脂的质量产生影响。
实施例4
(倾斜式搅拌桨叶的效果)用花生四烯酸生产菌Mortierella alpina 1S-4作为要培养的菌体。在容量为500mL的锥形瓶内，制备酵母提取物1％、葡萄糖2％、pH6.3的培养基100mL。在该培养基上接种保藏菌株，在往复振荡100rpm、28℃的条件下，开始前培养(第一阶段)，培养了3天。
接着，在容量为50L的通气搅拌培养槽内，制备酵母提取物1％、葡萄糖2％、大豆油0.1％、pH6.3的培养基25L。在该培养基上接种前培养(第一阶段)液，在搅拌转数200rpm、28℃、槽内压150kPa的条件下，培养了2天(第二阶段)。
本培养中使用的培养槽，其直筒部高度(＝HT)与槽内径(＝D)的比值HT/D等于8。根据各实验条件的要求，安装垂直平叶片涡轮桨叶(叶片安装角为90°)或倾斜平叶片涡轮桨叶(叶片安装角为45°)。另外，在所有条件中，搅拌桨叶直径(＝d)与槽内径(＝D)的比值d/D等于0.5。
除下述条件以及培养天数(12天)、最大通气时的绝对通气量(3.4m3/min)之外，其他条件均与实施例1(条件(1-1))相同，采用前述第二阶段的种培养，进行了一系列本培养(条件(4-1)～(4-4))。
条件(4-1)中，安装了8层垂直平叶片涡轮桨叶并使搅拌桨叶的间距(＝I)与搅拌桨叶的直径(＝d)相等(I＝d)。
条件(4-2)中，安装了4层垂直平叶片涡轮桨叶并使搅拌桨叶的间距(＝I)是搅拌桨叶直径(＝d)的2倍(I＝2d)。在与条件(4-1)相同的搅拌转数(搅拌所需功率是条件(4-1)的约50％)下培养。
条件(4-3)中，安装了4层倾斜平叶片涡轮桨叶并使搅拌桨叶的间距(＝I)是搅拌桨叶直径(＝d)的2倍(I＝2d)。在与条件(4-1)相同搅拌所需功率下培养。
条件(4-4)中，安装了4层倾斜平叶片涡轮桨叶并使搅拌桨叶的间距(＝I)是搅拌桨叶直径(＝d)的2倍(I＝2d)。在与条件(4-2)相同搅拌所需功率(为条件(4-1)以及条件(4-3)的约50％)下培养。
培养结束后，采集培养液，分析了单位培养液量中花生四烯酸的生成量，其结果为条件(4-1)为14.1g/L、条件(4-2)为9.4g/L、条件(4-3)为15.3g/L、条件(4-4)为14.8g/L。上述培养条件及结果在图4中显示。
如图4所示，从条件(4-1)～(4-4)的结果中可知，以单位培养液量中的浓度换算，相对于搅拌所需功率的花生四烯酸生成量，在安装了倾斜式涡轮桨叶的培养槽中比在安装了垂直(平)式涡轮桨叶的培养槽中高。倾斜涡轮桨叶的转动而形成的纵向流动与纵长的培养槽形状产生协同作用，因而发挥良好的流动形成效果，或许可以认为这与花生四烯酸生成量的增加有关。
权利要求
1.通气搅拌式培养槽，该通气搅拌式培养槽设有便于装入培养液的立式筒形容器，在该容器内具有支承在其轴心同轴上的转轴和、安装在所述转轴上的用于搅拌所述培养液的搅拌桨叶和、用于向所述容器内送入空气的空气导入管，在所述容器顶部设有用于投入培养基原料和菌体的投入口，所述容器的直筒部高度(HT)与内径(D)的比值(HT/D)大于3.8，为了在被搅拌的培养液中产生涡流，在所述容器的周壁内侧附设有挡板。
2.根据权利要求1所述的通气搅拌式培养槽，其中，在所述转轴上安装有数片所述搅拌桨叶，且各搅拌桨叶分别易于安装和拆卸。
3.根据权利要求2所述的通气搅拌式培养槽，其中，所述搅拌桨叶的间距(I)不到所述搅拌桨叶直径(d)的2倍。
4.根据权利要求1所述的通气搅拌式培养槽，其中，所述搅拌桨叶是倾斜叶片。
5.根据权利要求1所述的通气搅拌式培养槽，其中，所述空气导入管的端部插入所述容器底部并开口，该空气导入管的基部侧设在所述容器的外部，并将基部侧的外周绝热包覆。
6.微生物的培养方法，其采用权利要求1～5任意一项所述的通气搅拌式培养槽。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述微生物是丝状菌。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述丝状菌是被孢霉Mortierella属丝状菌。
全文摘要
本发明提供通气搅拌式培养槽，该通气搅拌式培养槽设有便于装入培养液的立式筒形容器2，在该容器2内具有支承在其轴心同轴上的转轴3和、安装在所述转轴上的用于搅拌培养液的搅拌桨叶4和、用于向所述容器内送入空气的空气导入管5，在所述容器顶部设有用于投入培养基原料和菌体的投入口6，所述容器的直筒部7高度(H
文档编号C12M1/02GK1854286SQ20061006569
公开日2006年11月1日 申请日期2006年3月21日 优先权日2005年3月22日
发明者东山坚一 申请人:三得利株式会社