专利名称：一种枯草芽胞杆菌胞外分泌表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种枯草芽胞杆菌胞外分泌的表达载体，以及用该载体转化的枯草芽胞杆菌。
背景技术：
大肠杆菌表达系统是最早应用于基因工程领域表达外源性蛋白，现在虽然仍然广泛应用在该领域，但存在一些越来越明显的缺点和难以解决的问题。比如，表达产物以包涵体形式存在、分泌的内毒素等，给下游纯化增加困难。与大肠杆菌表达系统相比，枯草杆菌表达系统具有以下明显的点(1)枯草杆菌有完善的分泌特征，可将产物分泌到细胞外，极大地减少了对产物的分离纯化步骤，提高了回收率；(2)枯草杆菌是一种无致病性的安全微生物，长期以来作为工业微生物得到广泛的应用；(3)已经在枯草杆菌表达系统中建立了成熟的工业化生产工艺和流程；(4)诸如IL-1等利用大肠杆菌不能表达的基因，能在枯草杆菌表达并且得到有活性的产物。因此，将枯草杆菌表达系统应用于基因工程领域引起人们很大的兴趣。
虽然在以上多个方面，枯草杆菌表达系统优于大肠杆菌表达系统，但在表达量上却不如大肠杆菌。造成的原因主要是因为枯草杆菌分泌大量蛋白酶，会将表达产物分解；科学技术人员对此研究后，已得到了枯草杆菌的突变株(缺失多种蛋白酶基因的菌株，如WB600、WB700)，该突变株不分泌或分泌少量蛋白酶，因而减少了蛋白酶对表达产物分解的现象。但是由于对枯草杆菌的研究不如大肠杆菌深入，目前仍缺乏像大肠杆菌一样齐全多样的高效表达载体。
发明内容
本发明的目的在于克服枯草杆菌表达系统在表达量上低的缺陷，利用分子生物学的技术手段，致力于转录和外分泌两个环节，人工合成了含枯草芽胞杆菌适用的启动子、增强子、SD序列和信号肽、转录终止序列等元件。构建了一种适用于在枯草芽胞杆菌中高效表达的载体。
为了完成上述目的，本发明首先人工合成了核苷酸片段，其包含的7个元件依次为SacB启动子、果聚糖蔗糖酶翻译增强子、SD序列和23个氨基酸残基组成的完整信号肽、多克隆位点、α-Amylase转录终止、degQ序列。然后，将核苷酸片段拼装后克隆进pBR322质粒(购自天为时代公司)，该载体可作为穿梭质粒载体。
本发明提供的枯草芽胞杆菌胞外分泌表达载体是通过如图1所示的流程构建的。
首先合成58条寡核苷酸引物，如图3和图4所示，其中29条正链(标号为A)和29条负链(标号为B)间均有部分碱基互补，退火可以形成双链的片段1。片段1从5’端到3’端的序列依次包括SacB启动子、果聚糖蔗糖酶翻译增强子、SD序列、信号肽、多克隆位点、α-Amylase转录终止和degQ序列。这样设计的原因是由于构建本载体所用的各模块是分散在基因组中，不连续的。所以一次PCR不能达到将所有模块扩增出来。如用多次PCR的方法则增加了错误和突变率。所以采用了多组的引物互相互补，然后退火的方法，该方法简单易行。按照设计，片段1的5’端退火后形成NheI酶切位点，3’端退火后形成BamHI酶切位点。pBR322的3’端经BamHI酶切后形成BamHI酶切位点，5’端用NheI酶切形成NheI酶切位点，正好与片段1相对应。所以片段1可以克隆进pBR322的NheI、BamHI位点。最终得到了本发明构建的载体pFYS.1(如图2所示)。
本发明克隆进pBR322质粒中的7个元件序列如下所示(1)SacB启动子ccatcacatatacctgccgttcactattatttagtgaaatgagatattatgatattttctgaattgtgattaaaaaggcaactttatgcccatgcaacagaaactataaaaaatacagagaatgaaaagaaacagatagattttttagttctttagg(2)果聚糖蔗糖酶增强子CCCGTAGTCTGCAAATCCTTTTATGATTTTCTATCAAACAAAAGAGGAAAATAGACCAGTTGCAATCCAAACGAGAGTCTAATAGAATGAGGTCGAA
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(7)degQ序列TCTGCTCAATAACGACTTCCCCCCTCCCATTCCATTTTACTAAATGGGACATTTAAAGGACAGCAGGTTTTTCGTTTTTTAACAATCATATAATACTTTATCCATTTATTGTATCGGTAGAACGAAAAAAAAGACTTGTTTCCAAGTCTTTTTCACGAAATTTTCATTGCATAATTGTATTTATCGAGTTGATCAATGCTTTTGTTAATGTTTCGTAATGAATCTGTCGTTTCTTTAATATCAAGTTCGAGTCGGAATAACAATTGTTTTACTTCTTCAAGTTTCTTTTCCATCGTTTCCACACTCCTTTTTTTGAAAGATCCCCATCAGATCTGCCGGTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC
图1为质粒pFYS.1的构建流程；图2为质粒pFYS.1的结构3为化学合成29条正向寡核苷酸引物A图4为化学合成29条反向寡核苷酸引物B图5完整的片段1(1622bp)的序列组成图6枯草杆菌和大肠杆菌中表达效果的比较泳道1为分子量Marker，泳道2为枯草杆菌表达的酶，泳道3为大肠杆菌表达的酶。
具体实施例方式
实施例1、29条正向寡核苷酸引物A和29条反向寡核苷酸引物B的合成及片段1的组装所述的58条寡核苷酸引物的碱基序列如图3和图4所示，使用固相亚磷酞胺法化学合成，然后经PAGE纯化；在所述的58条寡核苷酸引物中，正链(标号为A)和负链(标号为B)间均有部分碱基互补，退火可以形成互补链，利于片段的正确连接；分别取已纯化好的寡核苷酸引物，用去离子水溶解。58种引物分别取1.72pmol，共100pmol，放在一个管中，在含有1×T4多核苷酸激酶缓冲液，10mmol ATP，5个单位的T4多核苷酸激酶的40μl反应体系中，37℃温育1小时进行5’末端磷酸化，将磷酸化的正、反向引物等摩尔混合，90℃退火，自然冷却至室温，得到片段1。片段1依次包括SacB启动子、果聚糖蔗糖酶翻译增强子、SD序列和23个氨基酸残基组成的完整信号肽、多克隆位点、α-Amylase转录终止、degQ序列，片段1的序列如图5所示。
实施例2、质粒pFYS.1的构建实施例1的反应中得到的片段1，由于事先设计在退火后，自动分别在5’端和3’端形成了NheI和BamHI位点采用引物A15’ctagcccatcacatatacctgccgttcactattatttagtgaaatgagatattatgata，和引物B15’AGTGAACGGCAGGTATATGTGATGGG，退火后在引物A1的5’端形成NheI酶切位点。
采用引物A295’CGCCCTATAGTGAGTCGTATTACg和引物B295’GATCCGTAATACGACTCACTATAGGGCGACCGGCAGATCTGATGGGGATCTTTCAAA，退火后在引物A1的3’端形成BamHI酶切位点。
先用BamHI酶切pBR322后，然后用NdeI酶切分离出大片段。得到的pBR322酶切大片段10pmol和100pmol上述得到的片段1，在含有1mMATP、10mM DTT、1×T4DNA连接酶缓冲液、10单位T4DNA连接酶的反应体系中，于12℃连接过夜。从而片段1插入到pBR322，构建成质粒pFYS.1。
实施例3利用该质粒pFYS.1表达淀粉酶外源蛋白我们以前的工作曾克隆了淀粉酶基因(蒋专，2006，北京科技大学硕士学位论文，淀粉酶的基因工程研究)，其基因序列的GeneBank的号码为AE006718.1。淀粉酶基因已经用PstI和HimdIII酶切处理后，被克隆进pFYS.1表达载体的PstI和HimdIII位点中，得到重组质粒。重组质粒纯化后，通过电转化方法转化枯草芽孢杆菌。转化的枯草芽孢杆菌在5ug/ml的硫酸卡那霉素的LB平板筛选阳性转化子。将所得到的重组子直接接种到LB培养基中，培养48h后，离心取上清液进行SDS-PAGE电泳(6％浓缩胶，12％分离胶)，同时取上清测酶活。
作为对照，在大肠杆菌表达系统中，将淀粉酶基因重组进pET-21质粒(购自Invitrogen公司)的NdeI和BamHI位点中，得到重组质粒。重组质粒纯化后，通过电转化方法转化大肠杆菌。在50ug/ml的氨苄青霉素的LB平板筛选阳性转化子。将所得到的重组子直接接种到LB培养基中，培养48h后，离心取上清液进行SDS-PAGE电泳(6％浓缩胶，12％分离胶)，同时取上清测酶活。电泳的结果见图6。从图中可见，在枯草芽孢杆菌的蛋白清晰可见，而大肠杆菌中的蛋白不清楚。酶活测定的结果表明，在枯草芽孢杆菌中的最高产酶水平达到4.5U/ml，在大肠杆菌中的最高产酶水平达到0.22U/ml。枯草芽孢杆菌的表达水平是大肠杆菌产酶水平的20倍。
序列表.txtSEQUENCE LISTING<110>北京中天诺亚体育科技有限公司<120>一种枯草芽胞杆菌胞外分泌表达载体<130>FPI06093<160>59<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>59<212>DNA<213>引物<400>1ctagcccatc acatatacct gccgttcact attatttagt gaaatgagat attatgata59<210>2<211>57<212>DNA<213>引物<400>2ttttctgaat tgtgattaaa aaggcaactt tatgcccatg caacagaaac tataaaa 57<210>3<211>57<212>DNA<213>引物<400>3aatacagaga atgaaaagaa acagatagat tttttagttc tttaggcccg tagtctg 57<210>4<211>57<212>DNA<213>引物<400>4caaatccttt tatgattttc tatcaaacaa aagaggaaaa tagaccagtt gcaatcc 57<210>5<211>57<212>DNA<213>引物<400>5aaacgagagt ctaatagaat gaggtcgaaa agtaaatcgc gcgggtttgt tactgat 57<210>6<211>57<212>DNA<213>引物<400>6aaagcaggca agacctaaaa tgtgtaaagg gcaaagtgta tactttggcg tcacccc 57<210>7<211>57<212>DNA<213>引物<400>7ttacatattt taggtctttt tttattgtgc gtaactaact tgccatcttc aaacagg 57
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1.一种表达载体，包含SacB启动子、果聚糖蔗糖酶翻译增强子、SD序列、23个氨基酸残基组成的完整信号肽、多克隆位点、α-Amylase转录终止和degQ序列。
2.根据权利要求1所述的载体，其具有图2所示的基因图谱并且被命名为pFYS.1。
3.一种枯草芽胞杆菌，其被权利要求1或2所述的表达载体所转化。
全文摘要
本发明公开了一种适用于在枯草芽胞杆菌中高效表达的载体。该表达载体包含SacB启动子、果聚糖蔗糖酶翻译增强子、SD序列、23个氨基酸残基组成的完整信号肽、多克隆位点、α－Amylase转录终止和degQ序列。本发明还进一步涉及用该载体转化的枯草芽胞杆菌。
文档编号C12N1/21GK101041830SQ20061006568
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月21日 优先权日2006年3月21日
发明者杨建国, 汪兵 申请人:北京中天诺亚体育科技有限公司