专利名称：一种胡萝卜液泡转化酶Ⅱ基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种胡萝卜液泡转化酶II基因启动子及其应用。
背景技术：
胡萝卜可生食，产量高，易种植，耐储藏，营养丰富而且是重要的早期婴幼儿食品，因此转基因胡萝卜可以作为优良的生产口服疫苗的植物载体，但是适合在胡萝卜中，尤其是在胡萝卜直根中特异表达外源基因的启动子元件尚未被报道。目前用于构建植物表达载体的启动子主要是组成型启动子(花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子)，相对于组织特异性启动子，它易造成植物营养浪费且可能带来转基因漂流与生物安全性问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种可在胡萝卜直根中特异表达外源基因的胡萝卜液泡转化酶II基因启动子。
本发明所提供的胡萝卜液泡转化酶II基因启动子，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1杂交的核苷酸序列；3)与序列表中的SEQ ID №1具有90％以上同源性且可驱动基因在胡萝卜直根中表达的DNA序列。
具有序列表中序列1的DNA序列的胡萝卜液泡转化酶II基因启动子名称为De-InvP。
上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
所述在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1杂交的核苷酸序列可具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列，该胡萝卜液泡转化酶II基因启动子名称为InvP。
本发明利用一个农杆菌介导的胡萝卜直根瞬间表达体系证明，本发明的胡萝卜液泡转化酶II基因启动子可在胡萝卜直根中特异表达外源基因，且具有较高的生物活性，可用于在胡萝卜直根中表达外源蛋白。
图1为InvP和De-InvP启动子驱动表达的GUS活性。
图2A为De-InvP驱动GUS在胡萝卜中的瞬间表达结果。
图2B为转pINT121的胡萝卜中GUS的瞬间表达结果。
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、InvP和De-InvP的获得及其功能实验1.2.7kb长启动子的克隆根据Sturm发表的序列(Sturm 1996，J.Exp.Bot.47，1187-1999，Genbank号Y18706)利用正向引物Pro15’-AATTAAGCTTGTCGACTCCCACATAGCAAT-3’和反向引物Pro25’-AATTCCATGGTAATTATATGAAGAATGTG-3’，以野生型胡萝卜的基因组DNA为模板进行PCR，获得距转化酶基因翻译起始位点上游2.7kb的全长启动子S1片段，并在片段两端引入酶切位点。序列测定结果表明，该S1片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，将该S1片段命名为InvP。其中，PCR的温度条件为94℃预变性5分钟；再94℃1分钟，60℃2分钟，72℃1分30秒，共30个循环；最后72℃10分钟。
2.构建2.7kb长启动子与GUS报告基因的融合体将PCR合成的2.7kb长的启动子S1片段用HindIII和Nco I酶切并克隆到质粒pDMC202(CAMBIA，Canberra，Australia)的HindIII和Nco I识别位点间，形成S1::GUS融合，新质粒定名为pDMCmin。为更换载体背景，将S1::GUS的部分片段用HindIII和SnaBI从pDMCmin上切下并插入pBI221-GusInt的HindIII和SnaBI识别位点间，定名为pBI221-S1。然后用HindIII和EcoR I从pBI221-S1上切下S1::GUSInt片段，插入到植物表达载体pBI121(质粒购自Clontech公司)的HindIII和EcoR I识别位点间，得到含有2.7kb长启动子InvP与GUS-Int报告基因的融合体的植物表达载体pS1。其中，pBI221-GusInt按照以下方法制备将具有序列表中序列3的内含子(马铃薯ST-LS1基因的第二个内含子)序列插入pBI221(购自Clontech公司)的SnaBI位点上，得到pBI221-GusInt质粒。
将具有序列表中序列3的内含子插入pBI121质粒的SnaBI位点，得到GUS基因中插入内含子的重组载体pINT121。以含有CaMV 35S启动子与GUS-Int融合的pINT121为阳性对照。用限制性内切酶HindIII和SmaI酶切pINT121，切除CaMV 35S启动子，回收大片段补平后自连，得到缺失CaMV 35S启动子的pINT121，定名为pN，作为阴性对照。
3.构建增强型启动子De-InvP与GUS-Int报告基因的融合体
以pBI221-S1质粒上S1片段为模板，利用两组引物PCR，一组是引物pro8和pro9(pro85’aattggatcctacaattaccaagaggc3’；pro95’aattccatggtaattatatgaagaatgtg3’)，扩增得到一个5’端酶切位点为BamHI，3’端含NcoI位点的A片段；另一组引物是pro4和pro10(pro45’aattaagctttacaattaccaagaggc3’；pro105’aattggatccgttcatgccaacgttctccaa3’)，扩增得到B片段。将A片段插入pBI221-S1质粒的BamHI和SmaI位点间，产生pBI221-A质粒。将B片段插入pBI221-A的HindIII和BamHI识别位点间，得到含有增强型启动子(包含B片段与A片段)与GUS融合基因的质粒pBI221-A-B。序列测定结果表明，该包含B片段与A片段的增强型启动子具有序列表中序列1的核苷酸序列，将该增强型启动子命名为De-InvP。
用HindIII和NcoI将增强型启动子De-InvP与GUS融合基因从pBI221-A-B切下，插入pS1的HindIII和NcoI识别位点间，替换2.7kb启动子，定名pES。
4.真空渗透法检测2.7kb长转化酶启动子和增强型转化酶启动子De-InvP的活性(1)真空渗透法转化胡萝卜叶、茎组织1)胡萝卜无菌苗的培养胡萝卜种子经表面消毒后播种于高瓶中的1/2MS固体培养基上，培养基1cm厚，置于25℃，在16h光照、8h黑暗的昼夜节律下生长两星期左右，至四叶或五叶期(包括两片子叶)即可用作真空渗透实验的材料。
2)将阴性对照pN、阳性对照pINT121、pES和pS1转入农杆菌LBA4404，加50mg/L卡那霉素，30mg/L链霉素，28℃培养24h，离心收获菌体，重悬于过滤灭菌的5％(质量百分含量)蔗糖+0.01％(质量百分含量)Silwet L77溶液中，调整菌体浓度至OD600为0.1。真空渗透时向培养胡萝卜幼苗的高瓶中加入农杆菌悬液至完全没过植株，然后置于抽真空装置中，抽真空为90kPa，保持3min后解除，倾去菌悬液，植株继续培养3-4天，检测目的基因产物活性。
(2)真空渗透法转化胡萝卜直根组织1)选取12周的胡萝卜直根材料，自来水清洗后再用无菌水冲洗3遍，将直根切成1mm厚的片即可作为转化的材料。
2)农杆菌的培养和处理同胡萝卜叶转化方法，转化后的胡萝卜根片用含100mg/L羧卞青霉素的无菌水仔细清洗后放于完全浸湿的滤纸上，于25℃，16h光照、8h黑暗的昼夜节律下，培养3-4天后用于GUS检测。
(3)GUS活性的荧光检测A、溶液GUS提取缓冲液
GUS测定缓冲液在GUS提取缓冲液中加入MUG使其终浓度为1mM MUG。
B、步骤①取30mg胡萝卜直根加入100μl GUS提取缓冲液，研磨，4℃，13,000g离心30min，取上清液，即为可溶性蛋白。
②取可溶性蛋白10μl加入100μl GUS测定缓冲液中，于37℃进行GUS反应。
③在GUS反应0分钟，60分钟和120分钟时，分别加入110μl的0.2M Na2CO3终止反应。
④将1mM 4-MU贮藏液用0.2M Na2CO3稀释成1000nM，500nM，250nM，125nM，62.5nM，31.25nM等6个浓度梯度的标准溶液，用于制作GUS活性荧光检测的标准曲线。
⑤取220μl的标准溶液和220μl样品反应终止液分别加入到专门用于荧光检测的opaque microtiter plate上。使用FLUOstar OPTIMA(BMG TCHNOLOGY)仪器，在激发光365nm，发射光455nm条件下测定GUS反应溶液所产生的荧光强度。
⑥取可溶性蛋白10μl，用Bio-Rad Protein II染液测定样品的蛋白浓度(参照产品说明书进行)。
⑦参照Jefferson等(1987)所述的方法计算GUS的比活性，单位为pmol 4-MU/min.mg可溶性总蛋白。
结果如图1所示，表明转阴性对照pN的胡萝卜直根中GUS的活性是2.7pmolMU/mg protein/min，转阳性对照pINT121的胡萝卜直根中GUS的活性是21.9pmolMU/mg protein/min，转pES的胡萝卜直根中De-InvP驱动表达的GUS的活性是49.3pmol MU/mg protein/min，转pS1的胡萝卜直根中2.7kb长启动子InvP驱动表达的GUS的活性是16.7pmol MU/mg protein/min，De-InvP的活性是2.7kb长启动子InvP的2.95倍。
(4)组织染色法证明转化酶启动子的组织特异性1mM X-Gluc测定缓冲液
(4℃避光保存)。
步骤1)用100mM磷酸缓冲液(pH7.0)并加入100ug/ml的chloramphenicol或500ug/ml的carbenicillin漂洗真空渗透法转化后的植物组织。
2)浸入X-Gluc测定缓冲液，抽真空3-5分钟后37℃反应8小时。
3)用70％乙醇37℃脱色。
4)将脱色完毕的材料置于含10％甘油的水滴中，压上盖玻片。
5)显微镜(Olympus，BX51)或解剖镜(Olympus，SZX9)观察并照相。
结果表明在转化pES和pS1的胡萝卜中，转化酶启动子De-InvP和InvP驱动GUS在胡萝卜直根中特异表达(图2A)；而在转pINT121的胡萝卜中，CaMV 35S启动子驱动GUS在胡萝卜的叶、茎和直根中组成型表达(图2B)。
序列表<160>3<210>1<211>404<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1tttacaatta ccaagaggct ctctataatt cacttacgga aatacaatgc cgacaacttt 60gacgatgtaa agataaattt ggcactaacg caaacttaat taacattact atattagtat120tattggagaa cgttggcatg aacggatcct acaattacca agaggctctc tataattcac180ttacggaaat acaatgccga caactttgac gatgtaaaga taaatttggc actaacgcaa240acttaattaa cattactata ttagtattat tggagaacgt tggcatgaac aagcatgtaa300taataggata gtatgatctc tacatccaca tgtacctcta tatatataga tgctcttttg360tagtgttaat tcacattatc atacacacat tcttcatata atta 404<210>2<211>2766<212>DNA<213>胡萝卜(Daucus Linn)<220>
<223>
<400>2gtcgactccc acatagcaat ctataactac ctttgtttgc aacaattttt atttttttta 60atactatata aaccatcttc acttatcgtt gcagaagaac ggcaccactg agttagaaat120caagcaagag aactatcacc agagaggagg ggagttgtgg tattgagaga gaggaggttg180tgtttagatg atccaaaatc ctacaatcta tagggttatt tataggtgca gagagacttg240tgtgctactc tttcccataa ttaaataatc tgaaacaaaa tcagattaaa actttcaaac300tattatattc cataaataat ctgaaataaa atcagattct gaaacttgct tctaatatat360ccgaaactta aaaaggtagt tttaattttt gatatttttc atccaaaaat tccagaaaat420tagaaaaata gaatggagcg atgtgagagg cgccacctac acgcccctcg cttctctttt480atataaataa attaaataat ctgaaacaaa atcagattaa aactttcaaa ctactatatt540tcataaataa tttgaaataa aatcagattc tgaaacttcc ttctaatata tccgaaactt600
aaaaaggtag ttataatttt tgatattttt catccaaaaa ttccagaaaa ttagaaaaat 660agaatggagc gtgtgagagg cgccacctac acgcccctcg cttcttcttt atataagtat 720attgatttca gaaaatcttt ccctcaaaga tgctacataa ggtgtgtcta agttgacata 780aatcctgcta tttctagtcg tggagaagcc aatgttatct gcatagaata aataattaaa 840aaaaatagca caaatattaa taataataaa atatttatag actatagttc aagattattg 900tcatcagcta tcgtggcata ttaatttgta actattgaaa tcaattacaa cggaaatcaa 960accatctgac cctttttctc cgaaacatgg aatctggtgt agtaggaata ctgtatcata1020tggtgttcat tgtagacaca gggtcagtca taggggccgt ttgggttagc ttaaaagaag1080tgatttctta cttaaattag aaaagtagag tagaagtgag aagtaaataa attaataaag1140tgtttggaaa agaagcagaa gctgtgagag agaagctagc attctcaact ttttaaaaat1200gcttctgctt atttacacaa acgggtcaag agaagcagaa gacggaagca gctcctactt1260ccgggaaaca aacaccccca tagtgactat tcactcgacg aattaggtgg gttctattga1320cataaacatg gcaaaatcaa gtgcggagaa cttggaaatc atacaaattt taagaactgg1380ttagaaaaat agaatagaat catctccatt tttttttaaa gaaagaatca tctccgttta1440ataattttct aaaaaagaat tataaaaaat aatagacgat atggagaaga caaataagct1500caaaataaat tccgtgtgtt aaattttatg atatctggcc tcaatttaca gaggttgatt1560tgaaatagtt taaaatcctg atctgatttt gatattttga aaaaggaata ctttctgttt1620ttgatataca tctttcttaa attagtttaa aatcctgatt ttgattttga tattttgaaa1680aggaatactt ttttttaaaa aaaggaatac tttttttaaa atatttttca tccaaaaatt1740tcagaaaatt agaaaaatag aacggagctc tctgagaggc gccccatgct tctcctttat1800ataagtatat tgatgatttg taagaatcta gtaattgatt tataatctgg tataatataa1860taactggctt acttaataag ttgatgagga ccgttagatt gaattttcta tattgattat1920attttaaaat tagatcacgt caataacgta ttataataaa ttattaataa acacacataa1980tatattattg attattatat tacatatgtg catcacatcg tgcgaagcta gacgctagta2040taaatttaat ttaattatga caaaagatta attcgtgaca atttaaacta caaataacta2100aaactaaaat attctaagga aatttggatc cggagcagtc ccgggtacac accgcatatt2160cttataagga actacccctt ccatctcaaa ttagatgatc tcgttgactt tggacacaca2220atttaaggtt cattaaccgg atagctacgt gacttatttt taaaatttta gttttgcaaa2280taaaaattta aatatgaaat tttcatttaa aaaaaataaa aaataaattt cggaagtaga2340tggtcaatgc acctaaagtt acttgcccaa agtcaagtaa cccatctaat ttgggatgga2400ggtagtatta cataatgaaa taaacgatac taattactta ttattgatag aattattgga2460agttaattaa ttcaattatg ccgaatacta tagatagcgt gagtctcttt acaattacca2520agaggctctc tataattcac ttacggaaat acaatgcccg acaactttga cgatgtaaag2580ataaatttgg cactaacgca aacttaatta acattactat attagtatta ttggagaacg2640ttggcatgaa caagcatgta ataataggat agtatgatcc tctacatcca catgtacctc2700tatatataga tgctcttttg tagtgttaat tcacattatc atacacacat tcttcatata2760attaaa 2766<210>3<211>189<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gtaagtttct gcttctacct ttgatatata tataataatt atcattaatt agtagtaata 60taatatttca aatatttttt tcaaaataaa agaatgtagt atatagcaat tgcttttctg120tagtttataa gtgtgtatat tttaatttat aacttttcta atatatgacc aaaatttgtt180gatgtgcag189
权利要求
1.胡萝卜液泡转化酶II基因启动子，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1杂交的核苷酸序列；3)与序列表中的SEQ ID №1具有90％以上同源性且可驱动基因在胡萝卜直根中表达的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于所述胡萝卜液泡转化酶II基因启动子具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于所述胡萝卜液泡转化酶II基因启动子具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
4.权利要求1、2或3所述的胡萝卜液泡转化酶II基因启动子在植物基因工程中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为在胡萝卜直根中表达外源蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种胡萝卜液泡转化酶II基因启动子及其应用。本发明的胡萝卜液泡转化酶II基因启动子，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1杂交的核苷酸序列；3)与序列表中的SEQ ID №1具有90％以上同源性且可驱动基因在胡萝卜直根中表达的DNA序列。本发明的胡萝卜液泡转化酶II基因启动子可在胡萝卜直根中特异表达外源基因，且具有较高的生物活性，可用于在胡萝卜直根中表达外源蛋白。
文档编号C12N15/82GK1831129SQ20061006516
公开日2006年9月13日 申请日期2006年3月23日 优先权日2006年3月23日
发明者陈晓英, 于翠梅, 方荣祥 申请人:中国科学院微生物研究所