专利名称：真菌培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌培养基，具体涉及对表浅真菌和生物体内深部感染的真菌进行鉴别、计数分离培养和传代培养的真菌培养基。
背景技术：
世界上微生物间的多样化和变异性及物种生境的生态复杂性，带来了探讨、了解微生物的广泛性、复杂性和长久性。微生物的一个物种就是一个独特的基因库，有的真菌基因可达1万个。微生物的新陈代谢是错综复杂的生命活动，在长期的生物进化中，形成了一套完整统一的灵敏调节系统，依靠这种调节系统，严格控制各种代谢活动。有条不紊协调进行并灵活适应环境。尤其真菌，不同培养基，因培养基质量不同，也可影响其生长和产生变异。
真菌是最容易发生变异的微生物，变异后的菌往往给鉴定带来很大的困难，这也是造成当今真菌鉴定混乱的原因之一。尤其是深部真菌更易变异，在组织中基本停止生长，仅是生存。其原因一般呼吸分为有氧呼吸和无氧呼吸两种，前者以氧分子为最终电子受体，可产生三分子ATP。一分子葡萄糖可产生38分子ATP。后者以非氧化物质如硝酸盐、延胡素酸等为最终电子受体，一分子葡萄糖经糖酵解途径，只产生2分子ATP，由于氧气不足，深部真菌只形成菌算产生变异。只有高质量的培养基经过反复接种，才能把深部真菌还原。因此生物体内深部感染的真菌非常难于培养成功。
由于真菌如此复杂、多变，对其培养与鉴别的手段也提出了更高的要求。需要有快速培养并能初步鉴别不同真菌类别。而且对鉴别性培养基来说，培养基是否有准确性尤为重要。从而达到快速分型、诊断，准确治疗，缩短真菌感染治疗时间，提高治愈率。
而真菌培养基研究的现状比较落后，国内外常规使用的真菌培养基是Sabourand创立的，经过几代人的努力，后经依蒙斯氏改造完善，仍沿用至今。除了92年，由日本人五岛提出了新的鉴别培养基外，直到当今真菌培养基的种类十分匮乏。因此，研制新的更好的培养基成为当前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供适应绝大多数真菌生长的新型培养基。本发明的另一目的是提供可进行真菌鉴定分离、传代保存等各种不同要求的培养基。
本发明运用生物化学，微生物学及无机、有机、分析化学和荧光技术的原理，对不同的碳源、氮源、无机盐类、维生素、生长促进剂等诸类营养组分的组合进行筛选，对培养基的PH值、离子强度、氧化-还原电势、表面张力、气体环境等物化因子进行了比较，研究出了适应绝大多数真菌生长的五种不同的彩色培养基。
新建培养基质量的优劣，直接影响到观察和鉴别的效果，有必要建立培养基的准确性试验和灵敏性试验，变异菌株的还原复苏试验等。而且，国内对培养基的评价，一般是传统方法和新建立的方法二组试验。本发明采用多种混合菌种在多种培养基的比较试验，同时还进行了多种不同浓度含量的培养基与不同浓度同种标准菌株的试验。扩大了试验的范围，使测试结果更加科学化。
本发明根据绝大多数的真菌生长要求选择多种有利于真菌生长的营养物质，反复对比配组，根据不同的要求，研制了不同用途的系列真菌培养基。
本发明提供的真菌培养基的主要成分为(以配制100ml为例)硫酸镁0.05-0.1g，氯硝铵0.1-0.5g，四氯四碘荧光素钠0.001-0.0001g，琼脂1.3-1.7g，蒸馏水加至100ml。
上述培养基(以下称为基础液)中还可加入以下一种或多种成分，用于制备各种不同目的的真菌培养基如每100ml基础液加入葡萄糖1-2g和0.1％氯霉素0.1-0.5ml，可作为真菌荧光分离(计数)培养基。主要特点菌落初生长期可呈单个，有利于菌落计数和空气采样计数；每100ml基础液中加入酵母膏2-4g，蔗糖1.5-2g，可作为酵母膏荧光分离鉴定培养基。适用于嗜干性霉菌的分离，特别是浅部真菌的培养；每100ml基础液中加入五氯硝基0.01-0.05g，可作为青霉菌荧光分离鉴别培养基，用于青霉菌的分离与鉴别；每100ml基础液中加入磷酸二氢钾0.01-0.04g，硫酸亚铁0.001-0.005g，氯化钾0.05-0.1g，硝酸钠0.3-0.6g，用于传代保存和变异菌株的还原；每100ml基础液中加入蛋白胨0.5-1g，甘油1-4ml，可用于分离鉴别绿脓杆菌生长。
本发明以上所述的各种培养基所需配方成分，均可通过市售方式购到。
以上每一种培养基不仅各自具有不同的培养优势，且均可用于培养普通培养基难于培养成功的生物体内深部感染的真菌，它们的共同特点是1.培养基制备操作方便，不需特殊设备2.真菌生长迅速3.真菌产生的色彩鲜亮，便于观察。
本发明提供的真菌培养基的主要优点如下1、组方简单，利于推广应用；2、操作方便，不需特殊仪器设备3、应用范围广泛本发明的系列彩色培养基可用于研究真菌营养生理、代谢途径、生化特征、鉴定分离、遗传变异、空气采样、耐药机制，它为真菌学的发展与防病治病创造了条件。
具体实施例方式实施例1真菌培养基(一)配方硫酸镁0.05g，氯硝铵0.5g，四氯四碘荧光素钠0.001g，琼脂1.3g，蒸馏水加至100ml。
制备方法将配方中各成分混合均匀，调节PH至5.6，混匀后低压灭菌，冰箱4℃保存即可。
其特点是真菌生长迅速，培养基色彩鲜亮，便于观察。
实施例2真菌培养基(二)配方硫酸镁0.1g，氯硝铵0.1g，四氯四碘荧光素钠0.0005g，琼脂1.7g，蒸馏水加至100ml制备方法同实施例1。
实施例3真菌荧光分离(计数)培养基配方硫酸镁0.1g，氯硝铵0.1g，四氯四碘荧光素钠0.0002g，琼脂1.3g，葡萄糖1.5g，0.1％氯霉素0.3ml，蒸馏水加至100ml。
制备方法调PH至5.6-6.0。混匀，低压灭菌冰箱4℃保存。
主要特点菌落初生长期可呈单个，有利于菌落计数和空气采样计数。
实施例4酵母膏荧光分离鉴定培养基配方硫酸镁0.08g，氯硝铵0.2g，四氯四碘荧光素钠0.0002g，琼脂1.4g，酵母膏3g，蔗糖1.7g，蒸馏水加至100ml。
制备方法将配方中各成分混合均匀，调PH至6.0-6.5，混匀，低压灭菌冰箱4℃保存。
主要特点适用于嗜干性霉菌的分离，特别是浅部真菌的培养。
实施例5青霉菌荧光分离鉴别培养基配方硫酸镁0.06g，氯硝铵0.5g，四氯四碘荧光素钠0.0005g，琼脂1.7g，五氯硝基0.03g，蒸馏水加至100ml。
制备方法将配方中各成分混合均匀，低压灭菌冰箱4℃保存。
主要特点用于青霉菌的分离与鉴别。
实施例6真菌荧光传代培养基配方硫酸镁0.05g，氯硝铵0.3g，四氯四碘荧光素钠0.0001g，琼脂1.4g，磷酸二氢钾0.03g，硫酸亚铁0.003g，氯化钾0.08g，硝酸钠0.5g，蒸馏水加至100ml。
制备方法将配方中各成分混合均匀，低压灭菌冰箱4℃保存。
主要特点用于真菌传代保存和变异菌株的还原。
实施例7铜绿假单胞荧光培养基配方硫酸镁0.07g，氯硝铵0.1g，四氯四碘荧光素钠0.0002g，琼脂1.5g，蛋白胨0.8g，甘油3ml，加蒸馏水至100ml。
制备方法将配方中各成分混匀，调PH7.6，低压灭菌，4℃保存。
主要特点分离绿脓杆菌生长，不允许其它革兰氏阴性杆菌生长，绿脓杆菌呈绿色反应，绿色明显，易观察。
实施例8四氯四碘荧光素钠浓度试验一、试验目的找出荧光材料四氯四碘荧光素钠在真菌培养基中的最佳浓度。
二、试验方法配方硫酸镁0.05g，氯硝铵0.5g，琼脂1.3g，蒸馏水加至100ml。真菌培养基中加入不同浓度(见表1)的四氯四碘荧光素钠。制备方法将配方中各成分混合均匀，调节PH至5.6，混匀后低压灭菌，冰箱4℃保存即可。接种红曲霉菌标准株0.1ml，(菌种编号20492(A)，菌悬液浓度为1.0-2，)每天观察生长情况。
三、试验结果红曲霉菌在真菌培养基中呈红色。
当四氯四碘荧光素钠浓度过高时，色泽太深，易与其他菌的鉴别混淆；当四氯四碘荧光素浓度过低，色泽过浅，又不利于对真菌和绿脓杆菌的鉴别。
实验证实四氯四碘荧光素钠最佳含量范围是0.001-0.0001g，见表1。
表1四氯四碘荧光素钠浓度试验结果
实施例9混合菌液在各种培养基上生长对比试验(特异性试验)一、试验目的比较本发明培养基及几种其他6种细菌培养基对四种细菌(大肠杆菌、绿脓杆菌、非发酵菌、枯草杆菌)和一种真菌(类白色念珠菌)的生长情况分析。
二、试验方法各种菌的标准株菌悬液为1.6×10-2/ml，分别取0.1ml均匀涂在各种培养基中，细菌类放置温箱37℃；真菌类放置温箱28℃培养，1天后观察结果。
三、试验结果见表2。
表2几种培养基对比试验
有菌生长+ 无菌生长-四、结论本发明的培养基对绿脓杆菌和真菌的培养有特异性。
实施例10铜绿假单胞荧光培养基对绿脓杆菌生长对比试验(准确性试验)一、试验目的比较本发明培养基与几种传统培养基的对绿脓杆菌生长情况。
二、试验方法绿脓杆菌标准株菌悬液为1.6×10-2/ml，分别用本发明实施例7的铜绿假单胞荧光培养基与6种培养基连续培养五次，求平均值，分别记录24小时菌落生成的初颜色和48小时菌落生成的终颜色。
三、试验结果可以看出，七种培养基中，只有NAC培养基与铜绿假单胞荧光培养基有特异性。且后者在色泽反映上，又胜NAC培养基。菌落数多，平均直径大，且绿色反映更为明显，菌落初期就呈现深绿色，便于早期观察。见表3。
四、结论本发明的培养基对绿脓杆菌的培养效果最好。
表3绿脓杆菌在几种培养基上的生长情况
实施例11培养基灵敏性试验一、试验目的比较本发明培养基与几种传统培养基的灵敏性。
二、试验方法将不同各类真菌标准(将真菌稀释至1∶12-1∶512)分别接种在传统的沙氏培养基和实施例1荧光培养基中，37℃培养，每天观察，记录菌落初出时间、生长过度、菌落大小、菌落表面形态、菌落颜色、边缘下沉现象、色泽反应(包括最初颜色和最终颜色粘度)等生长情况，进行比较。
三、试验结果本发明的真菌培养基对多种真菌生长速度及颜色反应都比沙氏好，仅在毛霉菌、伞枝黎头霉中，沙氏要比荧光生长好。结果见表4。
表4几种真菌在两种培养基中生长情况对比
注表中，“荧光”表示实施例1荧光培养基，沙氏表示传统的沙氏真菌培养基四、结论本发明的真菌培养基对多种真菌培养效果较传统的沙氏真菌培养基灵敏性好。
实施例12变异菌株还原试验一、试验目的检测本发明真菌传代培养基的灵敏度。
二、试验方法毛霉菌标准株和变异毛霉菌(菌号为20141菌株)，制备成1.0×10-2/ml的菌悬液，取0.1ml分别均匀涂在沙氏培养基和本发明荧光传代培养基中，放置温箱28℃培养，7天后转种第2代；再7天后，依次转种第3代；再7天后，依次转种第4代。记录每天的观察结果。
三.试验结果在沙氏培养基培养1-6代毛霉菌标准株无变化；菌号为20141的变异毛霉菌因有些变异，在沙氏培养基上经过三次转种传代，一直为白色菌落，未能还原。
在荧光传代培养基培养1-6代毛霉菌标准株无变化；菌号为20141的变异毛霉菌经过三次转种传代，在第四次第七天，终于传代成功。培养出毛霉菌，还原成四周白色、中心烟色的典型总状毛霉菌菌落。
四.结论本发明真菌传代培养基的灵敏度较沙氏培养基好。
权利要求
1.一种真菌培养基，配制100ml培养基的配方如下硫酸镁0.05-0.1g，氯硝铵0.1-0.5g，四氯四碘荧光素钠0.001-0.0001g，琼脂1.3-1.7g，蒸馏水加至100ml。
2.权利要求1所述的真菌培养基，每100ml培养基还含有葡萄糖1-2g和0.1％氯霉素0.1-0.5ml。
3.权利要求1所述的真菌培养基，每100ml培养基还含有酵母膏2-4g，蔗糖1.5-2g。
4.权利要求1所述的真菌培养基，每100ml培养基还含有五氯硝基0.01-0.05g。
5.权利要求1所述的真菌培养基，每100ml培养基还含有磷酸二氢钾0.01-0.04g，硫酸亚铁0.001-0.005g，氯化钾0.05-0.1g，硝酸钠0.3-0.6g。
6.权利要求1所述的真菌培养基，每100ml培养基还含有蛋白胨0.5-1g，甘油1-4ml。
全文摘要
本发明涉及一种真菌培养基。配制100ml培养基的基础配方为硫酸镁0.05－0.1g，氯硝铵0.1－0.5g，四氯四碘荧光素钠0.001－0.0001g，琼脂1.3－1.7g，蒸馏水加至100ml。在上述配方中加入一种或多种其它成分，可以制备各种不同目的的真菌培养基。本发明的真菌培养基可以对表浅真菌和生物体内深部感染的真菌进行鉴别、计数分离培养和传代培养的真菌培养基。特点是培养基制备操作方便，不需特殊设备；真菌生长迅速；培养基色彩鲜亮，便于观察。
文档编号C12N1/14GK1834223SQ200610065878
公开日2006年9月20日 申请日期2006年3月29日 优先权日2006年3月29日
发明者李洪敏 申请人:李洪敏