专利名称：玉米真实性检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测植物品种真实性的试剂盒，更具体地说，本发明涉及一种检测玉米真实性的试剂盒。
背景技术：
玉米真实性鉴定是玉米种子质量控制和品种权保护的依据。随着目前社会上玉米品种的逐年增多，鱼龙混杂现象严重，使用常规的形态鉴别难以进行准确的判定，造成管理的困难。
目前国内外玉米真实性鉴定仍以形态鉴定为主，参考同工酶和种子贮藏蛋白电泳图谱。形态性状的表现受环境影响较大，鉴定工作量大、周期长、受季节限制；同工酶和种子贮藏蛋白多态性不够丰富，此外同工酶存在组织和器官特异性，取材有严格的一致性要求，所以鉴定结果不够稳定。本发明人研究了利用SSR(simple sequence repeat)引物对检测玉米真实性的鉴定方法，在2003年提出了中国专利申请第200310117180.3号，在该试剂盒(此后有时也将它称为现有的试剂盒)中包含了20个引物，这20个引物是从网上直接下载的引物序列，没有进行特殊的设计，因此它们存在的最大问题是所选引物在染色体上不是均匀分布的，造成某些引物位点间存在不同程度的连锁；其次是引物不适合组合多重PCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction，多重聚合酶连锁反应)的要求，这些引物需要单个地进行PCR扩增和检测，造成工作量大。
发明内容
本发明为了解决现有玉米真实性检测试剂盒存在的引物在染色体上分布不均匀和不适合组合多重PCR的要求的问题，经过大量的引物筛选，提供了一种包含20个引物的试剂盒及其检测方法。
具体技术方案如下。
本发明提供的玉米真实性检测试剂盒包含下列20个引物
本发明所使用的引物的制备方法没有特别的要求，可以采用已知的常规方法合成。根据本发明提供的上述引物序列，可以利用DNA合成仪合成。如果自己有设备，可以自己合成，如果没有，可直接让引物合成公司，由引物合成公司合成，也就是说，只要知道引物序列，就可以得到该引物。如果采用普通聚丙烯酰胺凝胶电泳，则根据引物序列直接合成即可。如果采用毛细管电泳五色荧光检测系统，则需为每套引物序列标记上四种不同的荧光。
本发明的玉米品种真实性检测用SSR引物组合试剂盒是通过对大量的引物筛选确定的，为了保证引物在玉米染色体上分布均匀，在玉米10条染色体的长臂、短臂各选取一个多态性高、带型容易统计的引物位点，累计20个引物位点。为了使其能够进行多重PCR反应，在原引物位点的基础上利用引物设计软件按照统一的扩增条件重新设计，P01-P10(每条染色体上选取1个引物)作为第一套组合，P11-20(每条染色体上选取1个引物)作为第二套组合。
使用本发明的玉米真实性检测试剂盒检测玉米品种有下列三种方法。
第一种玉米真实性检测方法是采用毛细管电泳结合五色荧光检测系统，其中，首先将上述20个引物分成2套组合，P01-P10作为第一套组合，P11-20作为第二套组合，每套组合按照如下三重或两重组合标记4种不同的荧光。
第一套10重组合
第二套组合
然后采用常规方法进行DNA提取，每套组合进行10重PCR反应，反应产物使用毛细管电泳结合五色荧光检测系统进行检测，其中引物共占用4种不同颜色荧光，分子量内标占用1种颜色荧光。
第二种玉米真实性检测方法是采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染检测，其中，首先将上述20个引物分成下述8套组合第1套组合，3重PCR引物Phi065k9、Bnlg161k6、Umc1705k2扩增范围399-419、263-319、144-201第2套组合，3重PCR引物Bnlg1754k5、Bnlg1450k2、Umc1741k8扩增范围421-465、288-376、141-203第3套组合，2重PCR引物Bnlg439w1、Bnlg1792k8扩增范围319-385、192-250第4套组合，2重PCR引物Phi072k4、Bnlg125k1扩增范围413-433、219-327第5套组合，3重PCR引物bnlg2331k6、umc2105k3、bnlg1191k6扩增范围394-440、286-330、154-215第6套组合，3重PCR引物bnlg2291k4、phi080k7、phi116k3扩增范围370-410、279-325、168-215第7套组合，2重PCR引物umc1225k5、phi299852k1
扩增范围265-310、137-200第8套组合，2重PCR引物umc2163w3、mmc0191k5扩增范围290-365、130-213然后采用常规方法进行DNA提取，每套组合根据上述分别扩增三重或二重，再使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染检测，完成所有20个引物的检测。
从上述检测方法看到，第一种检测方法仅需2次PCR反应就可完成所有20个引物的检测，第二种检测方法仅需8次PCR反应就可完成检测。
第三种方法是使用权利要求1所述玉米真实性检测试剂盒中的2～20个引物，采用常规方法进行DNA提取，使用所述玉米真实性检测试剂盒中单个引物分别进行PCR扩增，然后采用常规的检测技术进行检测，能够得到结论就停止检测。从后面描述的判定方法可以看到，如果使用两种或两种以上的引物就可以判断两个品种是不同的，那么就可以停止检测过程，直接得到结论。这种方法特别适合于已经初步判定两种品种是不同品种的情况，这样可以节省物力。
本发明的检测方法中的DNA提取可以根据现有技术中提供的各种方法获得质量符合PCR扩增要求的DNA。试验材料可以为种子、幼苗、叶片等。
本发明的检测方法中的PCR扩增方法具体如下反应体系反应液体积为20μl，组分配制应符合下表的规定。
表1PCR扩增反应体系
备注引物量为每个引物0.25μl，如果采用10重PCR，即加入的引物总量为2.5μl；同理，如果采用3重PCR，即加入的引物总量为0.75μl，采用2重PCR，即加入的引物总量为0.5μl。
反应程序94℃预变性5min，1个循环；94℃变性40s，68℃退火35s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
本发明的检测方法中的电泳检测推荐下列两种电泳检测方法(1)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染检测；(2)毛细管电泳结合荧光检测。
两种检测方法所得结果均有效，具体方法如下。
(1)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染检测1清洗玻璃板用自来水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95％乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上涂上0.5ml亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5ml剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。
2组装电泳板待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。
3灌胶在100ml 4.5％PAGE胶中加入TEMED和25％过硫酸铵各100μl，迅速混匀后灌胶。待胶流动到下部，在上部轻轻的插入梳子，使其聚合至少1h以上。灌胶过程中防止出现气泡。
4预电泳在正极槽(下槽)中加入1×TBE缓冲液600ml，在负极槽(上槽)加入预热至65℃的1×TBE缓冲液600ml，拔出梳子。90W恒功率预电泳10-20min。
5变性在20μl PCR样品中加入4μl 6×加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序95℃变性5min，4℃冷却10min以上。
6电泳用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，插入样品梳子。每一个加样孔点入5μl样品。80W恒功率电泳至上部的指示带(二甲苯青)到达胶板的中部(约40min)。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶会紧贴在长板上。
7银染7.1固定固定液中轻轻晃动3min；7.2漂洗双蒸水快速漂洗1次，不超过10s；7.3染色染色液中染色5min；7.4漂洗双蒸水快速漂洗，时间不超过10s；7.5显影显影液中轻轻晃动至带纹出现；7.6定影固定液中定影5min；7.7漂洗双蒸水漂洗1min。
(2)毛细管电泳结合五色荧光检测1变性将PCR产物稀释30倍，在96孔板的每个孔中分别加入9μL甲酰胺、0.1μL内标和1μL稀释后的PCR产物，在PCR仪上运行变性程序95℃变性5min，4℃冷却10min以上。
2电泳将样品板取出后，3000rpm短甩离心，于遗传分析仪(如ABI3730XL遗传分析仪)上进行毛细管电泳。预电泳15KV，2min；电泳15KV，20min。
3数据搜集分析用数据收集软件收集原始数据，用片段分析软件对原始数据进行分析。
使用本发明的玉米品种真实性检测试剂盒检测和判定玉米品种真实性的标准如下
用本发明的引物进行检测，获得待测品种在20个引物位点的DNA指纹谱带数据，利用20个位点的DNA指纹谱带数据进行品种间比较a)品种间差异位点数≥2，判定为不同品种；b)品种间差异位点数＝1，判定为相近品种；c)品种间差异位点数＝0，判定为疑同品种。
从上述判定标准可以看到，当出现品种间差异位点数≥2时，就可以停止检测，给出检测玉米是不同品种的结论。
本发明的玉米真实性检测试剂盒与现有的玉米真实性检测试剂盒相比具有显著的有益效果。
首先从整套引物组合来看，它具有以下特点(1)从引物在染色体上的分布看，现有的引物组合在第3、4、6、8染色体选取了3～4个引物位点，且某些位点落在相近区域，如在第6染色体的6.00区域选取了3个引物位点；在第2染色体上选取了2个引物位点，但相距较近；在第1、7、9、10染色体上只分别选取了一个引物位点；在第5染色体上没有选取引物位点，因此没有遵循在玉米染色体上均匀分布的原则，造成某些引物间连锁比较紧密。而本发明的引物组合在玉米10条染色体的每条染色体上选取2个引物(长臂和短臂各选取1个引物)，保证了引物在玉米染色体上分布均匀。
(2)从引物组合多重PCR的能力看，现有引物组合中，扩增产物大小除了bnlg125在300bp以上，bnlg439和bnlg162在200bp以上外，其它17个引物扩增产物大小均在100-200bp左右，不同引物的产物大小范围有交叉，无法组合多重PCR；而且不同引物的TM值相差较大，最低的仅66.6，最高的达到82.1，而引物TM值的大小不同，则引物扩增程序选用的最适退火温度不同，因此，这套引物不适合按照统一的程序进行多重PCR扩增，只能进行单引物扩增，所以，完成所有20个引物的检测需要进行20次PCR反应。而本发明的引物组合的所有引物均是按照统一的条件设计的，引物的TM值均在73-76度之间，扩增产物大小是按照组合多重PCR的要求特殊设计的，同一套组合内的引物之间没有明显的相互作用影响扩增，如果采用毛细管电泳四色荧光检测系统，每组(三重或两重)标记不同的荧光，则每套组合均可以组成10重PCR，仅需2次PCR反应就可完成所有20个引物的检测，如果采用普通聚丙烯酰胺凝胶电泳检测系统，则可按提供的组合方式分别扩增三重和二重，仅需8次PCR反应就可完成检测。因此，比现有引物组合扩增效率大大提高。
表2本发明的引物
注*bin代表所在染色体区域；**U、L、P分别代表上游引物序列、下游引物序列、扩增产物序列的TM值。
表3现有的引物
然后从单个引物看，它具有以下特点(1)在本发明的引物组合和现有的引物组合中有7个引物扩增的多态性位点是相同的，即bnlg439、bnlg125、phi072、bnlg161、phi116、phi080、phi065，但现有的引物是直接下载的网上公开的引物序列，这些引物不是按照相同的扩增条件设计的，不同引物之间TM值相差较大，如bnlg125上下游序列TM值为66.6和67.9，而bnlg589上下游序列TM值为82.1和80.3，除了phi080外，其它6个引物TM值均没有设计在73-76度范围内，而本发明的引物均按照相同的扩增条件设计，TM值均设计在73-76度范围内，此外，对phi080，尽管现有引物的TM值符合设计要求，但为了组合多重PCR的需要，现有引物的扩增产物大小不符合设计要求，因此，对该引物也进行了重新设计，使其扩增产物大小在规定的范围内。
(2)在本发明的引物组合和现有的引物组合中有13个引物扩增的多态性位点是不同的，之所以没有选用与原引物组合相同的位点，主要原因是现有引物在染色体上的分布不符合要求，即在每条染色体的长臂和短臂上各选取一个引物，其次，即使现有的那套引物组合中某些引物在染色体上的分布符合要求，也从引物设计难易、多态性高低、是否符合多重PCR组合的要求等方面进行比较后重新选用了新的引物位点，如umc1196在玉米第10染色体长臂10.07位置上，但在该引物位点上，bnlg1450k2比umc1196多态性高，且更容易设计出规定产物大小的引物来，因此，用bnlg1450代替了umc1196。
具体实施例方式
下面以实施例的方式进一步解释本发明，但是本发明不局限于下列实施例。
实施例1鉴定送检未知样品(代号A)是不是已知品种农大108(代号B)，操作流程如下(1)DNA提取将未知样品A及已知品种B的标准样品各提取5份个体DNA，提取方法如下剥取单粒干种子的胚，放入1.5ml离心管中，加入100μl氯仿后研磨，加入300μl DNA提取液(1mol/l Tris-HCl 50ml，0.5mol/lEDTA 50ml，5mol/l NaCl 50ml，SDS 7.5g，定容至500ml)，混匀后于10000rpm离心2min，吸上清液，将其加到预先装有300μl异丙醇和300μl NaCl溶液的1.5ml离心管中，待DNA成团后挑出，经70％乙醇洗涤后加入200μl TE缓冲液(1mol/l Tris-HCl 5ml，0.5mol/l EDTA 1ml，加HCl调pH至8.0，定容至500ml)，待充分溶解后备用。
(2)SSR引物合成采用荧光标记的引物。在上游引物的5’端分别标记四种不同的荧光FAM、VIC、NED、PET，荧光引物序列由美国ABI公司合成。
表4荧光引物序列
表4(续)荧光引物序列
(3)PCR扩增利用上面提供的SSR引物对组成两个10重PCR反应体系对DNA样品进行10重PCR扩增，10重PCR组合方式第一套10重组合
第二套10重组合
表510重PCR扩增反应体系
反应程序94℃预变性5min，一个循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环。PCR扩增在PTC-100PCR仪(MJ Research，Watertown，MA)上进行。
(4)毛细管电泳检测变性将PCR产物稀释30倍，在96孔板的每个孔中分别加入9μL甲酰胺、0.1μL内标和1μL稀释后的PCR产物，在PCR仪上运行变性程序95℃变性5min，4℃冷却10min以上。
毛细管电泳将样品板取出后，3000rpm短甩离心，于ABI3730XL遗传分析仪上进行毛细管电泳。预电泳15KV，2min；电泳15KV，20min。数据搜集分析用数据收集软件收集原始数据，用片段分析软件对原始数据进行分析。
(5)检测结果用这套引物进行检测，获得待测品种在20个引物位点的DNA指纹谱带数据，利用20个位点的DNA指纹谱带数据进行品种间比较，发现两个品种在bnlg439w1、phi065k9、bnlg125k1共3个引物位点指纹不同，根据判定标准，鉴定送检样品A不是农大108。
实施例2鉴定送检未知样品(代号A)是不是已知品种黄早四(代号B)，操作流程如下(1)DNA提取将未知样品A及已知品种B的标准样品各提取5份个体DNA，提取方法如下剥取单粒干种子的胚，放入1.5ml离心管中，加入100μl氯仿后研磨，加入300μl DNA提取液(1mol/l Tris-HCl 50ml，0.5mol/lEDTA 50ml，5mol/l NaCl 50ml，SDS 7.5g，定容至500ml)，混匀后于10000rpm离心2min，吸上清液，将其加到预先装有300μl异丙醇和300μl NaCl溶液的1.5ml离心管中，待DNA成团后挑出，经70％乙醇洗涤后加入200μl TE缓冲液(1mol/l Tris-HCl 5ml，0.5mol/l EDTA 1ml，加HCl调pH至8.0，定容至500ml)，待充分溶解后备用。
(2)SSR引物合成采用本发明的引物。引物序列由上海英骏公司合成。
表6本发明的引物序列
(3)PCR扩增利用上面提供的SSR引物对组成8个两重或三重PCR反应体系对DNA样品进行多重PCR扩增，多重PCR组合方式第1套组合，3重PCR引物Phi065k9、Bnlg161k6、Umc1705k2扩增范围399-419、263-319、144-201第2套组合，3重PCR引物Bnlg1754k5、Bnlg1450k2、Umc1741k8扩增范围421-465、288-376、141-203第3套组合，2重PCR引物Bnlg439w1、Bnlg1792k8扩增范围319-385、192-250第4套组合，2重PCR引物Phi072k4、Bnlg125k1扩增范围413-433、219-327第5套组合，3重PCR引物bnlg2331k6、umc2105k3、bnlg1191k6扩增范围394-440、286-330、154-215第6套组合，3重PCR引物bnlg2291k4、phi080k7、phi116k3扩增范围370-410、279-325、168-215第7套组合，2重PCR引物umc1225k5、phi299852k1扩增范围265-310、137-200第8套组合，2重PCR引物umc2163w3、mmc0191k5扩增范围290-365、130-213
表5多重PCR扩增反应体系
反应程序94℃预变性5min，一个循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环。PCR扩增在PTC-100PCR仪(MJ Research，Watertown，MA)上进行。
(4)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染检测1清洗玻璃板用自来水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95％乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上涂上0.5ml亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5ml剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。
2组装电泳板待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。
3灌胶在100ml 4.5％PAGE胶中加入TEMED和25％过硫酸铵各100μl，迅速混匀后灌胶。待胶流动到下部，在上部轻轻的插入梳子，使其聚合至少1h以上。灌胶过程中防止出现气泡。
4预电泳在正极槽(下槽)中加入1×TBE缓冲液600ml，在负极槽(上槽)加入预热至65℃的1×TBE缓冲液600ml，拔出梳子。90W恒功率预电泳10-20min。
5变性在20μl PCR样品中加入4μl 6×加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序95℃变性5min，4℃冷却10min以上。
6电泳用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，插入样品梳子。每一个加样孔点入5μl样品。80W恒功率电泳至上部的指示带(二甲苯青)到达胶板的中部(约40min)。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶会紧贴在长板上。
7银染7.1固定固定液中轻轻晃动3min；7.2漂洗双蒸水快速漂洗1次，不超过10s；7.3染色染色液中染色5min；7.4漂洗双蒸水快速漂洗，时间不超过10s；7.5显影显影液中轻轻晃动至带纹出现；7.6定影固定液中定影5min；7.7漂洗双蒸水漂洗1min。
(5)检测结果用这套引物进行检测，获得待测品种在20个引物位点的DNA指纹谱带数据，利用20个位点的DNA指纹谱带数据进行品种间比较，发现两个品种在所有20个位点指纹谱带完全相同，根据判定标准，鉴定送检样品A与已知品种黄早四为疑同品种。
权利要求
1.一种玉米真实性检测试剂盒，其特征在于，它包含下列20个引物
2.一种检测玉米真实性的方法，其特征在于，它使用权利要求1所述玉米真实性检测试剂盒，采用毛细管电泳结合五色荧光检测系统进行检测，其中，首先将上述20个引物分成2套组合，P01-P10作为第一套组合，P11-20作为第二套组合，将每套按照三重或两重分别标记不同的荧光，然后采用常规方法进行DNA提取，每套组合组成10重PCR，其中引物共占用4种不同颜色荧光，分子量内标占用1种颜色荧光，每套组合分别进行PCR反应，再使用毛细管电泳结合五色荧光检测完成所有20个引物的检测。
3.一种检测玉米真实性的方法，其特征在于，它使用权利要求1所述玉米真实性检测试剂盒，采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染进行检测，其中，首先将上述20个引物分成下述8套组合第1套组合，3重PCR引物Phi065k9、Bnlg161k6、Umc1705k2扩增范围399-419、263-319、144-201第2套组合，3重PCR引物Bnlg1754k5、Bnlg1450k2、Umc1741k8扩增范围421-465、288-376、141-203第3套组合，2重PCR引物Bnlg439w1、Bnlg1792k8扩增范围319-385、192-250第4套组合，2重PCR引物Phi072k4、Bnlg125k1扩增范围413-433、219-327第5套组合，3重PCR引物bnlg2331k6、umc2105k3、bnlg1191k6扩增范围394-440、286-330、154-215第6套组合，3重PCR引物bnlg2291k4、phi080k7、phi116k3扩增范围370-410、279-325、168-215第7套组合，2重PCR引物umc1225k5、phi299852k1扩增范围265-310、137-200第8套组合，2重PCR引物umc2163w3、mmc0191k5扩增范围290-365、130-213然后采用常规方法进行DNA提取，每套组合根据上述分别进行三重或二重PCR扩增，再使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染检测，完成所有20个引物的检测。
4.一种检测玉米真实性的方法，其特征在于，它使用权利要求1所述玉米真实性检测试剂盒中的2～20个引物，采用常规方法进行DNA提取，使用所述玉米真实性检测试剂盒中单个引物分别进行PCR扩增，然后采用常规的检测技术进行检测，能够得到结论就停止检测。
全文摘要
本发明的玉米真实性检测试剂盒及其检测方法属于植物品种真实性鉴定的技术领域，为了解决现有玉米真实性检测试剂盒存在的引物在染色体上分布不均匀和不适合组合多重PCR的要求的问题，经过特定的设计，提出一种包含20个引物的试剂盒，本发明的这20个引物在染色体上分布均匀、合理，符合进行多重PCR反应的要求，从而它们组成的引物组合的扩增效率高，大大地缩短了检测时间，提高了检测水平。
文档编号C12Q1/68GK101037709SQ20061006573
公开日2007年9月19日 申请日期2006年3月15日 优先权日2006年3月15日
发明者王凤格, 赵久然, 郭景伦 申请人:北京市农林科学院