专利名称：一种筛选可分解聚酯之微生物的培养基组合物及其方法
技术领域：
本发明涉及一种分离微生物的技术，特别涉及一种筛选可分解聚酯之微生物的培养基组成物及其方法。
背景技术：
每年全世界所产生的塑料废弃物约有140亿吨(Shimao，2001，Curr.opin.Biotechnol.12，242-247)，所以如何处理塑料废弃物是一个亟待解决的问题。为了减少塑料对环境所产生的冲击，先进国家开始对塑料废弃物进行更严格管制并要求进行回收，同时业界也在积极发展生物可分解(biodegradable)塑料作为替代方案。
关于生物可分解的研究，对可分解性高分子的相关报导，大部分是着重于酵素(Ebeling等人，1974，Eur.J.Biochem.47，91-97；Fukuzaki等人，1989，Eur.Polym.J.25，1019-1026；Williams等人，1982，J.Mater.Sci.17，1233-1246；Williams等人，1981，Eng.Med.10，5-7)或水解(Vert等人，1981，Makromol.Chem.Suppl.5，30-41；Vert等人，1994，Biodegradable Plasticsand Polymers.Elsevier Science，Amsterdam，p11-22)的分解，但有关微生物的分解却是比较少见。
对可分解高分子(例如聚酯)的微生物之筛选，由于无法克服高分子通常为不溶或难溶于水之瓶颈，因此目前并无具体可行的相关研究。
发明内容
本发明提供一种筛选可分解聚酯的微生物之培养基组成物，其包括添加有下列式I的界面活性剂及聚酯材之基本培养基CH3(CH2)nCOONa(式I)
其中，n为6-14之间的整数。
本发明也提供一种筛选可分解聚酯的微生物的方法，包括将待筛选之微生物样本置于添加有下列式I的界面活性剂及聚酯材作之基本培养基中培养CH3(CH2)nCOONa(式I)其中，n为6-14之间的整数；以及观察于上述培养基中微生物生长过程中分解圈的形成以判断并分离出可分解聚酯的微生物。
具体实施例方式
本发明是有关于一种筛选可分解聚酯的微生物之培养基组成物，其包括添加一种界面活性剂及聚酯材之基本培养基。
根据本发明的实施例，该培养基组合物的制备包括添加一种界面活性剂将聚酯材与基本培养基进行乳化(emulsify)，接着再加入琼脂(agar)以形成琼脂培养基。
根据本发明的实施例，该界面活性剂为具有下列式I之界面活性剂CH3(CH2)nCOONa(式I)其中，n为6-14之间的整数。
根据本发明的实施例，较佳的聚酯材选自由聚琥珀酸二乙酯、聚己内酯以及聚羟基丁酸酯组成之群，且该聚酯材呈粉末形式。然而本发明所使用的聚酯材并不限于上述的特定形式，任何能与基本培养基乳化的聚酯材种类或形式亦属于本发明的范围。
根据本发明，该基本培养基为最低营养成分之基本培养基。根据本发明的实施例，可为含有1％碳源之基本培养基。其中一实施例中，该基本培养基包含1.5克的磷酸氢二钾、1.0克的硫酸铵、5.0克的磷酸二氢钾、0.5克的氯化钾、5毫克的硫酸铁、1.6毫克的硫酸锰、1.4毫克的硫酸锌、2.0毫克的氯化钴(CoCl2)、0.5克的酵母菌抽出物、10克的碳源、1.0升的蒸馏水、20克的琼脂(pH 7.2)。
根据本发明筛选可分解聚酯之微生物的培养基组合物，可以在包含不同微生物的样本中筛选出可分解聚酯或类似聚合物的菌种，该微生物包括但不限于链霉菌属之放射菌、小单孢菌属之放射菌等具有分解聚酯或类似聚合物能力的菌种。
因此本发明也提供一种筛选可分解聚酯放射菌之培养基组成物，其包括添加有下列式I的界面活性剂及聚酯材之基本培养基CH3(CH2)nCOONa(式I)其中，n为6-14之间的整数。
另外，本发明提供一种筛选可分解聚酯之微生物的方法，包括将待筛选之微生物样本置于添加下列式I的界面活性剂及聚酯材之基本培养基中培养CH3(CH2)nCOONa(式I)其中，n为6-14之间的整数；以及观察于上述培养基中微生物生长过程中分解圈的形成以判断并分离出可分解聚酯的微生物。
根据上述筛选可分解聚酯之微生物的方法，本发明方法用于筛选具有分解聚酯或类似聚合物能力的菌种。根据本发明实例，所筛选的该微生物为放射菌株，包括但不限于链霉菌属(Streptomyces genus)之放射菌与小单孢菌属(Micromonospora genus)之放射菌等。
根据本发明的一较佳实施例，经过热处理的样本在以灭菌水适量稀释后，可利用将样本划过(streak)培养基组合物的方式接种，也可利用在无菌状态下涂抹样本(spread)于培养基组合物的方式培养，接着再从培养基组合物上观察分解圈的形成以判断并分离出可分解聚酯的微生物，因此任何所属技术领域的技术人员应该也都能理解，本发明并不限于以特定的方式将样本接种于上述培养基组合物。
此外，本发明还提供一种筛选可分解聚酯之放射菌的方法，包括将样本置于添加下列式I的界面活性剂及聚酯材之基本培养基中培养CH3(CH2)nCOONa(式I)其中，n为6-14之间的整数；观察于上述培养基中微生物生长过程中分解圈的形成以判断并分离出可分解聚酯的放射菌株。
本发明将参考下列特定但非限制的实例作更详尽的描述。
实施例(1)样本之收集在此实验中，所采集的样本均收集至灭菌过的50毫升管内，并在进一步处理前保存在4℃。
(2)筛选放射菌的培养基配方筛选放射菌所用的培养基是淀粉-酪蛋白琼脂(Starch-Casein Agar)，在每1升的培养基中包括4.0克的淀粉、0.12克的酪蛋白、1.6克的硝酸钾(KNO3)、1.6克的氯化钠、1.6克的磷酸氢二钾(K2HPO4)、40毫克的水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)、16毫克的碳酸钙(CaCO3)、8毫克的水合硫酸铁(FeSO4·7H2O)、18.0克的琼脂，并在培养基中添加50微克/毫升的亚胺环己酮(cycloheximide)以抑制真菌的生长。该制备得之培养基经121℃灭菌15分钟后，冷却至45～50℃，分装于培养皿，每一培养皿倒入15～20ml，作成培养基平面。
(3)放射菌之分离将1毫升的底泥样本悬浮在9毫升的灭菌水中，并以50℃热处理60分钟(Jensen等人，1991，Appl.Environ.Microbiol.57，1102-1108)，接着将悬浮液连续稀释1-10000倍后，以0.1毫升等分(每一组划上三道)划在淀粉-酪蛋白琼脂上并于25-28℃培养14天，通过重复转移至淀粉-酪蛋白琼脂，分离并纯化在每一样本观察到菌株形态的放射菌。所有分离的菌种也可培养在不同的琼脂培养基中，包括酵母菌抽出物-麦芽抽出物琼脂、燕麦琼脂、无机盐-淀粉琼脂及天门冬酰胺-甘油琼脂。
(4)筛选分解脂肪族聚酯的放射菌把1克的脂肪族聚酯粉末溶于50毫升的二氯甲烷(methylene chloride)中，再配制1升的基本培养基，基本培养基中含有0.1克的酵母菌抽出物(yeast extract)、10毫克的水合硫酸铁、0.2克的水合硫酸镁、1克的硫酸铵((NH4)2SO4)、20毫克的水合氯化钙(CaCl2·2H2O)、0.1克的氯化钠、0.5毫克的水合钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、0.5毫克的水合钨酸钠(NaWO4·2H2O)、0.6毫克的水合硫酸镁、50毫克的CH3(CH2)6COONa(台湾耐斯公司)，再把已溶的聚酯与基本培养基乳化，然后放置于通风柜中加热搅拌使二氯甲烷挥发，将18克的琼脂加入pH 7.2的乳化培养基中，经121℃灭菌15分钟，冷却至45～50℃，分装于培养皿，每一培养皿倒入15～20毫升，做成平面培养基，再接种放射菌上去，并置放于30℃的培养箱中培养。每天观察一次，连续观察七天，观察放射菌菌落是否有分解圈(clear zone)出现，并做记录。
(5)放射菌分解聚酯薄膜之测试所使用的脂肪族聚酯样本，包括聚琥珀酸二乙酯(poly(ethylenesuccinate)，PES，分子量＝1.0×104)、聚己内酯(poly(ε-caprolactone)，PCL，分子量＝6.8×105)以及聚羟基丁酸酯(poly(β-hydroxybutyrate)，PHB，分子量＝5.4×104)，购自Aldrich化学公司。利用热压(Linkam Hot stage)的方式制成薄膜，将压好的薄膜(厚度约为180微米)分别经过75％(重量容积比)的酒精灭菌以及紫外光照射10分钟，挥发完全后的PES、PCL或PHB薄膜并称取各100毫克，放入100毫升的基本培养液中，再分装100毫升至250毫升的锥形瓶中，并以每分钟180转的转速在30℃的转动器上保温，随后灭菌并编号。加入筛选出的放射菌(每一组实验进行三次)，再置放于培养箱中培养。
(6)放射菌之鉴别对培养在不同的琼脂培养基，包括酵母菌抽出物-麦芽抽出物琼脂、燕麦琼脂、无机盐-淀粉琼脂及天门冬酰胺-甘油琼脂中14天的菌种进行培养特性测试。使用ISCC-NBS色名表(Kelly，1964，美国国家标准局国内色彩研究学会，华盛顿特区)判断基质菌丝体的颜色代表，在具有长距物镜的光学显微镜上观察形态特征并根据Hasegawa等人在1983年提出的方法判断细胞璧的组成(DL-与LL-二氨基庚二酸异构物(diaminopimelic acidisomer)，A2pm)。在具有0.1毫升之6N盐酸的冷冻管(Evergreen Scientific)内放入一个或两个菌落，冷冻管以121℃灭菌15分钟的方式加热，冷却后将1微升的水解产物放置在纤维素薄盘(microcrystalline cellulose f，东京化成株式会社)，并在同一薄盘上另点上1微升的0.01摩尔的DL-A2pm作为标准。在甲醇-蒸馏水-6N盐酸-吡啶(pyridine)(80∶26∶4∶10容积/容积比)的溶剂系统上对薄盘进行3至4小时的显影，并待薄盘干后以二氢三酮喷洒剂(Ninhydrin Spray Reagent)喷洒并以100℃加热5分钟，而A2pm的点会呈现黄绿色。全细胞糖的分析步骤大致与A2pm的分析步骤相同，只是水解与显影液分别为0.25N的盐酸与n-丁醇-蒸馏水-吡啶-甲苯(toluene)(10∶6∶6∶1容积/容积比)而喷洒剂为酸苯胺酯(acid aniline phthalate)。标准糖溶液包含了各为1％浓度的半乳糖(galactose)、葡萄糖、甘露糖(mannose)、树胶醛糖(arabinose)、木糖(xylose)及核糖(ribose)。
(7)基质之利用试验使用最低培养基制备含有1％碳源之基本培养基，该最低培养基包含1.5克的磷酸氢二钾、1.0克的硫酸铵、5.0克的磷酸二氢钾、0.5克的氯化钾、5毫克的硫酸铁、1.6毫克的硫酸锰、1.4毫克的硫酸锌、2.0毫克的氯化钴(CoCl2)、0.5克的酵母菌抽出物、10克的碳源、1.0升的蒸馏水、20克的琼脂(pH 7.2)。其中使用之碳源包括吐温20(Tween 20)、甲羧基纤维素(carboxy methyl cellulose(CMC))、树胶质(xylan)、淀粉及酪蛋白。
(8)水中细菌计数-抹盘方式(总活菌计数)以1克的底泥样本与9毫升的灭菌水完全混合并放置30分钟，接着再将1毫升的底泥样本加入9毫升的灭菌水以产生连续稀释，把0.2毫升等分的稀释液以无菌操作方式涂抹在琼脂盘，并将琼脂盘放置在30℃培养48小时。
筛选试验
收集河床底泥或底泥悬浮液样本，将该样本以50℃热处理60分钟后，以上述培养方式培养在琼脂培养基。
由所收集的样本共筛选出305个放射菌株，所观察到的放射菌菌落呈现出特定似皮革、粉末或棉的干燥表面具有粗糙边缘或不规则形态。在底泥悬浮样本中所发现的总微生物族群为0.71至8.71×104/毫升，而在底泥样本中则为1.13至56.1×104/克。
接着，利用分解圈的方法从所分离出放射菌中筛选具分解聚合物能力的放射菌。在琼脂盘上形成菌落7天后，在包含可分解聚合物之微生物的菌落周围形成圆形分解圈。结果显示135个分离菌株为PHB-分解者(占总数的44.2％)，83个分离菌株为PCL-分解者(占总数的44.2％)，而64个分离菌株能分离PES。因此，能分解PHB的分离菌株明显比能分解PCL或PES的分离菌株更多。在135个分离菌株中，有46株也可以分解PCL，39株可分解PES，而有12株是可分解PHB、PCL及PES。
在基质利用试验中，上述12株放射菌均可以使用酪蛋白、甲羧基纤维素及淀粉作为其碳源，而除了分离菌株TH-11外，其余11株也可使用吐温20。分析上述筛选分离出菌株的形态与生理特性，如以下表1所示，多数的分离菌株属于链霉菌属(Streptomyces genus)(占总数的91.9％)与小单孢菌属(Micromonospora genus)(占总数的8.1％)。
表1
所属技术领域的技术人员应即了解，可对前述各具体实施例进行修改而不致悖离其广义发明概念。从而应了解本发明并不限于所披露之各项特定具体实施例，而为涵盖归属如权利要求所定义之本发明精神及范畴内的修改项目。
权利要求
1.一种筛选可分解聚酯的微生物之培养基组成物，其特征是包括添加下列式I的界面活性剂及聚酯材之基本培养基，CH3(CH2)nCOONa (式I)其中，n为6-14之间的整数。
2.根据权利要求1所述的培养基组成物，其特征是该基本培养基包括琼脂培养基。
3.根据权利要求1所述的培养基组成物，其特征是该聚酯材选自由聚琥珀酸二乙酯、聚己内酯以及聚羟基丁酸酯组成之群。
4.根据权利要求1或3所述的培养基组成物，其特征是该聚酯材呈粉末形式。
5.根据权利要求1所述的培养基组成物，其特征是该微生物包括放射菌。
6.一种筛选可分解聚酯的放射菌之培养基组成物，其特征是包括添加下列式I的界面活性剂及聚酯材之基本培养基，CH3(CH2)nCOONa (式I)其中，n为6-14之间的整数。
7.根据权利要求6所述的培养基组成物，其特征是该基本培养基包括琼脂培养基。
8.根据权利要求6所述的培养基组成物，其特征是该聚酯材选自由聚琥珀酸二乙酯、聚己内酯以及聚羟基丁酸酯组成之群。
9.根据权利要求6或8所述的培养基组成物，其特征是该聚酯材呈粉末形式。
10.一种筛选可分解聚酯的微生物的方法，其特征是包括将待筛选之微生物样本置于添加下列式I的界面活性剂及聚酯材之基本培养基中培养CH3(CH2)nCOONa (式I)其中，n为6-14之间的整数；以及观察于上述培养基中微生物生长过程中分解圈的形成以判断并分离出可分解聚酯的微生物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征是该基本培养基包括琼脂培养基。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征是该聚酯材选自由聚琥珀酸二乙酯、聚己内酯以及聚羟基丁酸酯组成之群。
13.根据权利要求10或12所述的方法，其特征是该聚酯材呈粉末形式。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征是该微生物包括放射菌。
15.一种筛选可分解聚酯的放射菌株的方法，其特征是包括将待筛选之放射菌株样本置于添加下列式I的界面活性剂及聚酯材之基本培养基中培养CH3(CH2)nCOONa (式I)其中，n为6-14之间的整数；以及观察于上述培养基中菌株生长过程中分解圈的形成以判断并分离出可分解聚酯的放射菌株。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征是该基本培养基包括琼脂培养基。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征是该聚酯材选自由聚琥珀酸二乙酯、聚己内酯以及聚羟基丁酸酯组成之群。
18.根据权利要求15或17所述的方法，其特征是该聚酯材呈粉末形式。
全文摘要
本发明提供一种筛选可分解聚酯的微生物之培养基组成物，其包括添加有下列式I的界面活性剂及聚酯材之基本培养基，CH
文档编号C12R1/465GK101041813SQ20061006565
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月21日 优先权日2006年3月21日
发明者黄金枝 申请人:黄金枝