专利名称：多磷酸肌醇6－/3－激酶基因在植物抗盐中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因(Inositol polyphosphate6-/3-kinase)在提高植物抗盐能力中的用途，更具体涉及一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在改造经济作物和其它植物抗盐能力中的应用。
背景技术：
在农业领域，环境压力是导致减产的重要因素之一。在这些环境压力中，盐胁迫的危害性在于它极大的阻碍了农作物的生长，最终降低产量(Boyer，J.S.(1982).Plant productivity and environment.Science 218，443-448.)。尤其是在灌溉地区，土地的盐碱化已经严重限制了当今农业的可持续发展(Ashraf，M.(1994).Breeding for salinity tolerance proteins in plants.Crit.Rev.Plant Sci.13，17-42.)。植物细胞内盐浓度的升高直接导致了细胞内离子的不平衡和渗透压的改变(Niu，X.，Bressan，R.A.，Hasegawa，P.M.，and Pardo，J.M.(1995).Ion homeostasis in NaCl stress environments.PlantPhysiol.109，735-742.Zhu，J.K.，Hasegawa，P.M.，and Bressan，R.A.(1997).Molecular aspects of osmotic stress.Crit.Rev.Plant Sci.16，253-277.)。当外界NaCl影响植物细胞内盐浓度时，不仅Na+与Cl+的平衡被打破，细胞内的K和Ca的浓度也会受到很大的影响(Serrano，R.，Mulet，J.M.，Rios，G.，Marquez，J.A.，de Larriona，I.F.，Leube，M.P.，Mendizabal，I.，Pascual-Ahuir，A.，Proft，M.，Ros，R.，and Montesinos，C.(1999).Aglimpse of the mechanisms of ion homeostasis during salt stress.J.Exp.Bot.50，1023-1036.Hasegawa，P.M.，Bressan，R.A.，and Zhu，J.K.(2000).Plant cellular and molecular responses to high salinity.Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.51，463-499.Rodriguez-Navarro，A.(2000).Potassium transport in fungi and plants.Biochim.Biophys.Acta 1469，1-30.)。植物的生存和生长，特别是农作物的正常发育，直接依赖于植物自身对离子平衡重新调节的能力。通过改变植物生长外界环境来适应植物生长需要的方法虽然能在一定程度和范围内解决因盐浓度过高而导致经济作物产量下降的问题，但这种方法不但需要投入大量的人力和物力，应用效果和适用地区也存在问题。另外，也有通过传统的品种改良的方法来提高某种经济作物适应高盐环境的例子，但这需要经过较长时间的品种优化，既耗费时间，也不一定能达到预期的结果。
目前，基础生物学研究已经鉴定出了一些能被外界的盐胁迫所激活的重要基因，例如SOS1、SOS2、SOS3、KIN1、KIN2、RD29A、RD29B等(Bray，E.A.(1993).Molecular responses to water deficit.Plant Physiol.103，1035-1040.Botella，M.A.，Quesada，M.A.，Kononowicz，A.，Bressan，R.A.，Hasegawa，P.M.，and Valpuesta，V.(1994).Characterization and in situ localizationof a salt induced tomato peroxidase gene.Plant Mol.Biol.25，105-114.Zhu，J.K.，Hasegawa，P.M.，and Bressan，R.A.(1997).Molecular aspectsof osmotic stress.Crit.Rev.Plant Sci.16，253-277.Hasegawa，P.M.，Bressan，R.A.，and Zhu，J.K.(2000).Plant cellular and molecularresponses to high salinity.Annu.Rev.Plant Phvsiol.Plant Mol.Biol.51，463-499.)。植物多磷酸肌醇6-/3-激酶(Inositol polyphosphate6-/3-kinase)是植物细胞内调节磷酸肌醇代谢的重要激酶，它能将三磷酸肌醇(IP3)磷酸化为四磷酸肌醇(IP4)以及高磷酸肌醇(IP5)(Xia H-J，BrearleyC，Elge S，et al.(2003).Arabidopsis inositol poiyphosphate 6-/3-kinaseis a nuclear protein that complements a yeast mutant lacking a functionalArgR-Mcml transcription complex.Plant Cell；15449-463.)。IP3与IP4分子也是调节细胞内钙离子浓度的重要第二信使。因此，IP3K参与调节植物细胞内Ca2+信号途径(Xia H-J，Brearley C，Elge S，et al.(2003).Arabidopsisinositol polyphosphate 6-/3-kinase is a nuclear protein that complementsa yeast mutant lacking a functional ArgR-Mcml transcription complex.Plant Cell；15449-463.)。植物多磷酸肌醇6-/3-激酶基因的克隆，生化特性及该基因的初步功能研究已于2003年首次被报道(Xia H-J，Brearley C，Elge S，et al.(2003).Arabidopsis inositol polyphosphate 6-/3-kinase is anuclear protein that complements a yeast mutant lacking a functionalArgR-Mcml transcription complex.Plant Cell；15449-463.)。另外的研究也证实多磷酸肌醇6-/3-激酶基因能通过与钙离子相关的途径调节植物的正常生长(Xu J，Brearley CA，Lin WH，et al.A role of Arabidopsis inositolpolyphosphate kinase AtIpk2α.in pollen germination and root growth.Plant Physiol 2005；13794-103.)。目前已经报道了一些通过转基因手段来提高植物抗盐能力的例子，但所用的基因大多数为植物抗盐途径中的下游基因。而多磷酸肌醇6-/3-激酶基因是调节植物钙信号的重要基因，其在植物信号传导过程中处于上游位置。因此，多磷酸肌醇6-/3-激酶基因能通过多种途径来提高植物抗盐能力。经检索未见到任何拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在植物抗盐中的使用或报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在植物抗盐中的应用，尤其是多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在拟南芥和烟草抗盐中的应用。拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因或类似基因可以提高植株在高盐环境中存活率、加速其生长和提高其相对产量。
本发明还涉及利用多磷酸肌醇6-/3-激酶基因(目的基因或类似基因)，通过转基因等生物技术手段在提高植物抗盐能力的方法。所改变的基因与所采用的方法不仅具有可操作性，还能明显改善植物在高盐环境中的生长状况。
本发明还涉及一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在受体植物抗盐中的应用。
本发明还涉及一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在烟草抗盐中的应用。
本发明还涉及一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在水稻抗盐中的应用。
本发明还涉及一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在油菜抗盐中的应用。
本发明还涉及一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在小麦抗盐中的应用。
本发明还涉及一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在大麦抗盐中的应用。
本发明还涉及一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在大豆抗盐中的应用。
本发明还涉及一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在杨树抗盐中的应用。
本发明还涉及一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在百合花抗盐中的应用。
本发明所涉及的多磷酸肌醇6-/3-激酶基因(目的基因或类似基因)在提高受体植物抗盐能力中的应用。目前已有一些通过改变某种基因的表达量来提高植物抗逆能力的方法。本发明所改变的基因能很好的实现提高受体植物的抗盐能力。
本发明涉及一个基因或一段核苷酸序列，其与SEQ ID NO.1至少具有40％核苷酸同源性，在植物抗盐中的应用。
本发明涉及一段氨基酸序列，其与SEQ ID N0.2至少具有40％氨基酸同源性，在植物抗盐中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施本发明涉及的科学术语如下*“目的基因”，系指拟南芥中的多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。
*“类似基因”，系指任何同“目的基因”编码序列中的任何区域同源性在40％以上的DNA片段(基因片段)，或任何DNA片段(基因片段)，其编码的氨基酸序列同“目的基因”编码的氨基酸序列中任何区域有40％以上的同源率。“类似基因”可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成或用PCR在体外扩增的。
*“基因片段”，系指长度在300个碱基对(bp)以上的同“目的基因”或“类似基因”DNA序列中的任何域区同源律在40％以上的任何DNA片段，或任何编码100个氨基酸以上的DNA片段，其编码的氨基酸序列同“目的基因”或“类似基因”编码的氨基酸序列中的任何区域同源性在40％以上。该基因片段可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在体外扩增的。
*“受体植物”系指整个植物界包括低等植物、高等植物、藻类以及任何利用光合作用生存的水生物，主要包括光合水生物、藻类、厥类、裸子植物(松、柏等)、被子植物(蔬菜、粮食作物、油料作物、药用植物、苗木、花卉)等。
*“转基因”，系指通过任何方法导入植物个体一段外源的双链脱氧核糖核苷酸(DNA)片段，可以是游离在染色体外，也可以整合到受体植物染色体的基因组上；可以通过生殖过程传递到后代，也可以不传递到后代。外源基因可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在体外扩增的。
*“抗逆植物”，指任何具有抗盐、抗旱、抗寒、抗热、抗虫等特性的植物。
现已证实，通过改变盐效应基因在植物中的表达量，能够明显的提高和降低植物对外界盐处理的敏感性，即相应的改变的植物对外界盐环境的适应能力。因此，通过转基因等手段调节相应盐应答基因能有效的提高植物的抗盐能力。本发明将目的基因或类似基因导入受体植物中，选育出的转基因植株的耐盐性明显高于野生型植株。将目的基因或类似基因装配于强力组成型表达的花椰菜花叶病毒35S强力启动子((如CaMV35S)或其他类型(可诱导启动子等)之下，构建成可以在植物中表达的载体，通过农杆菌介导的转化方法或其他方法，使目的基因或类似基因在受体植物中大量表达，从而使转基因植株的耐盐特性得以提高。本发明的关键是多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在受体植物中得以大量表达，使转基因植株的抗盐能力达到最高点，受体植物对其他相关逆境因子(如寒冷、干旱等)的耐受性也同时得以提高。
本发明所述目的基因或相似基因是从植物中克隆得到的，与拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因至少具有40％同源性且具有相似功能的所有基因。拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因的cDNA长900bp，编码300个氨基酸。在GenBank中进行同源搜索，发现在其它植物如水稻中都有同源序列，且相似性为56％。拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因序列为SEQ ID NO.1。
拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
1.构建可以在植物中大量表达的基因表达载体，将目的基因或类似基因装配于具有不同筛选标记的基因表达载体上，置于强力组成型表达强力启动子(如CaMV35S)或其他类型的启动子(如可诱导型启动子)之下，构建成可以在植物中表达的载体。
2.借助农杆菌介导的方法、化学转化法〔如聚乙二醇(PEG)转化〕、基因枪或其他方法(如花粉管转化)，将上述基因表达载体导入受体植物中，并在启动子的带动下，使目的基因在转基因受体植物中大量表达；根据基因表达载体上的筛选标记筛选具有抗性的再生植株。
3.对第一代抗性再生植株进行DNA(Southern Blots)，RNA(Northern Blots)及蛋白(Western Blots)杂交分析，并检测其抗盐性及其他相关的抗逆性；4.对上述蛋白分析呈阳性的第一代个体进行继代繁殖，并分析其后代(F1，F2，F3，F4)中目的基因的含量(表达水平)及个体的抗盐性及其他相关的抗逆性。
5.将其幼苗在100-200mM氯化钠(NaCl)或更高盐浓度下生长，观测转基因植物与野生型植物间的差别以检测转基因植物的抗盐能力，从而筛选出具有高抗盐性的转基因植株。
在其它植物种类中的转基因操作按以上操作步骤。
本发明的有益效果是，可以明显提高植物的抗盐能力，从而使受体植物能够在高盐环境中生长，克服外界盐压力对植物生长和产量的影响。将本发明应用于植物，将有利于植物在高盐地区的推广以及保持产量的正常。例如，将多磷酸肌醇6-/3-激酶基因转入杨树，可在北方高盐及干旱地区有较大作用，可用于防沙固沙。因此，本发明在提高植物抗盐性中起作用。可明显提高受体植株在干旱地区的抗盐能力，存活率。
图1植物表达载体pBinAR-HPT/AtIP3K结构图。该表达载体为pBinAR-HPT。其上有多个酶切位点，上游为CaMV35S强力启动子。拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因(IP3K)插入到CaMV35S启动子之后。
图2转基因拟南芥的耐盐性试验。将转基因系12、转基因系27和野生型种子在含有100mM NaCl浓度的MS培养基上萌发并进行统计，转基因种子萌发率大大高于野生型种子，并且转基因幼苗明显大于野生型幼苗。
图3转基因拟南芥在125mM NaCl条件下的耐盐性试验。将转基因系12、转基因系27和野生型种子在含有125mM NaCl浓度的MS培养基上萌发并进行统计，转基因种子萌发率大大高于野生型种子，并且转基因幼苗明显大于野生型幼苗。
图4转基因拟南芥在125mM NaCl条件下的耐盐性试验。圆形、方形、三角形曲线分别代表野生型、转基因系12、转基因系27植株萌发率情况，可见在125mM NaCl环境下转基因种子萌发率大大高于野生型种子。
图5转基因拟南芥在150mM NaCl条件下的耐盐性试验。将转基因系12、转基因系27和野生型种子在含有150mM NaCl浓度的MS培养基上萌发并进行统计，转基因种子萌发率大大高于野生型种子。圆形、方形、三角形曲线分别代表野生型、转基因系12、转基因系27植株萌发率情况。
图6不同盐浓度(100mM；125mM；150mM；175mM)对野生型与转基因拟南芥种子萌发率影响的比较。转基因系种子的萌发率明显高于野生型拟南芥种子。灰色、黑色、白色曲线分别代表野生型、转基因系12、转基因系27植株萌发率情况。
图7转基因烟草的鉴定。PCR表明IP3K基因已经整合到植物基因组中。PCR扩增条带为631bp片断。其中1.DNA分子标记；2.载体阳性对照；3.空白阴性对照；4.野生型对照；5-13.转基因系。
图8转基因烟草在200mM(图A)，300mM NaCl(图B)条件下的耐盐性试验。转基因烟草在200mM，300mM NaCl环境下萌发率大大高于野生型种子。
图9转基因烟草在0mM(图A)，100mM(图B)，200mM NaCl(图C)条件下的耐盐性试验图表统计结果。转基因烟草在100mM，200mM NaCl环境下萌发率大大高于野生型种子。
图10300mM NaCl液体培养基上生长的野生型植株和转基因植株表型观察。发现转基因植株比野生型植株生长旺盛。
图11油菜的再生及转基因幼苗，转基因油菜在培养基上生长。
图12大豆转基因体系的建立，转基因大豆在培养基上生长。
图13转基因杨树在含有150mM NaCl的MS培养基上的耐盐实验A和B不同的转基因株系；C野生型具体实施方式
实施例1本发明将从拟南芥中克隆的多磷酸肌醇6-/3-激酶基因(目的基因)在拟南芥中表达后，转基因拟南芥的抗盐性明显高于野生型。将多磷酸肌醇6-/3-激酶基因装配于强力组成型表达的花椰菜花叶病毒35S强力启动子(CaMV35S)之下，构建成可以在植物中表达的载体，通过农杆菌介导的转化方法，使该目的基因在转基因植株内大量表达，具体操作如下1.拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因的克隆利用动物三磷酸肌醇激酶(inositol 1，4，5-trisphosphate kinase)序列在GenBank数据库中利用Basic Local Alignment Search Tool工具寻找植物中三磷酸肌醇激酶同源序列。所寻找到的拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因序列(在发明内容中已有叙述)定位于拟南芥第5号染色体上。利用聚合酶链式反应PCR和同源引物5’-GATCGAATTCATGCTCAAGGTCCCTGAACACC-3’和5’-GTCACTCGAGCTAGCGCCCGTTCTCAAGTAGG-3’扩增得到拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因片段(AtIP3K)。并利用该片断筛选拟南芥cDNA文库，得到拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。
2.植物表达载体pBinAR-HPT/AtIP3K的构建将具有潮霉素筛选标记的表达载体pBinAR-HPT(来源于the Plantsignaling Laboratory of the Max-Planck Institution of Molecular PlantPhysiology)首先用限制性内切酶XbaI/SalI消化后，将载体纯化后回收；同时，将cDNA文库中拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因用XbaI/XhoI酶切，然后将其回收后同载体连接，如图1所示，得到具有潮霉素筛选标记的植物表达载体pBinAR-HPT/AtIP3K，。
3.遗传转化将植物表达载体pBinAR-HPT/AtIP3K导入农杆菌LBA4404中，用含有pBinAR-HPT/AtIP3K的农杆菌培养液感染野生拟南芥花序，收集种子。种子在共生培养基(MS培养基+25毫克/升潮霉素)上筛选。将筛选后种子转入土壤中生长。再将收获的种子播种在含有100毫克/升潮霉素的MS培养基上，筛选出纯合体。
4.转基因植物的抗盐能力鉴定将转基因系种子在含有100mM NaCl浓度的MS培养基上萌发并进行统计。发现转基因系种子萌发率明显高于野生型植物，如图2所示。并且个体生长也比野生型植物生长情况好。
实施例2
1.利用与实施例1相同的方法从拟南芥中克隆得到拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。并将拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因插入到植物表达载体pBinAR-HPT中，构建pBinAR-HPT/AtIP3K表达载体。并进行转基因鉴定。具体方法如实施例1中操作。
2.将经过筛选的转基因种子在125mM NaCl浓度下萌发生长，并与野生型拟南芥种子进行对比。
3.对转基因与野生型种子的萌发率进行统计并观察小苗的生长。
4.在125mM NaCl条件下，IP3K转基因小苗的个体生长情况明显好于野生型小苗，如图3所示，IP3K转基因小苗的个体生长情况。
5.在125mM NaCl条件下，IP3K转基因种子的萌发率也明显高于野生型小苗，如图4所示，萌发率提高58-62％，通过实验是在60％，IP3K转基因种子的萌发率明显提高。
实施例31.用与实施例1相同的方法从拟南芥中克隆得到拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。并将拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因插入到植物表达载体pBinAR-HPT中，构建pBinAR-HPT/AtIP3K表达载体。并进行转基因鉴定。具体方法与实施例1相同。
2.将经过筛选的转基因种子在150mM和175mM NaCl浓度下萌发生长，并与野生型拟南芥种子进行对比。
3.对转基因与野生型种子的萌发率进行统计并观察小苗的生长。
4.在150mM NaCl条件下，IP3K转基因种子的萌发率也明显高于野生型小苗，如图5所示，萌发率提高48-55％，通过实验在50％。
5.对100mM，125mM，150mM，175mM NaCl浓度情况下IP3K转基因植物与野生型植物萌发率进行统计，如图6所示，萌发率提高50％-70％。均证明IP3K转基因方法能够提高植物的抗盐能力。
实施例4
1.将植物表达载体pBinAR-HPT/AtIP3K导入农杆菌LBA4404中(Zhang &Zeevaart 1999)，用含有pHXZ/BADH的农杆菌培养液感染野生烟草叶切片，在共生培养基(MS培养基)上共培养2天后，转移到再生培养基上(MS+1毫克/升6-BAP、0.1毫克/升NAA、25毫克/升潮霉素)；20-23天后，将再生的转基因幼苗切下，转移到生根培养基上(MS+0.1毫克/升NAA、50毫克/升潮霉素)，诱导生根；14天后将已生根的幼苗转移到土壤中培养，将收获的T1种子播种在含有100毫克/升潮霉素的MS培养基上，筛选出纯合体，对其进行分子鉴定，如图7所示，证明得到阳性植株。
2.转基因烟草在含有盐(200mM和300mM)和潮霉素的培养基中萌发，去除隐性纯合子以后拍照.野生型在含盐(200mM)培养基中萌发。研究发现，转基因烟草萌发率明显高于野生型烟草，如图8所示，提高8-12％，通过实验是在10％。
3.对100mM，200mM NaCl浓度情况下IP3K转基因植物与野生型植物萌发率进行统计，如图9所示，萌发率提高30％-50％。均证明IP3K转基因方法能够提高植物的抗盐能力。
4.对300mM NaCl液体培养的野生型和转基因植株株型比较，发现如图10所示，转基因植株比野生型植株生长旺盛。
实施例51.利用与实施例1相同的方法从拟南芥中克隆得到拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。并将拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因插入到植物表达载体pBinAR-HPT中，构建pBinAR-HPT/AtIP3K表达载体。具体方法如实施例1。并转化到水稻，并进行转基因鉴定。
2.转基因植株的耐盐性试验转基因水稻，在含有盐(200mM)和潮霉素的培养基MS中萌发，去除隐性纯合子以后拍照.野生型在含盐(200mM)培养基中萌发。研究发现，转基因水稻萌发率明显高于野生型水稻，提高28-33％，通过实验为30％。
实施例61.利用与实施例1相同的方法从拟南芥中克隆得到拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。并将拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因插入到植物表达载体pBinAR-HPT中，构建pBinAR-HPT/AtIP3K表达载体。具体方法如实施例1。并转化到小麦，并进行转基因鉴定。
2.转基因植株的耐盐性试验转基因小麦，在含有盐(200mM)和潮霉素的培养基MS中萌发，去除隐性纯合子以后拍照.野生型在含盐(200mM)培养基中萌发。研究发现，转基因小麦萌发率明显高于野生型小麦，提高约13％。
实施例71.利用与实施例1相同的方法从拟南芥中克隆得到拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。并将拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因插入到植物表达载体pBinAR-HPT中，构建pBinAR-HPT/AtIP3K表达载体。具体方法如实施例1。并转化到大麦，并进行转基因鉴定。
2.转基因植株的耐盐性试验转基因大麦，在含有盐(200mM)和潮霉素的培养基MS中萌发，去除隐性纯合子以后拍照。野生型在含盐(200mM)培养基中萌发。研究发现，转基因小麦萌发率明显高于野生型大麦，提高19-24％，通过实验在20％。
实施例81.利用与实施例1相同的方法从拟南芥中克隆得到拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。并将拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因插入到植物表达载体pBinAR-HPT中，构建pBinAR-HPT/AtIP3K表达载体。具体方法如实施例1。并转化到油菜(如图11)。并进行转基因鉴定。
2.转基因植株的耐盐性试验转基因油菜，在含有盐(200mM)和潮霉素的培养基MS中萌发，去除隐性纯合子以后拍照。野生型在含盐(200mM)培养基中萌发。研究发现，转基因油菜萌发率明显高于野生型油菜，萌发率提高21-30％，通过实验在24％。
实施例91.利用与实施例1相同的方法从拟南芥中克隆得到拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。并将拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因插入到植物表达载体pBinAR-HPT中，构建pBinAR-HPT/AtIP3K表达载体。具体方法如实施例1。并转化到大豆(如图12)，并进行转基因鉴定。
2.转基因植株的耐盐性试验转基因大豆，在含有盐(200mM)和潮霉素的培养基MS中萌发，去除隐性纯合子以后拍照。野生型在含盐(200mM)培养基中萌发。研究发现，转基因大豆萌发率明显高于野生型大豆，萌发率提高24-28％，通过多次实验在25％。
实施例101.利用与实施例1相同的方法从拟南芥中克隆得到拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。并将拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因插入到植物表达载体pBinAR-HPT中，构建pBinAR-HPT/AtIP3K表达载体。具体方法如实施例1。并转化到杨树(如图13)。并进行转基因鉴定。
2.转基因植株的耐盐性试验转基因杨树，在含有盐(150mM)和潮霉素的培养基MS中萌发，去除隐性纯合子以后拍照。野生型在含盐(150mM)培养基中萌发。研究发现，转基因杨树萌发率明显高于野生型杨树，萌发率提高9-11％。
实施例111.利用与实施例1相同的方法从拟南芥中克隆得到拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因。并将拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因插入到植物表达载体pBinAR-HPT中，构建pBinAR-HPT/AtIP3K表达载体。具体方法如实施例1。并转化到百合花。并进行转基因鉴定。
2.转基因植株的耐盐性试验转基因百合花，在含有盐(200mM)和潮霉素的培养基中萌发，去除隐性纯合子以后拍照。野生型在含盐(200mM)培养基中萌发。研究发现，转基因百合花萌发率明显高于野生型百合花，提高49-53％，通过多次实验在50％。
SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120>多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在植物抗盐中的应用<130>多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在植物抗盐中的应用<150>CN200510018481.X<151>2005-03-30<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>903<212>DNA<213>拟南芥<400>1atgctcaagg tccctgaaca ccaagttgct ggtcacattg ctagtgatgg gaagctcggt 60ccactcgtag atgaccaagg ccggttcttc aagccacttc agggagattc tcgtggcgaa120cacgaggcta agttctatga gtctttcaca tcgaacatga aggttccaga tcacatccat180agatacttcc cggtgtatca cggcactcag ctagttgaag catctgatgg atctggcaag240cttcctcatc ttgttcttga tgatgttgtt tcagggtacg caaacccgtc ggtaatggat300gttaagattg gatctaggac atggtacccg gatgtatcag aagaatactt caagaaatgt360attaagaaag atagacagac caccacggtt tcgttggggt tcagggtttc aggttttaag420atttttgatc accaagaatc aagtttttgg agagctgaga agaagcttgt tcttgggtat480aatgcagatg gtgctagatt ggctctgagg aagtttgtgt catcgaactc tcccgctgac540tctaacttga caccaaactg tgcttttgca tcagaggttt atggcggttg taacgggatc600ttagcgcagt tgttggagct taaagattgg ttcgaaaccc aaacgcttta ccatttcaat660tcctgctcga ttctgatgat ttacgagaat gaatcaatct tgatgcaagg aggagatgat720gcaccggcac cacgggcaca agtgaagctg gtggatttcg cgcatgttct tgatggaaac780ggtgtcatcg accataattt cttgggtgga ctctgctctt tcataaagtt catcaaagat840
attcttcaga gcgttgaaaa gcacgatgaa accgatactt ccctacttga gaacgggcgc900tag 903<210>2<211>300<212>PRT<213>拟南芥<400>2Met Leu Lys Val Pro Glu His Gin Val Ala Gly His Ile Ala Ser Asp1 5 10 15Gly Lys Leu Gly Pro Leu Val Asp Asp Gln Gly Arg Phe Phe Lys Pro20 25 30Leu Gln Gly Asp Ser Arg Gly Glu His Glu Ala Lys Phe Tyr Glu Ser35 40 45Phe Thr Ser Asn Met Lys Val Pro Asp His Ile His Arg Tyr Phe Pro50 55 60Val Tyr His Gly Thr Gln Leu Val Glu Ala Ser Asp Gly Ser Gly Lys65 70 75 80Leu Pro His Leu Val Leu Asp Asp Val Val Ser Gly Tyr Ala Asn Pro85 90 95Ser Val Met Asp Val Lys Ile Gly Ser Arg Thr Trp Tyr Pro Asp Val100 105 110Ser Glu Glu Tyr Phe Lys Lys Cys Ile Lys Lys Asp Arg Gln Thr Thr115 120 125Thr Val Ser Leu Gly Phe Arg Val Ser Gly Phe Lys Ile Phe Asp His130 135 140Gln Glu Ser Ser Phe Trp Arg Ala Glu Lys Lys Leu Val Leu Gly Tyr145 150 155 160
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权利要求
1.一种拟南芥多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在植物抗盐中的应用。
2.一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在受体植物中抗盐的应用。
3.一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少40％同源性的序列。
4.一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少40％同源性的序列。
5.一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在拟南芥抗盐中的应用。
6.一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在烟草抗盐中的应用。
7.一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在水稻抗盐中的应用。
8.一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在油菜抗盐中的应用。
9.一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在小麦抗盐中的应用。
10.一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在大麦抗盐中的应用。
11.一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在大豆抗盐中的应用。
12.一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在杨树抗盐中的应用。
13.一种多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在百合花抗盐中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种拟南芥多磷酸肌醇6－/3－激酶基因在植物抗盐中的应用，通过从目的植物中克隆多磷酸肌醇6－/3－激酶基因，再通过分子生物学和转基因手段，以适当方式将该基因连接到相应载体上并生产转基因植物。该基因为解决植物、粮食和经济作物在高盐环境存活率低、生长缓慢和产量低的问题提供一种技术途径。将有利于植物在高盐地区的推广以及保持产量的正常。
文档编号C12N15/55GK1847402SQ20061007420
公开日2006年10月18日 申请日期2006年3月29日 优先权日2005年3月30日
发明者夏惠君, 张洪霞 申请人:武汉大学