专利名称：一种灵芝漆酶的清洁高效生产方法
技术领域：
本发明涉及一种工业用酶制剂的制备方法，特别涉及工业用漆酶的制备方法，确切地说是一种灵芝漆酶的清洁高效生产方法。
背景技术：
漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，能够催化多种酚类和非酚类化合物发生氧化，同时伴随有氧还原成水。漆酶广泛存在于植物、细菌、昆虫，特别是白腐真菌中。漆酶作用底物广泛、催化效率高，在生物制浆、食品风味的改良、饲料营养的改善、纺织染料的降解与转化、纺织纤维的柔化、新型药物开发、新型生物传感器的研制及新型能源开发等领域具有重要(潜在)应用价值[洪宇植等(2005)生物工程学报21547-552；Xiao YZ et al(2006)Appl Microbiol Biotechnol 71493-501]，近年来成为国际酶工程学和环境科学交叉领域研究的一个热点。
目前，真菌漆酶的生产大多在人工合成培养基中进行，需要芳香类化合物和(或)重金属离子的诱导[Xiao YZ et al(2004)Mycologia 9626-35]。这些诱导物具有毒性，添加后使得发酵液后处理难度大、成本高，易造成环境污染。多年来，国内外学者一直关注和致力于漆酶合成方法的探索，并取得了进展(如固态发酵和异源表达)。固态发酵技术能够缓解酶生产的污染问题，然而其发酵周期过长(一般超过20天)；漆酶基因在多个不同宿主中异源表达的产量也普遍低于野生菌[Hong YZ et al(2006)FEMS Microbiol Lett 25896-101]，这些限制了漆酶的产业化进程。
灵芝(Ganoderma)具有重要的药用价值和保健功能，以往的研究主要围绕这两个功能展开，而关于灵芝漆酶的应用研究尚不多见。在国内，张晓昱等将平菇(Pleurotus sp.)与灵芝(Ganoderma sp.)混合培养进行固态发酵，漆酶酶活达到2,165U/g(ABTS法)[黄慧艳等(2004)中国食用菌2331-33]；王岁楼等将Ganoderma lucidum Karst No.1进行突变，突变株G301的最高漆酶产量为355U/L(愈创木酚法)[王岁楼等(2006)食品科学2753-57]。国际上也有关于灵芝漆酶的研究报道[Trevor M et al(1999)Appl Environ Microbiol 655307-5313]，较为突出的是，Ganoderma adspersum液体发酵14天的漆酶产量达到34,000U/L(ABTS法)[songulashvili G et al(2006)Biotechnol Lett 281425-1429]。在这些研究中，漆酶的产量较低，难以达到商业化应用的需求。
发明内容
鉴于已有技术存在的不足，本发明旨在提供一种高效、环保、廉价地生产真菌漆酶的方法，所要解决的技术问题是选择优良的真菌菌株为材料在环保、廉价的培养基中高效地发酵生产灵芝漆酶。
所述的优良菌株为真菌菌株树舌灵芝ST(Ganoderma applanatum ST)，由申请人自主选育。
所述的环保、廉价的培养基是用天然农副产品配制得到的液体培养基。
本生产方法包括培养基配制、种液制备、灭菌、接种、发酵、酶分离和后处理，其特征在于将树舌灵芝ST种液接种在发酵培养基中于22～35℃培养3～8天，最后分离得到工业用漆酶制剂。发酵培养基有以下组分和重量百分数玉米粉0.1％～5％，粮食麸皮1％～7％，花生饼粉1％～7％，余量为自来水，培养基pH3～8。
优选的发酵培养基为玉米粉0.2％～3％、粮食麸皮2％～5％、花生饼粉2％～5％、余量为自来水，培养基pH3～8。
所述的粮食麸皮选自麦麸皮、大米皮糠等，可单独使用，也可混合使用，优选麦麸皮。
进一步优选的发酵培养基为玉米粉0.7％，麦麸皮3％，花生饼粉3％，余量为自来水，培养基pH5～6。
所述的种液制备就是将树舌灵芝ST接种在上述培养基中于22～35℃、100～200r/min培养3～6天，然后将种液按1～15％(体积分数)接种量接入同样的培养基中继续发酵培养制备漆酶。
分离得到的漆酶制剂或冻干贮藏，或经稀释后直接应用于食品、饮料、纺织印染、污水处理等工业领域。但若应用于生物传感器等高技术领域则需进一步纯化制备纯漆酶制剂。
所述的纯化在低温下进行，将粗酶制剂经离心分离、超滤浓缩、透析和柱层析处理制备纯漆酶制剂。
本发明在漆酶生产过程中使用的菌株为灵芝(具有保健功能)，所用的培养基成分为常见的农副产品，其发酵废渣可用作高蛋白类饲料。本发明发酵获得的漆酶活力在9,000U/L以上(愈创木酚法)，目前该产量处于漆酶液态发酵生产法的国际领先水平。与其它研究相比，本发明生产漆酶具有以下优点(1)培养基组分简单、廉价且来源广泛；(2)酶合成无需毒性物质诱导，发酵产物可循环利用，后加工处理简便，基本无环境污染；(3)酶产率高、发酵周期短，适于工业化生产。
申请人自主选育的树舌灵芝ST(Ganoderma applanatum ST)已于2006年09月18日送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NOM206100。
四.
具体实施例方式
1、发酵培养基的制备玉米、麸皮和花生饼用粉碎机粉磨成粉末，过60～200目筛后使用效果更佳。
(1)取玉米粉0.2份、粮食麸皮2份、花生饼粉2份，自来水95.8份，柠檬酸调pH4，121℃灭菌30～50min，备用。
(2)取玉米粉3份、粮食麸皮5份、花生饼粉5份，自来水87份，柠檬酸调pH5，121℃灭菌30～50min，备用。
(3)取玉米粉0.2份、麦麸皮5份、花生饼粉5份，自来水89.8份，柠檬酸调pH5，121℃灭菌30～50min，备用。
(4)取玉米粉3份、大米皮糠2份，花生饼粉2份，自来水93份，氨水调pH8，121℃灭菌30～50min，备用。
(5)取玉米粉0.3份、麦麸皮3份、大米皮糠1份，花生饼粉3份，自来水92.7份，氨水调pH8，121℃灭菌30～50min备用。
(6)取玉米粉2份、大米皮糠2份，麦麸皮1份，花生饼粉4份，自来水91份(自然pH)，121℃灭菌30～50min备用。
(7)取玉米粉0.7份、麦麸皮3份，花生饼粉3份，自来水93.3份(自然pH)，121℃灭菌30～50min备用。
2、树舌灵芝ST种液的制备在土豆培养基(1L培养基20％土豆汁、20g葡萄糖、3gKH2PO4、1.5gMgSO4·7H2O、0.4g维生素B，加1.5％琼脂制成固体培养基)斜面上4℃保存的树舌灵芝ST接种于已高温灭菌的上述(1)～(7)的任一发酵培养基中，22～35℃、100～200r/min培养3～6天，即制成种液。
3、接种与发酵培养将制备的树舌灵芝ST种液按1～15％体积分数接种于已灭菌的上述(1)～(7)的任一发酵培养基中，100～200r/min、22～35℃培养3～8天至产酶高峰。以愈创木酚为底物测定漆酶活力的方法参照文献[洪宇植等(2005)生物工程学报21547-552]。
4、酶分离与纯化在漆酶活力达到高峰时，发酵液经过滤去除菌体和废渣，滤液即是漆酶粗制剂。滤液或者冷冻干燥后贮藏备用，或者加水适当稀释后直接用于食品饮料业、纸浆漂白、工业染料脱色(特别是纺织染料)、纺织纤维软化、饲料加工等领域。
粗酶制剂依次按下述步骤可获得纯酶，所有操作在4～10℃进行①6,000g离心10min，上清液超滤浓缩10～50倍；②上清液在2mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(pH8.0)透析3～6小时，然后10,000g离心10min；③上清液上预先用透析液平衡的DEAE-SepharoseFF离子交换柱，并用0～0.3mol/L的硫酸铵进行梯度洗脱，活性组分脱盐后用灭菌水(或去离子水)稀释，即可获得纯酶制剂(纯酶制剂除了可用于上述粗酶的应用领域外，还能用于生物传感器等研究)。
5、发酵后处理由于菌株和培养基对人畜均安全，且过滤出的菌体和废渣含有丰富的营养成分，因此可用作饲料。
6、具体操作例(1)、玉米、麦麸和豆饼粉碎后过60目筛，按玉米粉0.7％，麦麸皮3％，花生饼粉3％的比例配比，余量为自来水(自然pH5～6)，配制后于121℃灭菌40min，制成发酵培养基。
(2)、从树舌灵芝ST的保藏斜面挑取两块约1cm2的菌丝块，接种到装有150mL发酵培养基的500mL三角瓶中，130r/min、28℃培养4天至漆酶活力达到700～1500U/L，制成种液。按8％的体积分数将种液接种到350mL新鲜的发酵培养基(1L三角瓶)中，继续培养5天，酶活在9,000U/L(愈创木酚法)以上。
(3)、发酵液用八层纱布过滤去除菌体和废渣，滤液即是粗漆酶制剂。滤液经超滤浓缩冻干以便贮存，或加水稀释直接用于食品饮料业、纸浆漂白、染料脱色、污水处理、纤维软化、饲料加工、酒精生产等。若需进一步纯化得到纯漆酶制剂，按“4、酶分离与纯化”中所述的纯化步骤进行处理。菌体和废渣用作饲料。
权利要求
1.一种灵芝漆酶的清洁高效生产方法，以树舌灵芝ST为出发菌株，包括培养基配制、种液制备、灭菌、接种、发酵、酶分离和后处理，其特征在于将树舌灵芝菌株接种在发酵培养基中于22～35℃培养3～6天制备种液，然后将该种液接种到同样的发酵培养基中于22～35℃继续培养3～8天，最后分离得到漆酶制剂；所述的发酵培养基有以下组分和重量百分数玉米粉0.1％～5％、粮食麸皮1％～7％、花生饼粉1％～7％，水余量，pH3～8。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于发酵培养基各组分重量百分数为玉米粉0.2％～3％、粮食麸皮2％～5％、花生饼粉2％～5％，水余量，pH3～8。
3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于发酵培养基各组分重量百分数为玉米粉0.7、麦麸皮3％、花生饼粉3％，水余量，pH5～6。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于玉米粉、粮食麸皮、花生饼粉细度过60～200目筛。
全文摘要
一种灵芝漆酶的清洁高效生产方法，以申请人自主选育的树舌灵芝ST为出发菌株，将其先接种在发酵培养基中制备种液，再将种液接种到同样的发酵培养基中于22～35℃培养3～8天，分离后得到漆酶制剂。发酵培养基由0.1～5％的玉米粉，1～7％的粮食麸皮、1～7％的花生饼粉和余量水组成。本方法生产的漆酶活力在9000U/L以上(愈创木酚法)，该产量处于漆酶液态发酵生产法的国际领先水平。培养基为农副产品，无毒、廉价、无污染。本方法工艺简单、周期短、产率高，适于工业化生产。
文档编号C12N1/14GK1935992SQ200610096638
公开日2007年3月28日 申请日期2006年10月13日 优先权日2006年10月13日
发明者洪宇植, 肖亚中, 李妍妍, 王林, 房伟 申请人:安徽大学