专利名称：一种黑曲霉菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物及其应用，尤其是一种黑曲霉(Aspergillusniger)ML-0016菌株及其应用。
背景技术：
大豆异黄酮是属于黄酮类化合物中的异黄酮成分。黄酮类化合物的基本母核为2-苯基色原酮的一系列化合物，目前黄酮类化合物泛指两个苯环通过三碳链相互联结而成的一系列化合物。
大豆异黄酮是一种混合物，主要有3类，即大豆甙类、染料木甙类、黄豆甙类，每类以游离型、葡萄糖甙型、乙酰基葡萄糖甙型和丙二酰基葡萄糖甙型等四种形式存在(游离型一般称作甙元，后三类则归结为结合型的糖甙形式)。大豆中的异黄酮分为游离型的甙元和结合型的糖甙两类，游离型的甙元占总量的2％-3％，包括染料木素、大豆素和黄豆黄素。结合型的糖甙占总量的97％-98％，主要以染料木甙、大豆甙、黄豆甙和丙二酰染料木甙、丙二酰大豆甙、丙二酰黄豆甙形式存在。
异黄酮类化合物显微黄色、灰白或无色，紫外线下多显紫色。大豆异黄酮中的染料木素呈灰白色结晶，紫外灯下无荧光，大豆素呈微白色结晶，紫外灯下无荧光。大豆异黄酮的甙元不具有旋光性，但对于结合型的糖甙结构而言，由于结构中引入了糖基，因而具有旋光性。大豆异黄酮的甙元一般难溶或不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂中及稀碱中，大豆异黄酮的结合式甙易溶于甲醇、乙醇、吡啶、乙酸乙酯及稀碱液中，难溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚等有机溶剂，对水溶解度增加，可溶于热水。由于异黄酮分子中有酚羟基，故其显酸性，可溶于碱性水溶液中及吡啶中。
大豆异黄酮具有弱雌激素活性，约相当于十万分之一的雌二醇活性，称为植物雌激素，被认为是雌激素的天然替代品，已引起人们的极大关注，1986年，美国科学家发现大豆中抑制癌细胞的异黄酮。1990年6月，美国国家癌症研究院组织全美著名学者研讨了大豆的抗癌效果，肯定了大豆异黄酮是最佳的天然物质。此后又证实大豆异黄酮可以防止骨质疏松症，减轻妇女更年期不适症及降低冠心病的发病率。为此，美国政府和公众舆论大肆宣传吃大豆食品的好处，尤其是对于含有大豆异黄酮等的食品，身价培增，把大豆异黄酮视为珍品。
总之，大豆异黄酮通过不同的机制起到一定的预防癌症效果，特别是弱雌激素作用，雌性激素不足时可起到类雌激素效果，而雌性激素过剩时又起到抗激素作用。
大豆异黄酮类雌性激素的作用早在1962年就有报道，而预防骨质疏松效果还是在近期才取得进展。另外大豆异黄酮还具有调节血脂、降低血中胆固醇，预防和治疗动脉粥样硬化的作用。
随着人类生活水平的提高，人们越来越重视身体的保健，大豆异黄酮对人体生理代谢具有有益的调节作用，它对于低激素水平者可以起到雌激素样作用，对于高激素水平者可产生抗激素作用，特别是大豆异黄酮有利于预防心血管疾病以及肿瘤等疾病的发生，为人类对慢性疾病的预防提供了可能。我国大豆资源丰富，豆制品种类多样，大豆异黄酮的价值相当可观，具有很好的社会和经济价值，为其开发利用展示了广阔前景。
对于大豆异黄酮，天然苷类的分子结构并不是其活性发挥的最佳状态，普遍认为苷元才是活性发挥的最佳状态，因苷元更容易被人体吸收。大豆异黄酮糖苷不能通过小肠壁，而是通过结肠中微生物的β-葡糖苷酶而水解，水解产物进一步被细胞降解生成苷元。因此，如果能在体外有效地水解葡糖苷为苷元，就可以显著增强大豆异黄酮的生物活性。虽然在酸性或碱性条件下糖苷键可以断裂，并且水解率也很高，但不少人对于酸或碱性条件下大豆异黄酮苷元的稳定性表示怀疑。另外，在强酸或强碱条件下也不易进行工业化生产。而酶水解有其独特的优势，不仅水解条件温和，而且多采用弱酸性缓冲溶液，且大豆异黄酮苷元不易变性。目前获得高活性的大豆异黄酮糖苷水解酶主要有两种途径，一是来源于植物，二是来源于微生物。
在以大豆为原料的食品或抗生素发酵过程中发现，大豆异黄酮糖苷在微生物产生的β-葡糖苷酶作用下不断转化成具有生物活性的苷元形式。如少孢根霉(Rhizopus oligosporus)在丹贝生产过程中、曲霉在豆豉发酵中、红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythaea ATCC 11635)在红霉素生产中、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在纳豆发酵中、双歧杆菌(Bifidobacterium)在豆奶发酵中等产生的β-葡糖苷酶都能使苷元含量增加。此外，可以酶解大豆异黄酮糖苷尤其是染料木素和大豆黄素生成苷元的微生物还有浅玫瑰链霉菌(Streptomyces roseolus ATCC 31047)、嗜卤小单孢菌嗜盐亚种(Micomonospora halophytica subsp.halophytica ATCC27596)、假单孢菌(Pseudomonas ZD-8)、链霉菌(Streptomyces sp.)、雅致放射毛霉(Actinomucorelegans AS3.227)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、德彼利氏乳芽孢杆菌(Lactobacillus debrückii KCTC 1047)、葡枝根霉菌(R.stolonifervuill)等。
微生物产生的β-葡糖苷酶属纤维素酶系中的一个组分，水解纤维素的β-葡糖苷酶能否水解大豆异黄酮糖苷，或者水解大豆异黄酮糖苷的β-葡糖苷酶能否水解纤维素，有关这方面的系统研究尚未见报道。大豆异黄酮在结构上与人参皂苷具有相似性，都是糖基和苷元以氧苷键相连，同属于小分子糖缀合物。陈冠雄等对纤维素和人参皂苷进行了β-葡糖苷酶的活性比较，结果表明，纤维素外切β-葡糖苷酶与人参皂苷β-葡糖苷酶不是同一种酶，其具有底物选择性，是β-葡糖苷酶的亚类。而小分子糖缀合物在自然界中分布很广，其苷元具有多样性。关于糖基与糖基相连的β-葡糖苷酶如纤维素酶的研究较多，而有关水解小分子糖缀合物的β-葡糖苷酶的研究较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黑曲霉(Aspergillus niger)ML-0016菌株，通过该菌株转化大豆异黄酮糖苷，生产大豆异黄酮糖基和苷元。
本发明的目的是这样实现的将保藏号为CCTCC.NO.M206034的黑曲霉(Aspergillus niger)ML-0016菌株接种在9cm马铃薯固体琼脂平板上，28℃培养，菌丝体灰白色，质地疏松，边缘的菌丝稀疏并向四周延伸，菌落中央菌丝呈絮状，上有少量棕色孢子产生；菌落反面呈放射状，培养基无色，孢子数量增加；菌落长满平板后，孢子渐呈黑色；分1生孢子头的顶囊呈近球形，辐射状，棕色至棕黑色，由顶囊、分生孢子和单层小梗组成，分生孢子串生于小梗上，量多，带小刺，普通显微镜下呈球形或近球形，扫描电镜下呈椭圆形或近球形，分生孢子梗壁光滑、无色。
一种保藏号为CCTCC.NO.M206034的黑曲霉(Aspergillus niger)ML-0016菌株的应用，其特征在于通过该菌株转化大豆异黄酮糖苷，生产大豆异黄酮糖基和苷元。
在本发明的应用中通过该菌株转化大豆异黄酮糖苷，生产大豆异黄酮糖基和苷元的方法是对该菌进行发酵，获得酶液或粗酶液；将得到的酶液或粗酶液加入到底物大豆异黄酮溶液中，利用酶液或粗酶液分解底物，然后对水解液中的大豆异黄酮糖基和苷元进行分离，并进行提纯。
在本发明的应用中所述的对该菌进行发酵是将该菌接种至培养基进行发酵，获得种子液，再将该菌接种至斜面或种子液进行发酵，培养菌体获得酶液或粗酶液。
在本发明的应用中所述的培养基按重量kg/体积L的百分比，为大豆异黄酮0.5％～12％，麸皮0.1％～2.0％，蛋白胨0.1％～2.0％，醋酸钠0.1％～1.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.8％，MgSO40.01％～0.1％，抗坏血酸0.1％～0.4％，水杨苷0.05～0.1％，以自来水配制，pH值4.0～7.0。
在本发明的应用中所述的将该菌接种至斜面或种子液进行发酵的培养条件为温度20℃～40℃，初始pH为4.0～7.0，培养时间为24h～120h。
在本发明的应用中培养过程中，在菌体生长对数期后获得酶液，或在菌体生长对数期后进行离心分离得到粗酶液，将得到的粗酶液加入到底物大豆异黄酮溶液中，对水解液中的大豆异黄酮糖基和苷元进行分离。
在本发明的应用中所述的底物大豆异黄酮溶液为用0.02M，pH5.0的HAc-NaAc缓冲液将大豆异黄酮配成浓度为1～10mg/ml的底物溶液，利用粗酶液分解底物，底物浓度为0.5％～15.0％，反应时间1h～100h。
在本发明的应用中所述的反应时间为24h。
本发明的优点在于本发明筛选到的黑曲霉菌株可生产活力相对较高的大豆异黄酮糖苷酶，且该黑曲霉可以利用玉米芯、豆饼粉等工农业生产的废弃物作为营养基质产生大豆异黄酮糖苷酶，有利于使生物法制备大豆异黄酮甙元产业化。酶解法具有反应条件温和，大豆异黄酮苷元不易变性等优点，因此是制备大豆异黄酮苷元的最佳途径。
具体实施例方式实施例1黑曲霉ML-0016菌株的选育豆酱样品中筛选到出发菌株，然后斜面培养(28℃，2～3d)，获得孢子悬浮液；利用NTG分别处理2、4、6、8、10min后，终止诱变，将处理的孢子悬浮液稀释涂皿后在28℃下，培养4～5d。将平皿上的菌落挑出，划线进行纯种分离，然后利用摇瓶进行初筛(28℃，50h)。筛选菌株并选定一株为进一步诱变的出发菌株，配制孢子悬浮液，利用60Coγ射线辐照辐照剂量分别为0rad、3万rad、5万rad、7.5万rad、10万rad、15万rad。将辐照后的孢子悬浮液涂皿培养(28℃，4～5d)将平皿上的菌落挑出，划线进行纯种分离，然后利用摇瓶进行初筛(28℃，50h)。再利用摇瓶进行复筛(28℃，50h)，最终获得优良的产酶菌株，并利用砂土管保藏。
黑曲霉ML-0016菌株的特征菌株接种在9cm马铃薯固体琼脂平板上，28℃培养，菌丝体灰白色，质地疏松，边缘的菌丝稀疏并向四周延伸，菌落中央菌丝呈絮状，上有少量棕色孢子产生；菌落反面呈放射状，培养基无色，孢子数量增加；菌落长满平板后，孢子渐呈黑色；分1生孢子头的顶囊呈近球形，辐射状，棕色至棕黑色，由顶囊、分生孢子和单层小梗组成，分生孢子串生于小梗上，量多，带小刺，普通显微镜下呈球形或近球形，扫描电镜下呈椭圆形或近球形，分生孢子梗壁光滑、无色。
18s rDNA序列分析以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物P15′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′和P25′-TCC TCC GCT TAT TGATAT GC-3′扩增菌株的18S rDNA基因，将基因产物同T载体连接，经测序确认该片段实际长度为382bp，将该序列(已提交GenBank，GenBank登记号为DQ223426)与GenBank中相关数据进行相似性分析发现，该菌与黑曲霉(Aspergillus niger)的同源性最高(homology，98.43％/382bps，based on 18s rDNA)。生理生化鉴定结合分子鉴定，可确认该菌株属于曲霉菌属(Aspergillu)，分类命名为Aspergillus niger。该菌株已于2006年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M206034。
实施例2培养基配方(重量/体积百分比，以下同)脱脂豆粕4％，麸皮2％，蛋白胨0.1％，(NH4)2SO40.1％，KH2PO40.1％，醋酸钠0.1％，抗坏血酸0.1％，MgSO40.1％，NaH2PO4·2H2O0.4％，水杨苷0.05％，pH 6.0，以自来水配制，121℃灭菌20min备用，本实施例中脱脂豆粕可利用工业榨油后的豆粕，具体实施时，其用量可以控制在0.5％～12％范围内。
取100mL上述培养基，平均分装在2个250mL三角瓶中，灭菌。接入保藏编号为CCTCC M 206034的黑曲霉(Aspergillus niger)ML-0016菌株的斜面菌种的培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养24小时作为种子液，备用。
取2L上述培养基，平均分装入40个500mL摇瓶中，灭菌。接入种子液，接种量为1.5％(v/v)，进行培养，培养温度为20℃，培养时间为72h，摇床转速150r/min。收集上述发酵液1.5L，经过离心(10,000×g，10min)除菌之后，加入70％的硫酸铵沉淀蛋白，收集蛋白加入500ml pH 5.0HAc-NaAc缓冲液，作为粗酶液。
实施例3用0.02M，pH 5.0HAc-NaAc缓冲液将大豆异黄酮配成浓度为1～10mg/ml的底物溶液，添加适量乙醇作为底物助剂。取实施例1中的制备粗酶液50ml，将粗酶液和底物溶液(底物浓度为0.5％～15.0％)按照1∶1的比例混合进行，在20℃～50℃下进行酶解反应，1～10h后，获得酶解液100ml。
实施例4将实施例3获得的酶解液进行过滤得到的清液85ml，加2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，减压蒸干，得到大豆异黄酮粗品，用硅胶柱进行分离。
实施例5按实施例1的方法，利用10L发酵罐产酶，按实施例2的方法，用10L的反应罐进行水解反应，pH值用无机酸或有机酸、碱类自动调节，pH值控制在5.0，按实施例3的方法进行产物的分离和提取。结果为发酵时间2天，酶活达到162.75U，酶解后产物提取率为70％。
权利要求
1.一种黑曲霉(Aspergillus niger)ML-0016菌株，其特征在于保藏号为CCTCC.NO.M206034的菌株接种在9cm马铃薯固体琼脂平板上，28℃培养，菌丝体灰白色，质地疏松，边缘的菌丝稀疏并向四周延伸，菌落中央菌丝呈絮状，上有少量棕色孢子产生；菌落反面呈放射状，培养基无色，孢子数量增加；菌落长满平板后，孢子渐呈黑色；分1生孢子头的顶囊呈近球形，辐射状，棕色至棕黑色，由顶囊、分生孢子和单层小梗组成，分生孢子串生于小梗上，量多，带小刺，普通显微镜下呈球形或近球形，扫描电镜下呈椭圆形或近球形，分生孢子梗壁光滑、无色。
2一种保藏号为CCTCC.NO.M206034的黑曲霉(Aspergillus niger)ML-0016菌株的应用，其特征在于通过该菌株转化大豆异黄酮糖苷，生产大豆异黄酮糖基和苷元。
3.根据权利要求2所述的保藏号为CCTCC.NO.M206034的黑曲霉(Aspergillus niger)ML-0016菌株的应用，其特征在于通过该菌株转化大豆异黄酮糖苷，生产大豆异黄酮糖基和苷元的方法是对该菌进行发酵，获得酶液或粗酶液；将得到的酶液或粗酶液加入到底物大豆异黄酮溶液中，利用酶液或粗酶液分解底物，然后对水解液中的大豆异黄酮糖基和苷元进行分离，并进行提纯。
4.根据权利要求3所述的保藏号为CCTCC.NO.M206034的黑曲霉(Aspergillus niger)ML-0016菌株的应用，其特征在于所述的对该菌进行发酵是将该菌接种至培养基进行发酵，获得种子液，再将该菌接种至发酵培养基进行发酵，培养菌体获得酶液或粗酶液。
5.根据权利要求4所述的保藏号为CCTCC.NO.M206034的黑曲霉(Aspergillus niger)ML-0016菌株的应用，其特征在于所述的培养基按重量kg/体积L的百分比，为大豆异黄酮0.5％～12％，麸皮0.1％～2.0％，蛋白胨0.1％～2.0％，醋酸钠0.1％～1.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.8％，MgSO40.01％～0.1％，抗坏血酸0.1％～0.4％，水杨苷0.05～0.1％，以自来水配制，pH值4.0～7.0。
6.根据权利要求4所述的保藏号为CCTCC.NO.M206034的黑曲霉(Aspergillus niger)ML-0016菌株的应用，其特征在于所述的将该菌接种至斜面或种子液进行发酵的培养条件为温度20℃～40℃，初始pH为4.0～7.0，培养时间为24h～120h。
7.根据权利要求6所述的保藏号为CCTCC.NO.M206034的黑曲霉(Aspergillus niger)ML-0016菌株的应用，其特征在于培养过程中，在菌体生长对数期后获得酶液，或在菌体生长对数期后进行离心分离得到粗酶液，将得到的粗酶液加入到底物大豆异黄酮溶液中，对水解液中的大豆异黄酮糖基和苷元进行分离。
8.根据权利要求3或7所述的保藏号为CCTCC.NO.M206034的黑曲霉(Aspergillus niger)ML-0016菌株的应用，其特征在于所述的底物大豆异黄酮溶液为用0.02M，pH5.0的HAc-NaAc缓冲液将大豆异黄酮配成浓度为1～10mg/ml的底物溶液，利用粗酶液分解底物，底物浓度为0.5％～15.0％，反应时间1h～100h。
9.根据权利要求8所述的保藏号为CCTCC.NO.M206034的黑曲霉(Aspergillus niger)ML-0016菌株的应用，其特征在于所述的反应时间为24h。
全文摘要
本发明涉及一种黑曲霉(Aspergillus niger)ML－0016菌株及其应用，其特征是保藏号为CCTCC.NO.M206034的黑曲霉(Aspergillus niger)ML－0016菌株。一种保藏号为CCTCC.NO.M206034的黑曲霉(Aspergillus niger)ML－0016菌株的应用，通过该菌株转化大豆异黄酮糖苷，生产大豆异黄酮糖基和苷元。其优点在于本发明筛选到的黑曲霉菌株可生产活力相对较高的大豆异黄酮糖苷酶，且该黑曲霉可以利用玉米芯、豆饼粉等工农业生产的废弃物作为营养基质产生大豆异黄酮糖苷酶，有利于使生物法制备大豆异黄酮甙元产业化。酶解法具有反应条件温和，大豆异黄酮苷元不易变性等优点，因此是制备大豆异黄酮苷元的最佳途径。
文档编号C12R1/685GK1924000SQ20061009635
公开日2007年3月7日 申请日期2006年9月21日 优先权日2006年9月21日
发明者齐斌, 余向阳, 刘媛, 刘贤金 申请人:江苏省农业科学院