专利名称：作物种子的脂肪酶活性精确定量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻种子脂肪酶活性的定量检测方法，该方法可以对少量样品的水稻种子脂肪酶活性进行定量分析，满足科研工作的需要。
背景技术：
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)是一种分解中性脂肪三脂酰甘油的水解酶，在动植物组织以及多种微生物中普遍存在。
水稻是我国最重要的粮食作物，但其不耐储藏，第二年就会陈化变质。近年来许多研究表明，稻谷种子储藏过程中脂类水解氧化可能是导致其陈化的最主要因素。而脂肪酶是脂肪分解代谢中第一个参与反应的酶，对脂肪转化速率起调控的作用。脂肪酶活性低的材料可明显延缓稻谷衰老过程，保持稻谷的清新气味，自然老化和人工加速老化实验结果也证实这一点。因此脂肪酶与水稻耐储性关系机理研究是解决稻谷耐储藏问题的关键，并且我们可以利用种子脂肪酶缺失材料选育耐储藏水稻品种。长期以来关于稻谷陈化的研究虽然很多，但关于水稻脂肪酶在种子脂肪分解代谢中的作用及机制，相关基因的遗传等研究国内外还没有报道。对于水稻种子脂肪酶的研究多集中于其生化特性或应用领域如米糠稳定化等，对其与稻谷陈化关系研究较少。水稻脂肪酶含量和活性很低，一种经济灵敏的定量检测方法的缺乏是制约广大研究人员对耐储藏机理进行研究的瓶颈。
文献中报道的脂肪酶测定方法有很多，目前尚没有公认统一方法。通常用滴定法，脂肪酸比色法，酶偶联法等方法来检测1滴定法根据酶解产物脂肪酸增量与酶活呈正相关的原理进行测定，用标准NaOH溶液滴定脂肪酸使酸碱指示剂变色，根据NaOH的用量来计算酶活。缺点该体系中含有缓冲液，产生的脂肪酸为弱酸，指示剂终点变色不明显都造成该滴定方法不准确，不灵敏。目前文献中水稻种子中脂肪酶的测定多采用该方法，但该方法只能用于大量整粒材料粉碎，准确性和灵敏度均不高。
2脂肪酸比色法
2.1利用产物脂肪酸与铜离子形成铜皂，用有机溶剂萃取后，加入铜显色剂后测定其OD，计算出脂肪酸浓度。据文献报道该方法也可用于种子脂肪酶测定，但也只局限于用大量整粒种子粉碎后的副产品如米糠作为实验对象。而且，采用的实验体系绝大多数为乳化液体系，存在酶催化效率较低和乳化液不透明，不适合用光学手段定量分析等缺点，仅能定性判断水稻种子脂肪酶活性。
2.2利用脂肪酸与罗丹明6G结合成复合物，该复合物可用正己烷萃取获得，测定其OD，计算出脂肪酸浓度。该法多用于判断微生物产脂肪酶能力。
3酶偶联法酶偶联比色法，最常用有以1，2-二亚麻酸甘油酯为底物，脂肪酶催化水解得亚麻酸和2-亚麻酸甘油酯。亚麻酸经氧化及酶偶联系统产生NADH，NADH的增加可由分光光度法在340nm处检测出，以此确定脂肪酶的活性。酶偶联法所涉及的步骤较多，需多种酶参与，故应用范围不广，主要在医学实验室采用。
此外，还可用原子显微镜法，红外线光谱学法，荧光分析法，液相色谱法，放射性元素标记法等测定脂肪酶活力。
目的作物种子脂肪酶活性的定量检测方法，其步骤如下(1)、取作物种子的脂肪酶富集部位，用Tris-HCl缓冲液浸提得到酶提取液；(2)、配制乙酸铜、吡啶的水溶液，作为脂肪酸显色剂；(3)、配制tween-20和橄榄油组成的底物乳化液；(4)、取酶提取液加入底物乳化液，在35-37℃水浴震荡至反应完毕，再加入异辛烷，充分震荡，将该混合物倒入分液漏斗，静置分层，除去下层水相，移取上层有机相，在该移取液中加入显色剂，充分震荡混匀；最后离心取上清液于710nm比色；酶活性管中上清液吸光值的高低对应于脂肪酶活性的高低；(5)、脂肪酸吸光度工作曲线的制定和脂肪酶活力的定义与计算，配制一系列不同浓度的正辛酸/异辛烷溶液于离心管中，在步骤(4)同样的反应条件下，加脂肪酸显色剂，震荡离心后取上层有机相在710nm下测定吸光度，用异辛烷作参比，以吸光度对正辛酸浓度作图，得一直线，即为脂肪酸吸光度工作曲线，由曲线得到计算种子脂肪酶活力的计算公式；同时，将每ml反应体系中生成0.001mg脂肪酸定义为一个酶活力单位U。
所述的作物种子脂肪酶活性的定量检测方法，其特征在于具体步骤如下(1)、取水稻、玉米、油菜、花生或大豆等作物种子的种子胚或者种胚和糊粉层放入研钵中，加入PH 7.5Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，浸提30min，获得酶提取液；(2)、称取5g乙酸铜，溶解于100ml蒸馏水中，再加入3ml吡啶，得脂肪酸显色剂；(3)、将tween-20和橄榄油按1∶1重量比混合，经高速震荡均质化，得底物乳化液；(4)、取1ml酶提取液于大试管内，再加入5ml乳化液，37℃水浴震荡20小时，反应完毕后，加入7ml异辛烷，充分震荡1min，将该混合物倒入分液漏斗，静置分层，除去下层水相，移取上层有机相5ml，在该移取液中加入1ml显色剂，充分震荡混匀5min；最后，8500rpm离心15min。取上清液于710nm比色；酶活性管中上清液吸光值的高低对应于脂肪酶活性的高低；(5)、脂肪酸吸光度工作曲线的制定和脂肪酶活力的定义与计算，配制一系列不同浓度的正辛酸/异辛烷溶液4ml于7ml离心管中，加1ml脂肪酸显色剂，震荡离心后取上层有机相在710nm下测定吸光度，用异辛烷作参比，以吸光度对正辛酸浓度(mg/ml)作图，得一直线，即为脂肪酸吸光度工作曲线，由曲线得到计算种子脂肪酶活力的计算公式；同时，在上述反应条件下，将每ml反应体系中生成0.001mg脂肪酸定义为一个酶活力单位U。
所取作物种子的数量为水稻种子10-50粒、玉米胚2粒～5粒、小麦种胚10粒～50粒、油菜种子5～10粒、大豆和花生1片子叶或种胚2粒～5粒，放入1.2ml PH 7.5Tris-HCl缓冲液中浸提。
前文献中报道的水稻种子脂肪酶检测方法有的需要大量种子加工成米糠作为实验对象或仅能定性判断，方法的准确度和灵敏度均比较低；有的需要分离纯化，步骤复杂，成本昂贵，需要较高的实验室条件和特定的专业技术人员，不适合用于研究，更不适合大规模选育脂肪酶缺失的耐储藏品种。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的水稻种子脂肪酶的检测方法，既可以直观的判断作物中脂肪酶的有无，又可以实现精确定量。
本发明方法仅用少量种子即可精确定量该品种水稻种子脂肪酶的活性，无需分离纯化，为大规模选育脂肪酶缺失的耐储藏水稻品种和从生理生化，细胞，遗传，分子等方面进行水稻耐储藏机理研究提供了一个简易，高效，经济，准确的技术平台。
本发明的作物种子脂肪酶活性的定量检测方法，其步骤如下(1)、取作物种子的脂肪酶富集部位，用Tris-HCl缓冲液浸提得到酶提取液；(2)、配制乙酸铜、吡啶的水溶液，作为脂肪酸显色剂；(3)、配制tween-20和橄榄油组成的底物乳化液；(4)、取酶提取液加入底物乳化液，在35-37℃水浴震荡至反应完毕，再加入异辛烷，充分震荡，将该混合物倒入分液漏斗，静置分层，除去下层水相，移取上层有机相，在该移取液中加入显色剂，充分震荡混匀；最后离心取上清液于710nm比色；酶活性管中上清液吸光值的高低对应于脂肪酶活性的高低；(5)、脂肪酸吸光度工作曲线的制定和脂肪酶活力的定义与计算，配制一系列不同浓度的正辛酸/异辛烷溶液于离心管中，在步骤(4)同样的反应条件下，加脂肪酸显色剂，震荡离心后取上层有机相在710nm下测定吸光度，用异辛烷作参比，以吸光度对正辛酸浓度作图，得一直线，即为脂肪酸吸光度工作曲线，由曲线得到计算种子脂肪酶活力的计算公式；同时，将每ml反应体系中生成0.001mg脂肪酸定义为一个酶活力单位U。
其具体步骤如下(1)、取水稻、玉米、油菜、花生或大豆等作物种子的种子胚或者种胚和糊粉层放入研钵中，加入PH 7.5Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，浸提30min，获得酶提取液；(2)、称取5g乙酸铜，溶解于100ml蒸馏水中，再加入3ml吡啶，得脂肪酸显色剂；(3)、将tween-20和橄榄油按1∶1重量比混合，经高速震荡均质化，得底物乳化液；(4)、取1ml酶提取液于大试管内，再加入5ml乳化液，37℃水浴震荡20小时，反应完毕后，加入7ml异辛烷，充分震荡1min，将该混合物倒入分液漏斗，静置分层，除去下层水相，移取上层有机相5ml，在该移取液中加入1ml显色剂，充分震荡混匀5min；最后，8500rpm离心15min。取上清液于710nm比色；酶活性管中上清液吸光值的高低对应于脂肪酶活性的高低；(5)、脂肪酸吸光度工作曲线的制定和脂肪酶活力的定义与计算，配制一系列不同浓度的正辛酸/异辛烷溶液4ml于7ml离心管中，加1ml脂肪酸显色剂，震荡离心后取上层有机相在710nm下测定吸光度，用异辛烷作参比，以吸光度对正辛酸浓度(mg/ml)作图，得一直线，即为脂肪酸吸光度工作曲线，由曲线得到计算种子脂肪酶活力的计算公式；同时，在上述反应条件下，将每ml反应体系中生成0.001mg脂肪酸定义为一个酶活力单位U。
所取作物种子的数量为水稻种子10-50粒、玉米胚2粒～5粒、小麦种胚10粒～50粒、油菜种子5～10粒、大豆和花生1片子叶或种胚2粒～5粒，放入1.2ml PH 7.5Tris-HCl缓冲液中浸提。
本检测方法原理本实验利用不同实验材料胚中脂肪酶催化生成的脂肪酸的量的多少在有机相中颜色深浅而区分，定量用分光光度计测定脂肪酸的含量(脂肪酸与铜离子形成铜皂，经有机溶剂萃取后进行比色测定，铜皂在710nm附近有一宽吸收峰)。此外，本实验体系采用微乳体系，与以往采用的乳化液体系相比，可以获得更高的脂肪酶催化效率，而且该体系澄清透明，适合用分光光度法对产物进行定量分析。水稻种子中脂肪酶含量及活性均较低，该检测技术基于上述原理，经酶动力学分析优化后可以更加灵敏的检测水稻种子中该酶活性。
本检测方法的优点与用途优点(1)该方法以水稻胚作为实验材料而不是整粒种子或者米糠，用量少而且准确度高，并且避免了一些繁琐的加工过程.
(2)该方法无需精密的试验仪器和复杂的实验方法，具有简便易行的特点，对于使用者来说成本低廉，易于操作，适于在实验室，种子或食品检验部门等单位普遍推广，更适合于大规模检测选育脂肪酶缺失的耐储藏作物品种。
(3)该方法同时提供脂肪酶存在和缺失的阴、阳对照，可对结果定性判断，但主要用于精确定量。
(4)该方法用于精确定量时灵敏度高，稳定性好，重现性好，分辨率高，不同材料的样品之间区分度好，对于同一样品批间和批内差异系数均较小。并且通过制定脂肪酸标准曲线，将测得的吸光度和反应体系中脂肪酸浓度的变化对应起来，并通过自定义酶活力单位，将不同样品的脂肪酶活力完全量化。
(5)该方法可广泛应用推广到各种作物如大豆，玉米，花生等作物脂肪酶的精确定量。
用途(1)可在高校，科研院所普遍推广，为水稻耐储藏机理研究，脂肪酶生化特性研究等提供一个经济，高效的技术平台。
(2)粮食加工部门等单位作为粮食加工和贮运过程中品质的依据。例如，米糠在贮运和制油过程中易发生酸败，导致品质下降，主要由于米糠中活性较高的脂肪酶.该方法即可为米糠加工和运输过程稳定化以及米糠脂肪酶分离纯化提供技术平台。
(3)育种部门大规模检测选育脂肪酶缺失的耐储藏作物品种，亦可根据脂肪酶酶活性决定该材料的利用价值。
(4)食品、医药行业作为原料质量标准之一。
图1脂肪酸标准曲线。
图2脂肪酶活性高低不同的水稻材料的老化指数。
具体实施例方式
实施例1一、酶提取液的提取取水稻种子胚10粒～50粒放入研钵中，加入1.2mlph7.5Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，浸提30min。
二、底物乳化液的配制将tween-20和橄榄油按1∶1(W/W)混合，经高速震荡均质化，得底物乳化液。该乳化液中tween-20和橄榄油均为30mg/ml。
三、脂肪酸显色剂的配制称取5g乙酸铜，溶解于100ml蒸馏水中，过滤，再加入3ml吡啶，得脂肪酸显色剂。
四、脂肪酶活力测定粗酶浸提液中取1ml酶液于大试管内，再加入5ml乳化液，37℃水浴震荡20小时。反应完毕后，加入7ml异辛烷，充分震荡1min，将该混合物倒入60ml梨形分液漏斗，静置分层，除去下层水相，移取上层有机相5ml，在该移取液中加入1ml显色剂，充分震荡混匀5min。最后，8500rpm离心15min。取上清液于710nm比色。上清液吸光值的高低对应于脂肪酶活性的高低。对照管实验方法同上，用1ml PH7.5Tris-HCl缓冲液代替1ml酶液，其余条件不变。
参比管实验方法同上，用1ml PH7.5Tris-HCl缓冲液代替1ml酶液，用5ml去离子水代替5ml乳化液，其余条件不变。比色时，脂肪酶活性管和对照管均用参比管调零。
五、脂肪酸吸光度工作曲线的制定配制一系列不同浓度的正辛酸/异辛烷溶液4ml于7ml离心管中，加1ml铜指示剂，震荡离心后取上层有机相在710nm下测定吸光度，用异辛烷作参比，以吸光度对正辛酸浓度(mg/ml)作图，得一直线，既为脂肪酸吸光度工作曲线，如下图1。该标准曲线相关系数较好，该回归方程y＝0.3485x+0.1898(0.1979＜＜x＜＜0.8816)可以代表OD和游离脂肪酸浓度之间的关系。该标准曲线在正辛酸浓度在0.11375mg/ml-2.275mg/ml之间，吸光度在0.1979-0.9816之间呈现良好的线形关系。
六脂肪酶活力的定义与计算假设某样品管用上述方法测得OD值为Y，对照管OD值为Y0，脂肪酶活性管Y与对照管Y0差值查标准曲线得该反应体系中游离脂肪酸浓度的变化，以上述反应条件下每ml反应体系中生成0.001mg脂肪酸作为一个酶活力单位，则该样品的脂肪酶活力为A=(Y-Y0-0.1898)/0.34850.001*75]]>(0.1979＜＜Y-Y0＜＜0.8816)
A为该样品脂肪酶总活力，单位为U。
由于底物橄榄油亦可以在水浴过程中分解生成游离脂肪酸，所以我们要设对照管排除橄榄油的本底干扰作用。用脂肪酶活性管Y与对照管Y0差值代表样品中产生的游离脂肪酸引起的吸光度变化，即脂肪酶的相对活性。将(Y-Y0)代入上述回归方程可得该样品管中游离脂肪酸浓度的变化量，再根据本文中对脂肪酶酶活的定义可以得到样品脂肪酶的总活力。
实施例2使用同批或不同批次试剂溶液，在上述选定的实验条件下，用上述实验方法对同一样品290作六次平行实验，结果见表1。Y-Y0代表脂肪酶的相对活力。
表1脂肪酶定量检测方法的精密度实验对表4结果进行统计计算，样品平行测定6次相对标准偏差(RSD)＝2.70％。笔者亦采用其他样品进行实验，RSD均小于5％，结果较为稳定，同一样品的批间和批内的重复性均较好，该方法可以作为定量测定稻谷脂肪酶活力的分析方法。
实施例3该方法建立并优化后，笔者用该法检测了06年收的DawDam，汕优63，冲腿，通过离子束诱变建立起的皖鉴290种质材料，实验时每个品种设两个平行，实验结果取平均值，
表2典型水稻材料脂肪酶活检测结果和不同老化时间的发芽率并结合人工加速老化实验结果，脂肪酶活力(U)和发芽率见表2。从表2和图2中可以看出，随着老化时间延长，种子发芽率降低，老化指数均逐渐变大，不同材料之间差别也非常明显。1377和1335发芽率降低迅速，老化指数增加很快，它们的脂肪酶活性很高。脂肪酶活性较低的1297和290老化指数也相对较低。不耐储藏的冲腿以及DawDam材料脂肪酶活性亦较高。
权利要求
1.作物种子脂肪酶活性的定量检测方法，其步骤如下(1)、取作物种子的脂肪酶富集部位，用Tris-HCl缓冲液浸提得到酶提取液；(2)、配制乙酸铜、吡啶的水溶液，作为脂肪酸显色剂；(3)、配制tween-20和橄榄油组成的底物乳化液；(4)、取酶提取液加入底物乳化液，在35-37℃水浴震荡至反应完毕，再加入异辛烷，充分震荡，将该混合物倒入分液漏斗，静置分层，除去下层水相，移取上层有机相，在该移取液中加入显色剂，充分震荡混匀；最后离心取上清液于710nm比色；酶活性管中上清液吸光值的高低对应于脂肪酶活性的高低；(5)、脂肪酸吸光度工作曲线的制定和脂肪酶活力的定义与计算，配制一系列不同浓度的正辛酸/异辛烷溶液于离心管中，在步骤(4)同样的反应条件下，加脂肪酸显色剂，震荡离心后取上层有机相在710nm下测定吸光度，用异辛烷作参比，以吸光度对正辛酸浓度作图，得一直线，即为脂肪酸吸光度工作曲线，由曲线得到计算种子脂肪酶活力的计算公式；同时，将每ml反应体系中生成0.001mg脂肪酸定义为一个酶活力单位U。
2.根据权利要求1所述的作物种子脂肪酶活性的定量检测方法，其特征在于具体步骤如下(1)、取水稻、玉米、油菜、花生或大豆等作物种子的种子胚或者种胚和糊粉层放入研钵中，加入PH 7.5Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，浸提30min，获得酶提取液；(2)、称取5g乙酸铜，溶解于100ml蒸馏水中，再加入3ml吡啶，得脂肪酸显色剂；(3)、将tween-20和橄榄油按1∶1重量比混合，经高速震荡均质化，得底物乳化液；(4)、取1ml酶提取液于大试管内，再加入5ml乳化液，37℃水浴震荡20小时，反应完毕后，加入7ml异辛烷，充分震荡1min，将该混合物倒入分液漏斗，静置分层，除去下层水相，移取上层有机相5ml，在该移取液中加入1ml显色剂，充分震荡混匀5min；最后，8500rpm离心15min。取上清液于710nm比色；酶活性管中上清液吸光值的高低对应于脂肪酶活性的高低；(5)、脂肪酸吸光度工作曲线的制定和脂肪酶活力的定义与计算，配制一系列不同浓度的正辛酸/异辛烷溶液4ml于7ml离心管中，加1ml脂肪酸显色剂，震荡离心后取上层有机相在710nm下测定吸光度，用异辛烷作参比，以吸光度对正辛酸浓度(mg/ml)作图，得一直线，即为脂肪酸吸光度工作曲线，由曲线得到计算种子脂肪酶活力的计算公式；同时，在上述反应条件下，将每ml反应体系中生成0.001mg脂肪酸定义为一个酶活力单位U。
3.权利要求2所述的检测方法，其特征在于所取作物种子的数量为水稻种子10-50粒、玉米胚2粒～5粒、小麦种胚10粒～50粒、油菜种子5～10粒、大豆和花生1片子叶或种胚2粒～5粒，放入1.2ml PH 7.5Tris-HCl缓冲液中浸提。
全文摘要
本发明属于一种作物种子脂肪酶活性的定量检测方法，是取作物种子的脂肪酶富集部位，用Tris－HCl缓冲液浸提得到酶提取液；配制乙酸铜、吡啶的水溶液，作为脂肪酸显色剂；以tween－20和橄榄油组成的底物乳化液；取酶提取液加入底物乳化液，在35－37℃水浴震荡至反应完毕，再加入异辛烷混匀，移取有机相，加入显色剂，最后离心取上清液于710nm比色；酶活性管中上清液吸光值的高低对应于脂肪酶活性的高低。通过制定脂肪酸标准曲线，将测得的吸光度和反应体系中脂肪酸浓度的变化对应起来，并通过自定义酶活力单位，将不同样品的脂肪酶活力完全量化。该方法用于精确定量时灵敏度高，稳定性好，重现性好，分辨率高。
文档编号C12Q1/00GK1967212SQ20061009752
公开日2007年5月23日 申请日期2006年11月3日 优先权日2006年11月3日
发明者刘洁, 张瑛, 吴跃进, 余增亮, 宋美, 任冲, 蒋家月 申请人:中国科学院等离子体物理研究所