专利名称：检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸性质的方法。
背景技术：
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性。基因调控区和编码区的SNPs比其它区位上的SNPs更可能造成功能上的变化。分型这些双等位基因标志给鉴定致病基因、建立药物靶向治疗以及个体化给药提供了很大的可能。因此，无论是学术界还是商业界对建立一种快速、敏感而经济的检测SNP的方法都有浓厚的兴趣。
许多经典的方法，如限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析和凝胶迁移率变动分析法等，因受繁琐的操作程序、突变位点以及靶序列构象的限制而限制了应用范围。这些方法所需的检测时间长，并且需要有经验的技术员来分析最终结果。近来，出现了许多新的快速分型SNP的技术。如基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)原理的单管快速SNP检测法、基于等位基因特异性引物延伸并且利用绿色和红色荧光标记的单核苷酸基因分型法、利用淬灭基团延伸(Quencher extension，QEXT)实时闭管检测SNP法、双联蝎型引物分析SNP技术、固相支持SNP分型法、使用核酸外切酶III/核酸酶S1/PNA体系直接正向检测SNP法、孪生探针法、多态核酸探针偶联聚合物检测法以及利用全程TaqMan实时定量数据自动基因分型法等。然而，以上所提及的技术需要昂贵的试剂，并且在中国，除了TaqMan探针及分子信标探针之外，极少有公司修饰其它类型的探针(包括FRET探针)。上述方法中，如酶切法等时间较长、标记范围也较小。
还有采用分子信标探针进行SNP检测的方法采用人工合成的荧光标记寡核苷酸探针，该探针的两端由5～7个与靶序无关的互补碱基组成，一端标记荧光报告基团，另一端标记淬灭基团。这样在游离状态下，荧光探针两端互补折叠成茎环结构，寡核苷酸探针的荧光报告基团与淬灭基团在空间非常接近，此时荧光报告基团经激发后发射出的荧光能量被淬灭基团吸收，不产生荧光信号，表现为荧光淬灭。而当探针与靶DNA杂交后，探针的茎环结构被破坏，淬灭基团离开荧光报告基团，经激发后荧光报告基团所产生的荧光信号向外发出。因而可以根据所发射荧光的情况，判断是否有碱基突变。但是，这种方法在进行探针的设计时，其标记的范围较小。
中国专利申请200310119928.3公开了一种用荧光共振能量转移而进行SNP检测的方法，该方法选择两种探针，一种探针结合有荧光团供体，另一种探针结合有荧光团受体，在激发光的照射下，荧光团供体受激向荧光团受体提供荧光，荧光团受体发出荧光，从而可以根据荧光团受体发出荧光的变化量来确定解链峰值所对应的温度值，该温度值低于解链温度时则确定目的核酸中存在一单核苷酸多态性。这种方法中随着探针的脱落，荧光强度由大变小，而不是由小变大。可与探针的寡核苷酸链结合的荧光团供体或荧光团受体的选取有一定的要求，因而成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种成本较低、操作方便、检测时间较短、可供选择的标记范围较大而成功率较高的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法。
实现本发明目的的技术方案是本发明的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，具有以下步骤①确定要对某种生物的脱氧核糖核酸的某种基因进行检测，也就是确定待测DNA片段，而该待测DNA片段的一条单链上具有第一序列和第二序列，所述的第一序列是指该序列中的某一个特定核苷酸可能发生变异的一段核苷酸序列，第二序列是指与第一序列核苷酸相靠近的一段核苷酸序列；②制备可称为敏感探针的一种寡核苷酸探针、以及制备可称为锚定探针的另一种寡核苷酸探针；所述敏感探针互补于与待测DNA片段的第一序列相对应的野生型基因的相应DNA片段的相应序列、或互补于与待测DNA片段的第一序列相对应的突变型基因的相应DNA片段的相应序列，敏感探针的一端仅一端结合有荧光报告基团或淬灭基团；所述锚定探针与待测DNA片段的第二序列互补，锚定探针的一端仅一端在敏感探针结合有荧光报告基团时结合有淬灭基团、在敏感探针结合有淬灭基团时结合有荧光报告基团；敏感探针的融解温度的值低于锚定探针的融解温度的值；③制备合适的两个寡核苷酸引物，该两个寡核苷酸引物中的一个寡核苷酸引物与上述待测DNA片段的具有第一序列和第二序列的单链的一端互补，该两个寡核苷酸引物中的另一个寡核苷酸引物与上述待测DNA片段的另一条单链的另一端互补；④由过量的底物、DNA聚合酶、过量的寡核苷酸引物、以及含有待测DNA片段的脱氧核糖核酸组成反应体系，还加入敏感探针和锚定探针，且敏感探针和锚定探针的数量基本相同；在上述反应体系中进行聚合酶链式反应，而使上述待测DNA片段扩增；⑤对上述进行聚合酶链式反应后的体系加热，直至使扩增后的待测DNA片段变性而使其双链解开，然后降温而使敏感探针和锚定探针杂交于扩增后的待测DNA片段的含有第一序列和第二序列的单链上，因为荧光报告基团与淬灭基团相互临近且数量相当，所以若对探针上的荧光报告基团进行激发，则其所被激发出的荧光被结合于同一条链上的另一个探针的荧光淬灭基团淬灭，对外不显示荧光；⑥加热杂交后的体系，结合于待测DNA片段的单链上的第一序列上的敏感探针会先脱落下来，若此时对探针上的荧光报告基团进行激发，则因为敏感探针的脱落而对外显示出荧光，随着温度的继续升高，敏感探针脱落增加，荧光强度也随着增强，将其中的荧光强度增量变化最大时的温度作为融解温度；若该融解温度值与同样条件下野生型基因的相应的DNA片段的相应的融解温度值之间有明显的差别，则说明所测脱氧核糖核酸具有单核苷酸多态性。
上述步骤②中的锚定探针的融解温度的值低于步骤③中寡核苷酸引物的融解温度的值。步骤②中结合于探针的荧光报告基团可以是6-羧基荧光素，结合于探针的淬灭基团可以是6-羧基四甲基罗丹明。
上述步骤④的体系中的待测脱氧核糖核酸为1.6～3.2ng/μl。步骤④中所加入的每一种探针在体系中的浓度为4×103～8×104pM。步骤④中进行聚合酶链式反应的方法是，在90℃～95℃下预变性1分钟，接着开始循环，也即90℃～95℃的温度下保持0秒，以温度转换率为每秒20℃的速度降温至55℃～61℃、保持10秒，再以温度转换率为每秒20℃的速度升温至70℃～75℃、保持10秒，再以温度转换率为每秒20℃的速度升温至90℃～95℃，如此便完成了一个循环；一共运行25～40个循环。步骤④中待测脱氧核糖核酸的待测DNA片段可以是肿瘤坏死因子受体II、或载脂蛋白M。
上述步骤⑤中加热体系使待测DNA片段的双链解开的温度为90℃～95℃，降温而使敏感探针和锚定探针杂交于扩增后的待测DNA片段的含有第一序列和第二序列的单链上的温度为30℃～40℃；上述步骤⑥中升温速度为每秒0.1℃，最高温度为80℃。步骤⑥中，当待测DNA片段的单链上的敏感探针脱落下来的融解温度与野生型基因的相应的DNA片段的相应的融解温度值之差的绝对值为5℃～10℃时，则判断所测脱氧核糖核酸具有单核苷酸多态性。
本发明具有积极的效果(1)本发明的方法操作简单、时间较短、可在单管中快速检测SNP，从而成本较低。本发明的方法仅仅需要两条引物和两条探针，是最简单、最经济的SNP分型方法之一。在中国，很多生物技术公司都进行FAM和TAMRA的修饰，因此，研究人员或试剂开发公司很容易得到此项服务。虽然本法使用了两条探针，但合成和修饰的总费用仅仅为1000 RMB/5 OD左右。这比合成和修饰一条TaqMan探针还要便宜(1600 RMB/5 OD)。一般来说，PCR产物通常饱和在～1011个分子/μl，因此，检测SNP时每个反应使用2pmol探针就足够了。应该注意的是，由于未杂交探针在被激发情况下释放的荧光不能被淬灭，因而高浓度的探针会因增加荧光本底而影响本法的敏感性。因此，5 OD的探针约可检测10000份标本。从这个意义上来说，本法是非常经济实惠的。(2)在PCR产物融解过程中，基因序列的差异可通过敏感探针融解温度的变化来检测。当温度慢慢升高时，敏感探针从靶序列上脱落，两个荧光基团不再相邻，淬灭基团对荧光报告基团受激发出的荧光不再起淬灭作用，从而导致荧光突然大量增加。荧光增量变化最大时的温度称为融解温度。突变型基因的融解温度与野生型基因的融解温度具有明显的差异。典型的野生型纯合子标本会呈现单一的融解谷，对于杂合子而言，则可见两个融解谷。突变型纯合子则会出现一个与野生型纯合子不同温度的融解谷。由一个碱基错配而造成的温度漂移通常在5℃～10℃之间，并且很容易识别。(3)荧光淬灭探针的TM值必须低于引物的TM值，以避免Taq DNA聚合酶的切割。而且敏感探针的TM值应该低于锚定探针的TM值，以保证在融解曲线分析时荧光信号的产生仅仅依赖于敏感探针。(4)本发明在制备探针时，因为可供选择的基本方案就可达16种，因此对于目标基因的可供选择的标记范围较大，从而可以使成功率较高。(5)本检测方法已通过DNA测序的验证，适用于大批量基因分型的研究。
图1为本发明的方法的检测原理图。
图2为本发明的方法中探针的设计方案图。
图3为本发明的方法中肿瘤坏死因子受体II的融解曲线分析图；其中曲线1为G/G纯合子融解曲线分析图；曲线2为T/T纯合子融解曲线分析图；曲线3为T/G杂合子融解曲线分析图；曲线4为阴性对照融解曲线分析图。
图4为本发明的方法中待测脱氧核糖核酸的待测DNA片段是肿瘤坏死因子受体II的部分测序结果图；其中图4(A)为突变型基因部分测序结果图，图4(B)为野生型基因部分测序结果图，图中箭头所指为突变位点。
图5为本发明的方法中载脂蛋白M的融解曲线分析图；其中曲线1为T/T纯合子融解曲线分析图；曲线2为C/C纯合子融解曲线分析图；曲线3为T/C杂合子融解曲线分析图；曲线4为阴性对照融解曲线分析图。
图6为本发明的方法中待测脱氧核糖核酸的待测DNA片段是载脂蛋白M的部分测序结果图；其中图6(A)为突变型基因部分测序结果图，图6(B)为野生型基因部分测序结果图，图中箭头所指为突变位点。
具体实施例方式
图1为本发明的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法的原理图。图1中的(A)～(D)为聚合酶链反应过程的示意图，在此过程中，探针不结合到靶DNA上去。
图1中的(A)给出了靶DNA、正义引物、反义引物、敏感探针和锚定探针的混合在一起的示意图。其中的靶DNA即为待测脱氧核糖核酸，其中含有待测DNA片段，该待测DNA片段的一条单链上具有第一序列和第二序列，其中的第一序列是指其中的某一个核苷酸可能发生变异的一段核苷酸序列，第二序列是指与第一序列核苷酸相靠近的一段核苷酸序列。此时靶DNA处于正常的双螺旋状态。正义引物是指与待测脱氧核糖核酸的待测DNA片段的包含第一序列和第二序列的一条单链的5′端的一段序列互补的引物，反义引物是指与该DNA片段的该单链相对应的另一条单链的3′端的一段序列互补的引物。敏感探针采用结合有淬灭基团的寡核苷酸，该寡核苷酸互补于与待测DNA片段的第一序列相对应的野生型基因的相应DNA片段的相应序列、或互补于与待测DNA片段的第一序列相对应的突变型基因的相应DNA片段的相应序列，且所述淬灭基团为6-羧基四甲基罗丹明(6-carboxy-N，N，N，N-tetrachlorofluorescein，TAMRA)；锚定探针采用结合有荧光报告基团的与待测DNA片段的第二序列互补的寡核苷酸，且所述荧光报告基团为6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，FAM)。
图1中的(B)说明升高温度后，靶DNA变性，使其双链DNA解开成为单链的模板。
图1中的(C)说明在退火过程中，反应体系中的一对引物，也即正义引物与反义引物分别与已经解链的靶DNA片段两条单链进行配对复性。
图1中的(D)说明在退火的基础上，在合适的温度下NDA聚合酶将单核苷酸从3′端渗入，并沿模板由5′端向3′端方向延伸，合成新的DNA片段。在此基础上进行循环。
图1中的(E)表示聚合酶链反应结束时，敏感探针及锚定探针与待测DNA片段在较低温度条件下(如42℃或30℃)杂交。由于锚定探针的荧光报告基团FAM与敏感探针的淬灭基团TAMRA相互靠近，荧光报告基团FAM受激所发出的荧光被淬灭基团TAMRA淬灭。图中箭头所指位置为SNP位点。
图1中的(F)表示当温度缓慢升高时，敏感探针先融解脱离靶DNA，而使敏感探针所带的淬灭基团不再与锚定探针所带的荧光报告基团相靠近，而使荧光强度突然急剧增加。若待测脱氧核糖核酸的待测DNA片段具有单核苷酸变异，则其融解温度值与野生型基因的相应的DNA片段的相应的融解温度值有明显的差异。
图2是本发明的敏感探针和锚定探针的设计方案图。其中的敏感探针的寡核苷酸的序列互补于与待测DNA片段的第一序列相对应的野生型基因的相应DNA片段的相应序列、或互补于与待测DNA片段的第一序列相对应的突变型基因的相应DNA片段的相应序列；前一种情况是指敏感探针的寡核苷酸的序列与不发生变异的待测DNA片段的第一序列互补；后一种情况是指敏感探针的寡核苷酸的序列与发生变异的待测DNA片段的第一序列互补。另外敏感探针的寡核苷酸的序列的长短可随第一序列的长短而确定，或者说，第一序列可以由是否有与其相对应的寡核苷酸存在而确定，也即该寡核苷酸是除其可能变异点对应核苷酸外，其余部分均与第一序列互补的寡核苷酸，且只要所选择的寡核苷酸序列符合探针的基本条件即可；而该寡核苷酸的可能变异点对应核苷酸是指该寡核苷酸的与第一序列的可能的变异点处的核苷酸相对应的位置处的核苷酸；而该可能变异点对应核苷酸可以与第一序列的该可能变异处的非变异的核苷酸互补，或者与变异后的核苷酸互补。
仍见图2，在敏感探针的设计中，当确定了敏感探针的寡核苷酸的序列后，可在荧光报告基团与淬灭基团(可将该两个基团通称为荧光基团)中选择一个基团将其设置在该寡核苷酸的3′端或5′端，这样敏感探针就有4种形式。其中的第一种形式是该寡核苷酸的3′端设有荧光报告基团，第二种形式是该寡核苷酸的5′端设有荧光报告基团，第三种形式是该寡核苷酸的3′端设有淬灭基团，第四种形式是该寡核苷酸的5′端设有淬灭基团。
仍见图2，在锚定探针的设计中，其寡核苷酸的序列与待测DNA片段的第二序列互补，且要符合探针的基本条件，而待测DNA片段的第二序列可以是位于第一序列的右侧的一段核苷酸序列(可称为右侧第二序列)，也可以是位于第一序列的左侧的另一段核苷酸序列(可称为左侧第二序列)。因此，可以将其序列与右侧第二序列互补的寡核苷酸称为锚定探针的右侧寡核苷酸，而将其序列与左侧第二序列互补的寡核苷酸称为锚定探针的左侧寡核苷酸。
锚定探针在使用时与敏感探针在两个方面相配合。第一个方面的配合是两者之间的位置配合，也就是锚定探针的寡核苷酸为右侧寡核苷酸时，在使用中与待测DNA片段杂交时，位于敏感探针右侧，锚定探针的寡核苷酸为左侧寡核苷酸时，在使用中与待测DNA片段杂交时，位于敏感探针左侧。第二个方面是荧光基团的配合，也就是当敏感探针上的荧光基团为荧光报告基团时，锚定探针上的荧光基团则为淬灭基团，当敏感探针上的荧光基团为淬灭基团时，锚定探针上的荧光基团则为荧光报告基团。所以，对于锚定探针来说，对应于敏感探针4种形式的每一种，均有4种配合形式；第一种配合形式是寡核苷酸为右侧寡核苷酸，荧光基团位于该寡核苷酸的3′端；第二种配合形式是寡核苷酸为右侧寡核苷酸，荧光基团位于该寡核苷酸的5′端；第三种配合形式是寡核苷酸为左侧寡核苷酸，荧光基团位于该寡核苷酸的3′端；第四种配合形式是寡核苷酸为左侧寡核苷酸，荧光基团位于该寡核苷酸的5′端。
由以上说明可知，本发明的进行探针设计时，可供选择的设计方案有16种。
以下结合实施例对本发明进行详细描述，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1本实施例的方法具有以下步骤①确定待测DNA片段。该待测DNA片段为人类基因组中的肿瘤坏死因子受体II(Tumornecrosis factor receptor II，TNFRII)基因。TNFRII是1型跨膜蛋白，其基因定位在1p36.2，全长43kbp，含有10个外显子和9个内含子，TNFRII基因第6外显子196位双等位基因SNP标志产生3种基因型，分别为T/T纯合子、G/G纯合子和T/G杂合子，其中T/T纯合子属于野生型基因。TNFR2基因存在第6外显子196位ATG→AGG两种不同的等位基因，可以导致蛋氨酸(M)→精氨酸(R)的改变。这种多态性与自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮以及家族性类风湿性关节炎有关。TNFRII基因扩增产物片段的长度为529bp，其中的第一序列从该片段的第91位碱基开始，至第107位碱基结束，其中的第101位碱基则是可能发生变异的点位，第一序列核苷酸的排列顺序是5’-GACTGCATCCCTGCTTG-3’(其中的可能变异位点用突变型表示)。第二序列从该片段的第59位碱基开始，至第74位碱基结束，第二序列的排列顺序是5’-GCCATACTCCGGGTGG-3’。
②确定敏感探针以及锚定探针。敏感探针的寡核苷酸由17位碱基组成，与步骤①中的采用的第一序列互补，也即与突变型的相应的DNA片段的相应序列互补，其3′端结合有淬灭基团，敏感探针的序列是5’-CAAGCAGGGATGCAGTC-TAMRA-3’，其中的第7位与第一序列可能发生突变的位点相对应。锚定探针的寡核苷酸有16位，其5′端结合有荧光报告基团，锚定探针的序列是5’-FAM-CCACCCGGAGTATGGC-3’。这两种探针在上海生工合成和修饰，且敏感探针的融解温度的值低于锚定探针的融解温度的值。
③确定合适的两个寡核苷酸引物。正义引物的寡核苷酸有24位，其序列为5’-CGGGGACGTTCTCCAACACGACTT-3’；反义引物的寡核苷酸有20位，其序列为5’-TGGCTGCGTGTGTTGGGATC-3’。这两种引物在上海生工合成和修饰，且它们的融解温度的值大于步骤②中的锚定探针的融解温度的值。
④进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)。将40～80ng的DNA模板、2.5μl的10×PCR缓冲液、1.5mM的MgCl2、过量的底物0.5μl的4×dNTPs、购自上海申能博彩公司的1.25U的Taq DNA聚合酶、步骤③得到的正义引物10pmol和反义引物10pmol组成反应体系而进行聚合酶链式反应，还加入步骤②得到的敏感探针2pmol以及锚定探针2pmol而构成整个体系。其中，PCR总反应体系为25μl，DNA模板在体系中的浓度为1.6～3.2ng/μl，每一种探针在体系中的浓度为8×104pM。DNA模板也即含有待测DNA片段的脱氧核糖核酸，也称靶DNA，该DNA模板为用上海生工制造的UIIQ-10柱式血液基因组DNA抽提试剂盒从人类冠脉疾病患者的血液中提取。患者的人数有200名，因此，本实施例的DNA模板有200个，对每个DNA模板分别进行了聚合酶链式反应以及分别进行后续的检测步骤。
聚合酶链式反应在罗氏公司LightCycler基因扩增检测仪(版本号3.5)上进行。过程如下在95℃下预变性1分钟，接着开始循环，也即95℃的温度下保持0秒，以温度转换率为每秒20℃的速度降温至61℃、保持10秒，再以温度转换率为每秒20℃的速度升温至72℃、保持10秒，再以温度转换率为每秒20℃的速度升温至95℃，如此便完成了一个循环；一共运行40个循环。最后一个循环在升温至72℃、保持10秒而结束。
⑤探针杂交于待测DNA片段的同一条单链上。仍在罗氏公司LightCycler基因扩增检测仪上进行，加热体系至95℃、保持30秒，使扩增后的待测DNA片段的双链解开，然后降温至42℃、保持4分钟，从而使敏感探针杂交于扩增后的待测DNA片段的含有第一序列和第二序列的单链的第一序列上，使锚定探针杂交于扩增后的待测DNA片段的含有第一序列和第二序列的单链的第二序列上。因为所加入的敏感探针与锚定探针的数量基本相同，而杂交于相应的待测DNA片段的单链上的探针又相互临近，若此时对探针上的荧光报告基团进行激发，则其所被激发出的荧光被位于同一单链上的另一个探针上的淬灭基团淬灭，因此对外不显示荧光。
⑥见图3，测定待测DNA片段的融解温度。仍在罗氏公司LightCycler基因扩增检测仪上进行，打开检测仪上的荧光通道1(F1)进行检测，对探针的荧光报告基团进行激发。加热杂交后的体系，以每秒0.1℃的速度使体系从42℃升温至80℃，在升温过程中，敏感探针首先从待测DNA片段的单链上脱落下来，从而其淬灭基团不能对结合于该单链上的锚定探针上的荧光报告基团受激发出的荧光进行淬灭，因而体系中的荧光强度增加，随着温度的继续升高，敏感探针脱落增加，荧光强度也随着增强，将其中的荧光强度增量变化最大时的温度作为融解温度(Melting temperature，TM)。该融解温度TM与以下三种情况之一相对应第一种情况是由于G/G纯合子与敏感探针完全匹配，产生一个较高的融解温度，大约在58.5℃左右；第二种情况是T/T纯合子与敏感探针有一个碱基不配，TM值则漂移到52.5℃；第三种情况是杂合子T/G基因型则出现两个融解谷，TM值分别为52.5℃和58.5℃。两个融解谷之间的温度差(ΔT)为6℃。所在测出DNA片段的融解温度后，就可以对该DNA片段是否具有单核苷酸多态性进行判断了。如果属于第一种情况和第三种情况说明有突变，如果属于第二种情况则说明未发生突变。
不同实验之间的TM值可能在±0.8℃之间波动，不同融解谷之间的ΔT可能在±0.6℃之间波动。本法之所以用融解谷，而不是用融解峰来表示，是因为LightCycler 3.5版本中没有dF/dT的作图分析功能。我们希望这项功能在新的版本中添加，以便使用者根据各自需求选择相应功能。
见图4，此项检测方法的准确性通过DNA测序验证。DNA测序工作由上海英骏公司完成，图4显示了测序结果。
实施例2其余与实施例1相同，不同之处在于步骤①中所确定的待测DNA片段为人类基因组中的载脂蛋白M(apolipoprotein M，apoM)基因。ApoM是新近发现的载脂蛋白，其基因定位在6p21.31。在apoM近启动子区有一T-778C(rs805296)SNP。在此SNP标志产生3种基因型，分别为T/T纯合子、C/C纯合子和T/C杂合子，其中的T/T纯合子属于野生型基因。这一SNP与胆固醇及空腹血糖相关，并且也增加汉族人群中2型糖尿病的易感性。apoM基因扩增产物片段的长度为410bp，其中的第一序列从该片段的第170位碱基开始，至第189位碱基结束，其中的第180位碱基则是可能发生变异的位点，第一序列核苷酸的排列顺序是5’-AATTTTTGTACTTTTTGTAG-3’(其中的可能变异位点用突变型表示)。第二序列从该片段的第149位碱基开始，至第162位碱基结束，第二序列的排列顺序是5’-GCGTGTGCCACCAC-3’。
步骤②中所确定敏感探针的序列是5’-CTACAAAAAGTACAAAAATT-FAM-3’，所确定的锚定探针的序列是5’-GTGGTGGCACACGC-TAMRA-3’。apoM T-778C寡核苷酸在上海英骏公司合成和修饰。apoM T-778C的探针参照编码链设计和合成，因此，T/T纯合子和C/C纯合子应分别用A/A纯合子和G/G纯合子来表示。
步骤③中所确定的正义引物的寡核苷酸有30位，其序列为5’-ACTGACACATTCACTCAACATTTATTACTA-3’；反义引物的寡核苷酸有21位，其序列为5’-AGGGGTTGGTGGTGTTTTGTT-3’。
步骤④进行聚合酶链式反应中，所加入的敏感探针、锚定探针、正义引物和反义引物为本实施例的相应的敏感探针、锚定探针、正义引物和反义引物。
步骤⑤中的杂交温度为30℃。
步骤⑥中的融解温度TM与以下三种情况之一相对应第一种情况是由于C/C纯合子与敏感探针完全匹配，产生一个较高的融解温度，大约在50℃左右；第二种情况是T/T纯合子与敏感探针有一个碱基不配，TM值则漂移到43℃；第三种情况是杂合子T/C基因型则出现两个融解谷，TM值分别为50℃和43℃。两个融解谷之间的温度差(ΔT)为7℃。所在测出DNA片段的融解温度后，就可以对该DNA片段是否具有单核苷酸多态性进行判断了。如果属于第一种情况和第三种情况说明有突变，如果属于第二种情况则说明未发生突变。(图5)。
此项检测方法的准确性通过DNA测序验证。DNA测序工作由上海英骏公司完成，图6显示了测序结果。
权利要求
1.一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，具有以下步骤①确定要对某种生物的脱氧核糖核酸的某种基因进行检测，也就是确定待测DNA片段，而该待测DNA片段的一条单链上具有第一序列和第二序列，所述的第一序列是指该序列中的某一个特定核苷酸可能发生变异的一段核苷酸序列，第二序列是指与第一序列核苷酸相靠近的一段核苷酸序列；②制备可称为敏感探针的一种寡核苷酸探针、以及制备可称为锚定探针的另一种寡核苷酸探针；所述敏感探针互补于与待测DNA片段的第一序列相对应的野生型基因的相应DNA片段的相应序列、或互补于与待测DNA片段的第一序列相对应的突变型基因的相应DNA片段的相应序列，敏感探针的一端仅一端结合有荧光报告基团或淬灭基团；所述锚定探针与待测DNA片段的第二序列互补，锚定探针的一端仅一端在敏感探针结合有荧光报告基团时结合有淬灭基团、在敏感探针结合有淬灭基团时结合有荧光报告基团；敏感探针的融解温度的值低于锚定探针的融解温度的值；③制备合适的两个寡核苷酸引物，该两个寡核苷酸引物中的一个寡核苷酸引物与上述待测DNA片段的具有第一序列和第二序列的单链的一端互补，该两个寡核苷酸引物中的另一个寡核苷酸引物与上述待测DNA片段的另一条单链的另一端互补；④由过量的底物、DNA聚合酶、过量的寡核苷酸引物、以及含有待测DNA片段的脱氧核糖核酸组成反应体系，还加入敏感探针和锚定探针，且敏感探针和锚定探针的数量基本相同；在上述反应体系中进行聚合酶链式反应，而使上述待测DNA片段扩增；⑤对上述进行聚合酶链式反应后的体系加热，直至使扩增后的待测DNA片段变性而使其双链解开，然后降温而使敏感探针和锚定探针杂交于扩增后的待测DNA片段的含有第一序列和第二序列的单链上，因为荧光报告基团与淬灭基团相互临近且数量相当，所以若对探针上的荧光报告基团进行激发，则其所被激发出的荧光被结合于同一条链上的另一个探针的荧光淬灭基团淬灭，对外不显示荧光；⑥加热杂交后的体系，结合于待测DNA片段的单链上的第一序列上的敏感探针会先脱落下来，若此时对探针上的荧光报告基团进行激发，则因为敏感探针的脱落而对外显示出荧光，随着温度的继续升高，敏感探针脱落增加，荧光强度也随着增强，将其中的荧光强度增量变化最大时的温度作为融解温度；若该融解温度值与同样条件下野生型基因的相应的DNA片段的相应的融解温度值之间有明显的差别，则说明所测脱氧核糖核酸具有单核苷酸多态性。
2.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于步骤④的体系中的待测脱氧核糖核酸为1.6～3.2ng/μl。
3.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于步骤④中所加入的每一种探针在体系中的浓度为4×103～8×104pM。
4.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于步骤②中的锚定探针的融解温度的值低于步骤③中寡核苷酸引物的融解温度的值。
5.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于步骤④中进行聚合酶链式反应的方法是，在90℃～95℃下预变性1分钟，接着开始循环，也即90℃～95℃的温度下保持0秒，以温度转换率为每秒20℃的速度降温至55℃～61℃、保持10秒，再以温度转换率为每秒20℃的速度升温至70℃～75℃、保持10秒，再以温度转换率为每秒20℃的速度升温至90℃～95℃，如此便完成了一个循环；一共运行25～40个循环。
6.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于步骤⑤中加热体系使待测DNA片段的双链解开的温度为90℃～95℃，降温而使敏感探针和锚定探针杂交于扩增后的待测DNA片段的含有第一序列和第二序列的单链上的温度为30℃～40℃。
7.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于步骤⑥中升温速度为每秒0.1℃，最高温度为80℃。
8.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于步骤②中结合于探针的荧光报告基团是6-羧基荧光素，结合于探针的淬灭基团是6-羧基四甲基罗丹明。
9.根据权利要求1至8之一所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于步骤④中待测脱氧核糖核酸的待测DNA片段是肿瘤坏死因子受体II、或载脂蛋白M。
10.根据权利要求1至8之一所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于步骤⑥中，当待测DNA片段的单链上的敏感探针脱落下来的融解温度与野生型基因的相应的DNA片段的相应的融解温度值之差的绝对值为5℃～10℃时，则判断所测脱氧核糖核酸具有单核苷酸多态性。
全文摘要
本发明涉及一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸性质的方法。该方法确定待测DNA片段的一条单链上的第一序列和第二序列、且第一序列可能具有变异位点，制备分别对应于第一序列和第二序列的敏感探针和锚定探针、且敏感探针的一端仅一端结合有荧光报告基团和淬灭基团中的一种、锚定探针的一端仅一端结合有荧光报告基团和淬灭基团中的另一种，制备与待测DNA片段相对应的一对引物，然后进行聚合酶链式反应，再将探针杂交于扩增后的待测DNA片段的含有第一序列和第二序列的单链上，再测定融解温度，即可对待测DNA片段所属的脱氧核糖核酸的单核苷酸是否具有单核苷酸多态性进行判断。本发明具有成本较低、操作方便、检测时间较短的特点。
文档编号C12Q1/68GK1952178SQ20061009738
公开日2007年4月25日 申请日期2006年11月3日 优先权日2006年11月3日
发明者罗光华, 郑璐 申请人:罗光华, 郑璐