专利名称：棉花纤维特异启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体地说，涉及棉花纤维特异启动子，含有该启动子的植物表达载体，以及由该植物表达载体转化的转化体；本发明还涉及含有上述启动子序列的转基因植物的制备方法。
背景技术：
棉花纤维是重要的纺织工业原料，我国是棉纺织品消费和出口大国，因此，棉花生产在我国国民经济中占有重要的地位，同时也是农民重要的经济来源。能否迅速提高我国棉花品种的纤维品质，直接关系到我国棉花产业的兴衰和纺织品生产加工、纺织设备制造、外贸出口等行业的生存与发展。虽然利用传统的育种方法曾在棉花品种改良上取得了很大的成功，但近20年来，世界棉花品种在产量上已经达到一个平台期，利用现有的遗传资源和育种手段难以再大幅度提高棉花产量(Meredith W.R.Better Crops 2000 84(4)6～9)。单纯依靠常规育种改良棉花纤维品质相当困难。这是因为1)棉花纤维强力、细度等品质性状基因与皮棉产量存在负连锁，常规育种方法很难打破这种遗传上的负相关；2)我国的棉花栽培品种主要是陆地棉，而优良纤维品质基因主要源于二倍体的瑟伯氏棉(纤维强度)、异常棉(纤维强度与细度)以及四倍体的海岛棉(纤维强度与细度)等，这些优良性状基因的利用在常规育种中受到诸多限制。瑟伯氏棉与异常棉为二倍体野生种，与四倍体陆地棉杂交后，存在远缘杂交带来的农艺性状差、后代难于稳定、周期太长等问题；即便是同为四倍体的海×陆杂交，同样存在后代分离强烈，产量-品质负连锁关系仍难打破等问题(潘家驹1998棉花育种学99～104北京中国农业出版社)。
棉花纤维是由胚珠外珠被表层细胞经分化突起、伸长和细胞壁增厚而形成的，整个发育过程可分为纤维原始细胞分化、纤维伸长(初生壁形成)、次生壁形成和纤维脱水成熟四个时期。棉花纤维的发育以单细胞形式出现，在其发育过程中，纤维细胞具有均一性和同步性，而且在表皮细胞突起后，纤维细胞迅速伸长，可以将细胞的分化与细胞的伸长过程完全分开。随着纤维细胞生长发育的进行，细胞形态变化越来越大，最后其长/径比可达1,000-3,000。成熟纤维主要由纤维素组成(约占87％)，此外还含有少量的果胶、半纤维素和蛋白质等物质。棉纤维的化学组成及其分子间的排列方式决定棉纤维的理化性质(品质)。在棉纤维中引进新的生物大分子是改良棉纤维品质的重要策略之一。
利用基因工程方法可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目的基因的定向转移，同时具有后代易于稳定，育种周期短等优点。因此，分离与棉花纤维发育相关的基因及其特异启动子，进而利用基因工程的手段对棉花纤维品质实行定向改良，近年来一直是国内外棉花研究的热点。利用纤维特异启动子，人们尝试通过生物工程技术改良棉花纤维的品质，如将聚羟基丁酸合成酶系在棉花纤维中特异表达改善了棉花纤维的保暖性能。
1996年美国Agracetus公司首次报道基因工程改良棉纤维的探索性试验。经遗传转化的棉纤维中含有一种天然的脂肪族聚酯化合物——多聚-D--(-)--3羟基丁菔(PHB)。PHB聚酯是一种天然的可降解的热性塑料(thermoplastic)，其理化性质与聚丙烯相似。PHB常以包涵体的形式存在于某些细菌的体内作为碳源。PHB的生物合成涉及3种酶β-酮硫解酶，乙酰CoA还原酶和PHB合成酶。棉纤维本身含有内源性的β-酮硫解酶。John等(JohnM E，Keller G.Metabolic Proc Natl Acad Sci，USA 1996,9312768-12773.)将乙酰CoA还原酶基因(phaB)和PHB合成酶基因(phaC)分别与纤维特异性启动子E6和FbL2A连接，构建植物表达载体，运用基因枪技术，将phaB和phaC基因共转化到陆地棉栽培种DP50中，成功获得同时表达phaB和phaC基因的转基因棉花。GUS基因表达、Northern杂交等分子检测结果均证明phaB和phaC在转基因棉株纤维中表达。荧光显微镜和透射电子显微镜观察一致显示转基因棉纤维细胞中含有PHB颗粒。对转基因棉纤维提取物的GC-MC分析表明，纤维中有与细菌PHB质谱相同的物质，证明转基因棉纤维中合成了PHB大分子物质。HPLC分析结果表明每克纤维干重含约30-3440μg的PHB，PHB的合成始于开花后10d，纤维成熟后PHB含量没有降低。利用植物体内自身的乙酰CoA合成大分子PHB，并没有对棉花纤维品质如长度、强度和马克隆值带来任何影响，然而PHB的存在的确提高了纤维的热绝缘性能。但是因纤维中PHB含量仍较低，绝缘性提高的幅度尚有限。
在基因工程改良棉纤维方面颇为人们关注的另一个焦点是美国Auburn大学Daniell的研究工作。Daniell(Henry Daniell，Beltwide Cotton Conferences，1998，595～598)试图将编码含Val-Pro-Gly-Val-Gly重复单元的蛋白聚体(protein-based polymers，PBPs)基因遗传转化棉花，使棉花细胞能特异表达出PBPs蛋白。PBPs蛋白广泛存在于自然界中，如哺乳动物结缔组织中的弹性蛋白，分子内含有由多个氨基酸组成的重复顺序，PBPs分子常表现出较强的弹性(弹性系数10.6～10.9Pa)。Daniell(Henry Daniell，Beltwide CottonConferences，1998，595～598)认为将PHBs引进棉纤维，一方面有望提高纤维的弹性和强度，另一方面纤维中蛋白质含量的提高，纤维吸水能力增强，与染料的亲和力亦相应增强，这是目前常规育种方法所做不到的。我国中科院植生所科学家利用花粉管转化途径，将兔角蛋白基因置于棉花纤维特异启动子E6控制下，获得了转兔毛角蛋白基因的棉花，从而使棉纤维的伸长率明显增加，纤维比强度有所提高(张震林，棉花学报2004，16(2)72～76)。
启动子是RNA聚合酶能够特异识别的一段DNA分子，也就是使转录开始的部位。在基因表达的调控中，转录是基因表达的第一步，也是表达调控的关键一步(Lewi，2005基因VIII 669～705，北京科学出版社)。随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体，启动子对外源基因在生物中的表达部位与表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。在棉花纤维品质的基因工程改良中，往往需要外源基因特异地在纤维细胞中表达，从而降低外源基因对棉花正常生长的影响。在有关棉花纤维发育的基因调控机理研究中，通常采用转基因的手段，将目的基因超量表达或表达沉默，从而推测其功能。因此，在通过转基因手段验证其功能时，会干扰转基因棉的正常生长，产生无法预料的结果，影响实验结果的准确性和实验进度。如果采用棉花纤维特异启动子，则可以使目的基因的表达控制在纤维发育过程中。因此，棉花纤维或种皮特异启动子的克隆及其表达分析，对棉花纤维发育的基因功能研究和纤维品质的基因工程改良，都具有十分重要的价值。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种棉花纤维特异启动子序列，其至少含有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，更优选的是具有如SEQ ID NO.2所示的序列，该序列为根据棉花GhSCFP基因的cDNA序列设计引物，采用YADE(肖月华，遗传学报2002，29(1)22～26)方法，得到的长度为1037bp的GhSCFP基因的5’上游序列。该序列中包含种子特异的RY-element(CATGCATC)、AT富集区(TAAAATAATTATT)、多个CAAT-box、A-box、G-box、AAGAA-motif等大量顺式调控元件及与TFII结合的核心序列TATAA。TATA-box下游25bp处为GhSCFP基因的转录起始位点。通过在转基因烟草和转基因棉花中GUS组织化学染色、GUS酶活测定以及GFP荧光检测，证实该启动子驱动GUS基因和GFP基因在转基因烟草种子中，进一步地在种皮中特异性优势表达，在转基因棉花中驱动GUS基因在陆地棉纤维中特异地表达。另外，为了鉴定GhSCFP基因启动子的核心区，分析了GhSCFP基因5’序列的系列缺失片段分别与GUS基因融合的转基因烟草的GUS酶活性。结果显示当删除启动子的-634至-543区域(即SEQ ID NO.3序列)，开花后5天的转基因烟草种子中GUS酶活性降低约30倍，表明该区域含有一个增强子序列，当删除启动子的-634至-543区域，茎和叶中的GUS酶活性高于种子和花冠，表明该区域含有控制启动子在种子中特异表达的元件。
本发明的又一个目的在于提供含有GhSCFP基因启动子的植物表达载体。采用基因工程方法，将GhSCFP基因启动子插入到适宜的表达载体中即可获得本发明的含有GhSCFP基因启动子的植物表达载体。
在本发明的一个具体实施方案中，构建了含有GUS基因的GhSCFP::GUS植物表达载体，其具有如图4所示的结构。
在本发明的另一个具体实施方案中，构建含有GFP基因的GhSCFP::GFP植物表达载体，其具有如图5所示的结构。
本发明的又一个目的在于提供含有GhSCFP基因启动子序列的转化体。将上述植物表达载体转化适宜的宿主即可获得本发明的转化体，在本发明的一个具体实施方案中，采用电击法将含有GhSCFP基因启动子的植物表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404中获得转化体。
本发明的又一个目的在于提供制备含有GhSCFP基因启动子的转基因植物的方法。将本发明的GhSCFP基因启动子与报告基因构建植物表达载体，将所述植物表达载体转化宿主获得含GhSCFP基因启动子的转化体，以及用所述转化体转化植物获得转基因植物。所述转基因植物优选为烟草或陆地棉。
本发明分离获得了棉花纤维特异基因的启动子，并证实了该启动子序列在烟草中具有外种皮优势表达活性，在陆地棉中具有纤维表达特异性，为基因工程改良烟草、棉花品种提供了可能性和有效的途径。
附图简要说明
图1表示GhSCFP基因启动子的核苷酸序列，其中阴影覆盖部分，为-634～-543的核心区域，在序列表中该序列的编号是从1至1037；而-634～-543的编号是将转录起始点作为+1，转录起始点以上的序列从-1开始；转录起始点以下的序列从+1开始；没有0位点，序列的整个顺序是从5’至3’；图2表示扩增DNA所用的引物，其中，P-up1.0和P-down用于扩增1037bp的GhSCFP启动子，P-up947和P-down、P-up739和P-down、P-up530和P-down、P-up465和P-down、P-up258和P-down分别用于扩增946bp、739bp、530bp、465bp、258bp的GhSCFP启动子片段。Pgfp-up和Pgfp-down用于扩增GFP基因。pgus-up和pgus-down用于扩增GUS基因；图3表示GhSCFP启动子克隆到pGEM-T载体上的质粒图谱；图4表示pGhSCFP1.0-GUS植物表达载体图谱；图5表示pGhSCFP1.0-GFP植物表达载体图谱；图6表示GhSCFP启动子5′端删除后的系列分析表达载体模式图；图7表示以32p标记的GhSCFP和18sRNA基因为探针，与陆地棉根、茎、叶、花、胚珠、纤维(R、S、L、FL、O、F)中的总RNA杂交得到的Northern结果；图8表示以32p标记的GhSCFP和18sRNA基因为探针，与陆地棉开花后(dpa)不同时间纤维中的总RNA杂交得到的Northern结果；图9表示以GhSCFP蛋白抗体为探针，与陆地棉开花后不同时期胚珠、纤维(O、F)的总蛋白进行杂交，得到的Western杂交结果，M为标准分子量蛋白；图10表示GhSCFP启动子5′端删除系列，经PCR扩增后的电泳图，其中1、2、3、4、5分别为946bp、739bp、530bp、465bp、258bp的GhSCFP启动子DNA，6为标准分子量DNA；图11表示GhSCFP1.0::GUS融合基因表达载体构建流程图；图12表示GhSCFP1.0::GFP融合基因表达载体构建流程图；图13表示pGhSCFP1.0::GUS载体的限制性酶切验证琼脂糖电泳图谱，其中1为标准分子量DNA，2为pGhSCFP1.0-GUS重组质粒经限制性内切酶XbaI和SmaI消化后产物的电泳，表明1037bp的GhSCFP启动子已经与GUS基因融合；图14表示pGhSCFP1.0::GFP载体的限制性酶切验证琼脂糖电泳图谱，其中1、2、3为不同的p5-GhSCFP1.0-gfp-m重组质粒经限制性内切酶XbaI和BamHI消化后产物的电泳，表明1037bp的GhSCFP启动子已经与GFP基因融合，4为标准分子量DNA；图15表示转GhSCFP1.0::GUS基因烟草的PCR验证结果，其中1为标准分子量DNA，2-7为不同的转基因株系，8为阳性对照，9为阴性对照。表明3、4、5、6为转基因阳性株系，2、7为转基因阴性株系；图16表示转GhSCFP1.0::GUS基因棉花的PCR验证结果，其中1为标准分子量DNA，2-6为不同的转基因株系，7为阳性对照，8为阴性对照。表明2、3、4、5、6均为转基因阳性株系；图17表示转GhSCFP1.0::GUS基因烟草中的GUS染色结果，GUS在转基因烟草种子上优势表达。开花后5天的转GhSCFP1.0-GUS基因烟草种子GUS染色后，再按常规方法进行石蜡切片，最后得到如图的观察结果，表明GhSCFP1.0启动GUS在烟草种子外表皮上表达；图18表示野生型和转GhSCFP1.0::GFP基因烟草开花后5天的种子，在荧光显微镜下的观察结果野生型的种子被激发出红光而转基因的gfp则被激发出绿色荧光；图19表示在转基因烟草的种子、花冠、叶片、茎、萼片和子房壁中，GUS酶活性的变化；其中在种子中酶活最高，其余组织中均很低；图20表示转GhSCFP1.0::GUS基因陆地棉的GUS染色结果；其中A开花当天的胚珠；B当天胚珠表面的放大；C开花后3天的胚珠；D3天胚珠表面的放大；
图21表示转GhSCFP1.0::GUS基因陆地棉，胚珠GUS染色后的纵切观察结果；其中，A中未着色的胚珠为对照，B为转基因胚珠的纵切，C为B的放大图；图22表示转GhSCFP1.0::GUS基因陆地棉，开花当天胚珠GUS染色后的石蜡切片结果；其中，B和D分别为A和B的放大图，表明仅有胚珠表面突起的纤维被着色；图23表示GhSCFP启动子5′端缺失后，转基因烟草种子中GUS酶活性分析结果；当删除该启动子的-634至-543区域后，转基因烟草种子中的GUS酶活性降低约30倍，表明该区域含有增强子序列。其余4个区域删除后，种子中GUS酶活性变化不大；图24表示GhSCFP基因启动子缺失-634到-543区域后，转基因烟草不同组织中GUS酶活性测定结果，U-7和U-14为不同的转基因株系，表明当删除GhSCFP基因启动子的-634至-543区域后，茎和叶片中的GUS酶活高于种子、花冠，表明在该区域中还有控制基因在种子中表达的元件。
具体实施例方式
实施例1棉花纤维RNA的提取在开花当天对棉花花朵进行挂牌标记，分别取开花当天到开花后9天的棉铃。棉花胚珠和纤维RNA的提取参考Chang Shujun等的方法(Shujun Chang，Plant Molecular Biology Reporter 1993 11113～116)，但更改了部分步骤，具体操作程序如下取样后将棉铃立刻置于冰盒中，室内分别剥取开花后当天的胚珠、纤维以及开花后6天、8天的纤维，于液氮下快速研磨成粉末并装入50ml离心管中。加入10ml 65℃预热的提取缓冲液(CTAB 2％，PVP 2％，Tris-HCl100mmol/L pH8.0，EDTA 25mmol/L，NaCl 2mol/L，Spermidine 0.5mg/ml)，混匀于65℃水浴3min，再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀后离心20℃、10000rpm、5min。氯仿∶异戊醇(24∶1)重复抽提一次，取水相加入1/4体积的10mol/L的氯化锂，4℃沉淀过夜。于4℃10000rpm离心20min弃上清液，500μlSSTE溶解，加入等体积的酚(pH4.5)、氯仿∶异戊醇抽提，最后于水相中加入2倍体积乙醇，-80℃存放。
实施例2棉花纤维cDNA文库的构建及基因克隆棉花纤维cDNA文库的构建方法主要参照STRATAGENE公司产品说明书进行，简述为取100μg棉花开花后当天胚珠和纤维以及开花后6天、8天纤维的总RNA，通过GIBCO BRL的Super-script II逆转录酶合成cDNA的第1链，然后用STRATAGENE cDNA文库构建试剂盒(λZAP)，建立了棉花纤维的cDNA文库。经测定，得到的初级库滴度为9.8×106；放大文库的滴度为1×1011。共随机选取了20个克隆并亚克隆到质粒pBSsk上，检测表明所克隆的外源片段长度在0.7-2.5kb之间，可以满足基因克隆的需要。
实施例3棉花基因组DNA的分离取约1克棉花叶片材料，放入研钵中，液氮下快速研磨成粉末，装入离心管并加入3ml 65℃预热的CTAB提取液，快速振荡混匀，65℃水浴30min。然后在该离心管中，加入1ml 5mol/L KAc混匀冰浴30min，加入等体积(4ml)的氯仿∶异戊醇(24∶1，v/v)颠倒混匀，8000rpm，离心10min，取上层水相加入2/3倍体积的预冷异丙醇，混匀，-20℃放置2h。用封口毛细管挑取絮状DNA沉淀于新1.5ml离心管中，70％乙醇洗涤2次后风干沉淀，加入适量TE充分溶解，酚∶氯仿∶异戊醇(24∶23∶1，v/v/v)抽提后，加入2倍体积乙醇-20℃保存备用。
实施例4棉花纤维特异基因GhSCFP的克隆及序列特征分析从所构建的棉花纤维cDNA文库中，采用随机克隆法获得了80个基因。其中一个基因的核苷酸序列与拟南芥等植物的Subtilisin-like Protease基因有较高的同源性，命名为棉花种皮纤维特异基因(Seed Coat Fiber specificProteinase，GhSCFP)，该基因长2436bp含有一个2337bp的开放阅读框，5’端非编码区31bp，3’端非编码区68bp。推测编码的蛋白质由778个氨基酸残基组成，分子量83474道尔顿，pI等于8.244，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。同源性分析表明在蛋白质水平，与马铃薯、拟南芥、水稻的Subtilisin-likeProtease基因的同源性分别为72％、70％和68％。
Subtilisin属于丝氨酸蛋白酶的一种，它有一个底物结合位点，一个由D、H和S三个区构成的接触反应域。Subtilisin在原核和真核生物中均有发现，但植物中的研究相对较少。目前已经从植物中克隆了一些Subtilisin-like基因并进行了初步研究。Berger和Altmann(Berger D，Altmann T Genes Dev 2000，141119-1131)在研究拟南芥表皮气孔簇生的sdd1-1单隐性突变体时，通过作图克隆出SDD1基因，结果显示，它与subtilisin基因有很高的同源性。sdd1由于缺少S区可能丧失了枯草杆菌蛋白酶的催化活性，失去了对表皮细胞分化成气孔的控制，从而导致气孔的簇生现象。但通过对突变株转化SDD1基因，气孔簇生现象由于SDD1基因的互补作用可以得到恢复，表明subtilisin基因在植物中可能具有控制表皮细胞分化的功能。Tanaka(Tanaka H，Onouchi H，Kondo M，Hara-Nishimura I，Nishimura M，Machida C，Machida Y.Development.2001 128(23)4681-9)等的研究结果也证实，在拟南芥ale1(abnormal leafshapel)突变体发育过程中，胚胎外表面与残存的胚乳表皮不分离，通过转座示踪克隆的ALE1基因也与subtilisin有很高的同源性。进一步研究得知ALE1基因只在幼嫩的胚胎和紧贴胚胎的胚乳表皮细胞中表达，一旦胚胎萌发，其表达即停止，表明ALE1基因可能影响胚胎或幼嫩植物表皮的形成。Paik-Ro(Paik-Ro O.G.Seib J.C.Smith R.L.Theor Appl Genet 2002 104236-240)等应用差减杂交的方法从花生的cDNA文库中克隆了四个种子发育特异基因，其中Pscll基因在种皮中特异表达，而且也编码subtilisin-like蛋白。这些研究结果表明，subtilisin基因可能参与了植物胚胎幼嫩组织表皮细胞形成及种皮发育等过程。
实施例5棉花纤维特异基因GhSCFP的表达分析我们首先对GhSCFP基因的表达进行了Northern杂交分析。以其保守区域为探针，进行该基因组织特异性表达分析，发现该基因在根、茎、叶、花中不表达，仅在胚珠和纤维中表达，可见棉花GhSCFP基因的表达具有纤维发育特异性，可能与棉花纤维的发育有关。进一步用相同的探针，分别与不同发育时期纤维的RNA杂交，结果表明在棉花纤维发育的早期GhSCFP基因开始表达，至开花后8-10天表达量达到最高，随后该基因的表达开始下降，到开花后14天该基因关闭，即该基因的表达与棉花纤维的形成和初生壁的形成有关。这些结果暗示棉花GhSCFP基因可能参与了胚珠表皮细胞的分化、纤维细胞的发育等过程。
其次，通过Western杂交分析该基因在蛋白质水平的表达，结果表明从4DPA就能够检测到目标蛋白的出现，在8DPA达到最高表达量；随着纤维细胞的发育，GhSCFP蛋白持续存在(超过30DPA)且含量并未有明显的下降。
实施例6棉花纤维特异启动子的克隆及特征分析根据棉花GhSCFP基因的cDNA序列设计DNA引物，采用YADE的方法，在棉花基因组上向该基因的5’端进行了延伸，得到了长度为1037bp的GhSCFP基因的5’上游序列，如SEQ ID NO.2所示。利用分析软件(Plant CARE，http://intra.psb.ugent.be:8080/PlantCARE/)，从植物启动子数据库中对该序列进行启动子调控元件分析，从中发现大量的顺式调控元件及其与TFII结合的核心序列TATAA，在该TATA-box下游25bp处为GhSCFP基因的转录起始位点(initiator，Inr)。这些顺式调控元件包括种子特异的RY-element(CATGCATC)、AT富集区(TAAAATAATTATT)、多个CAAT-box、A-box、G-box、AAGAA-motif等。
实施例7棉花GhSCFP基因启动子分析表达载体的构建通过设计的引物(P-up1.0，P-down)利用PCR扩增出这段DNA片段并克隆到TA载体pGEM-T中为pGEM-GhSCFP1.0，最后通过DNA测序对该DNA序列进行鉴定。根据该启动子序列中各种调控元件的分布，按照5’端缺失的原则，设计以下引物(图2)分别扩增出946bp、739bp、530bp、464bp和257bp的启动子片段。将扩增的DNA片段克隆到TA载体pUCm-T中，通过序列测定予以确认。由于在启动子5’端和3’端的引物后分别引入了XbaI和SmaI限制性内切酶位点，通过XbaI和SmaI将确认的启动子缺失片段定向克隆到pGPTV-KAN载体中与uidA基因融合，构建GhSCFP::GUS植物表达载体(图4)。
PCR反应条件反应总体积为25μl，包括10×LA Taq buffer 2.5μl、每种dNTP 100μmol/L、1.5mmol/L MgCl2、模板DNA 10ng、上下游引物各400nmol/L、1单位LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)。扩增条件94℃变性4min，继以94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
GFP基因来源于pBIN m-gfp5-ER，但去除其中的碱性几丁酶信号肽。通过合成引物(Pgfp-up，Pgfp-down)扩增并克隆到pUCm-T中为pUCm-gfp5，利用限制性内切酶HindIII和EcoRI将该基因定向克隆到P5中为p5-gfp-m。其次，利用EcoRI和SmaI将GhSCFP1.0从pGEM-GhSCFP1.0中切出并克隆到pBS上为pBS-GhSCFP1.0；再通XbaI和BamHI将GhSCFP1.0从pBS-GhSCFP1.0中切出并定向克隆到p5-gfp-m载体中与GFP基因融合，构建成GhSCFP::GFP植物表达载体(图5)。
最后，通过电击法将这些启动子分析表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404中。
实施例8烟草的遗传转化1、烟草无菌幼苗的获得以及根癌农杆菌侵染液的制备将烟草种子用1％的次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗4-5次，然后置于固体MS培养基上萌发，于25℃、16h光照/8h黑暗光周期条件下培养。
在含50mg/L Km和125mg/L Sm的YEB固体培养基上，活化含表达载体的农杆菌保存菌株。挑取一个含目的基因的农杆菌单菌落，接种于5ml附加相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200rpm培养过夜。取250μl该菌液接种于25mlYEB培养基中，28℃、200rpm培养至OD600约0.6～0.8，然后将菌液于6000rpm离心5min收集菌体，用液体MS培养基稀释至原菌液体积。
2、根癌农杆菌介导的烟草遗传转化取无菌幼苗健壮叶片，切成约0.5cm2大小叶盘，加入OD600为0.6～0.8的农杆菌菌液，轻轻振荡侵染15min后，立刻倾去菌液，将外植体转入表面铺有一层滤纸的共培养基上，24℃暗处共培养3d。
3、转化植株的筛选与再生共培养后，将外植体转入筛选培养基中进行筛选分化培养，每4周继代一次。当愈伤出现绿芽时，将绿芽切下转入生根培养基中生根，直到幼苗长到高约5cm时，对转基因幼苗进行检测。对融合GFP的启动子分析转基因烟草，对根及叶片直接进行GUS组织化学染色，将GUS阳性幼苗移栽入土钵中；对融合GUS的转基因烟草，采用PCR的方法进行鉴定，将PCR阳性的烟草移栽并管理。
实施例9棉花的遗传转化
1、棉花胚性愈伤组织诱导以及根癌农杆菌侵染液的制备棉花种子剥壳，用0.1％升汞(HgCl2)消毒10min，无菌水漂洗6次，接种于种子萌发培养基上，28℃、黑暗条件下萌发5～7d，获得无菌的棉花幼苗。选取生长健壮的无菌幼苗下胚轴，切成约0.4cm的小段，接种于棉花愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，每3-4周继代一次。选取松散的愈伤组织接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，诱导胚性愈伤组织的产生。
在含50mg/L Km和125mg/L Sm的YEB固体培养基上，活化含表达载体的农杆菌保存菌株。挑农杆菌单菌落，接种于5mL含相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200r/min震荡培养过夜。培养后的农杆菌菌液按1∶20的比例转接到50mL含相同抗生素的YEB液体培养基中，继续培养3-5hr，6000rpm离心10min后，菌体用液体MSB(含100μmol/LAS)培养基重悬，调整OD600值为0.3-0.5备用。
2、浸染和共培养用无菌吸水纸吸去胚性愈伤组织表面的液体，放入调整好浓度的农杆菌菌液中，浸染20-30min。倾去菌液，将浸染过的胚性愈伤转移到共培养培养基(含100μmol/LAS)上，于24℃黑暗条件下共培养4d。
3、转化子的筛选共培养完成后把胚性愈伤组织转移到筛选培养基上进行脱菌和筛选培养，每3周继代一次。1-2个月后大部分愈伤组织褐化死亡，少部分表现出卡那霉素抗性，生长出新鲜的胚性愈伤组织。愈伤组织块继代，每块组织增殖到2.0-3.0g时，接入液体悬浮培养基中，在摇床上120r/min震荡悬浮培养以获得大量体胚。悬浮2周后用30目筛网过滤悬浮培养组织，网下沉淀物转接入体胚成熟培养基。萌发的成熟胚转入体胚伸长诱导培养基上，诱导体胚伸长、萌发。取长度大于0.5cm的萌发胚转接入SH培养基成苗。待幼苗长到约2cm高时，剪取幼苗嫁接到有3-4片真叶的棉花幼苗上。嫁接成活后移栽到温室生长。
实施例10转基因植株的PCR验证采取DNA小量提取方法，提取转基因植株DNA用于PCR验证。具体步骤包括分单株分别取少量T0代转基因烟草和棉花叶片，置1.5ml离心管中，加入少许液氮并用玻棒研磨成粉末。加入0.5ml 65℃预热的DNA提取缓冲液，混匀，65℃水浴30min。等体积氯仿∶异戊醇抽提两次，吸取上清液于新离心管中，加入2倍体积无水乙醇-20℃沉淀2h。室温下12000rpm离心10min，弃取上清液风干沉淀，最后200μlTE缓冲液溶解。
对提取的转基因植株DNA进行PCR体外扩增验证，反应总体积为25μl，包括10×LA Taq buffer 2.5μl、每种dNTP 100μmol/L、1.5mmol/L MgCl2、模板DNA 10ng、上下游引物各400nmol/L、1单位LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)。
扩增条件94℃变性4min，继以94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
扩增产物在含溴乙锭的1％琼脂糖凝胶上以5V/cm的电压电泳后，紫外灯下观察照像。
实施例11GUS的组织化学染色及观察取新鲜的转基因烟草、陆地棉材料，切成小块后置1.5ml离心管中，加入GUS染色液(10mmol/LEDTA，100mmol/L磷酸钠缓冲液pH7.0，0.1mol/LK3[Fe(CN)6]，0.1mol/L K4[Fe(CN)6]，0.1％(V/V)Triton X-100，5mg/ml X-Glue)。将含有植物材料和GUS染液的离心管，放入37.0℃恒温温箱中，染色3h。最后倾去染色液，通过70％乙醇脱色后，观察照相。如果对GUS染色后烟草种子和棉花胚珠进行石蜡切片观察，则倾去染色液后，用FAA固定液固定3至24h。洗去固定液，常规乙醇--叔丁醇法6级脱水，浸蜡、包埋。石蜡包埋好的植物组织，于切片机上切片，切片厚度控制在10-15μm。
实施例12转基因材料GFP的显微观察将切取的新鲜组织立即投入含4％多聚甲醛、2.5％戊二醛、20mmol/L磷酸缓冲液(pBS，pH7.0)的固定液中，经1h真空处理后，于4℃下继续固定过夜。固定的样品经磷酸缓冲液浸洗2～3次后，直接用Tissue-Tek O.C.T.包埋剂包裹在样品上，再用液氮迅速冷冻。随后尽快将样品移至-80℃超低温冰箱中保存备用。于切片前1h左右，将样品从-80℃超低温冰箱中取出，置冰冻切片机腔内，经回温后再用包埋剂粘在样品头上进行冰冻切片。切片厚度为10μm，切片机腔温度为-20℃。切片自然晾干后，在荧光显微镜下观察并照相。
实施例13转基因植物组织GUS酶活性测定GUS基因编码β-葡萄糖苷酶，该酶是一种水解酶，表现活性时不需要辅酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。催化作用的最适pH为5.2～8.0，能适应较宽的离子强度范围。以4-甲基伞形酮酰-β-D葡萄糖醛酸苷(4-MUG)为底物，GUS催化其水解为4-甲基伞形酮(4-MU)及β-D葡萄糖醛酸。4-MU分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量，由于4-MU羟基的pKa在8～9之间，欲使羟基大量离子化，溶液的pH应大于其pKa，一般使用碳酸钠终止反应并创造碱性条件。
1、GUS粗酶液的提取选择已开花的转基因烟草，于开花当天挂牌标记开花时间。取开花后5d的果实(其中每个单株3～5个果实)，室温下分别剥取种子、子房壁。另外，常规方法对叶片、萼片、幼茎和开花当天的花冠取样。将待测的植物材料置液氮中研磨成粉，加入2倍体积的GUS酶提取缓冲液(100mmol/L磷酸钠缓冲液pH8.0，1％PVP W/V，10mmol/Lβ-巯基乙醇)制成匀浆，冰上放置1h。于13000rpm/min离心10min，收集上清夜，立即测定GUS酶活，如需保存加入灭菌甘油(50％v/v)-20℃保存。
2、Bradford法(汪家政，2000蛋白质技术手册42～46，北京科学出版社)测定GUS粗酶液中总蛋白的含量。
3、4-MU标准曲线的制作进行启动子分析时，基于启动子表达的时空特异性，在转基因植物的不同组织中，会得到不同的GUS酶活。因此，为保证实验的准确性，制作了高、低两种4-MU浓度梯度的标准曲线。首先，用少量的N，N-二甲基甲酰胺溶解4-MU固体，然后用双蒸水稀释成1mmol/L的母液。其次，用反应终止液将4-MU母液稀释成100μmol/L、80μmol/L、60μmol/L、40μmol/L和20μmol/L的高浓度梯度样品，以及10μmol/L、8μmol/L、6μmol/L、4μmol/L和2μmol/L的低浓度梯度样品。于酶标仪上在激发光360nm，发射光460nm，狭缝25nm的条件下测定各样品的荧光强度，以反应终止液为空白对照，每种浓度样品各设置3个重复，通过计算平均值绘制标准曲线。
4、GUS酶与底物反应于37℃水浴中预热反应缓冲液(100mlGUS酶提取缓冲液中加入35.23mg的4-MUG)，同时在2个96微孔酶联板中，以180μl/孔加入反应终止液(200mmol/L碳酸钠)。在样品离心管中加入195μl预热的反应缓冲液和5μlGUS粗酶液，混匀，立即取出20μl加入到1号板中，此为反应0时的样品(荧光测定时以此为空白)，并严格记时。将反应板放入37℃水浴中进行酶反应，于20min时各取20μl反应液加入到2号板中，混匀，为酶反应20min时的样品。
5、GUS酶活的荧光测定样品荧光测定以1号板为空白，在酶标仪上以激发光360nm，发射光460nm，狭缝25nm的条件下测定2号板各样品的荧光强度。根据得到的荧光强度值选择相应的标准曲线，由回归方程计算出2号板中4-MU含量。酶活力单位定义为每分钟水解4-MUG生成1nmol4-MU的酶量为一个单位。GUS基因的表达活性以每毫克总蛋白的酶活力表示，即4-MU nmol/mg/min。
实施例14GhSCFP启动子的功能分析经过对转GhSCFP1.0::GUS基因烟草不同组织的GUS染色，结果发现在叶片、茎、花冠、雄蕊、柱头中均未检测到蓝色出现，而在烟草幼嫩种子及部分胎座表面观察到蓝色，特别在种子表面有很深的蓝色出现。同时在开花前以及开花后12天种子表面观察到蓝色，12天后蓝色消失。结果表明GhSCFP1.0启动子在种子发育早期有活性，且只在种子中表达。进一步对GUS染色的种子切片观察发现，在种皮的五层细胞中，只有最外层细胞被着色，即该启动子具有种皮表达特异性。
对转GhSCFP1.0::GFP基因烟草进行荧光检测，在叶片、茎、花冠、雄蕊、柱头同样未观察到GFP的绿色荧光，而在幼嫩的种子上可以观察到较强的绿色荧光，非转基因的野生烟草种子只被激发出红色荧光。上述结果表明GhSCFP::GUS和GhSCFP::GFP融合基因，可以特异地在幼嫩烟草的种皮中表达。因此，在烟草中，该启动子具有严格的种皮特异性和发育时间特异性。
进一步检测转GhSCFP1.0::GUS基因烟草不同组织的GUS酶活性，结果可见转基因烟草的花冠、叶片、茎、萼片和子房壁中，GUS酶活性最高只有88.5nmol/mg/min，但是开花后5天的种子中GUS酶活性在500nmol/mg/min以上。结果同样说明该启动子具有种子优势表达特异性。
上述是转基因烟草的检测结果，经过对转GhSCFP1.0::GUS基因棉花不同组织的GUS染色，结果发现在叶片、幼茎、花冠、雄蕊、柱头和开花前1-2天的胚珠中均未观察到蓝色信号，而在开花后胚珠表面突起的纤维上观察到很深的蓝色，特别在开花当天的胚珠表面，观察到有蓝色的点，而这些蓝色的点就是突起的纤维，直到开花后8天，仍然显示蓝色。对开花后3天且经过GUS染色的胚珠进行纵切，观察纵切面发现，被GUS染成蓝色的部分，就是棉花的纤维部分。进一步通过石蜡切片观察，在开花当天的胚珠表面，突起的纤维细胞被染成蓝色，而未突起的表皮细胞着色很浅。上述结果表明GhSCFP1.0启动子具有陆地棉纤维发育特异性。
实施例15棉花GhSCFP基因启动子核心区域鉴定按照5’端缺失原则，对GhSCFP1.0启动子进行删除。删除了该启动子的-634至-543、-634至-336、-634至-127、-634至-61和-634至146共5个区域后，分别与GUS基因融合构建植物表达载体并转入烟草中。对开花后5天的转基因烟草种子进行GUS酶活性分析，检测结果表明当删除该启动子的-634至-543区域(SEQ ID NO.3)后，转基因烟草种子中的GUS酶活性降低了约30倍，表明该区域含有一个增强子序列。其余4个区域分别删除后，种子中GUS酶活性变化不大。转基因烟草不同组织的GUS酶活性测定发现当删除GhSCFP1.0启动子-635到-543区域后，茎和叶片中的GUS酶活高于种子、花冠，表明在该区域中还有控制启动子在种子中特异表达的元件。
序列表.ST25SEQUENCE LISTING<110>西南大学<120>棉花纤维特异启动子及其应用<130>06P103129<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2436<212>DNA<213>陆地棉<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2436)<223>棉花种皮纤维特异基因<400>1ctagcacccc ctaaaaagct tgtgcttgga tatggctgaa aacccagtaa aatggctgtt 60tctcattcta gcaagctgcc tgtgtttcgc tttcgtcctc tcggaaagca acttattgat120aaagaagacc tacatcgtcc aaatgcacaa gtctgcaatg ccagcatcat tctcaagtcc180tctggaatgg tactcatcga aattaaagtc ggtaatgtcc gatacccaga gtgaaggtga240aggagatggt gaaaatagga tcatctatag ctaccaaaat gcttttcatg gtgttgccgc300tcagttaact gaagaagaag ctgagaggct aaaacaagaa gatggtgtag ttgctatact360tccagagacc aagtatgaat tacacaccac aaggagtcct atgttccttg gattagaacc420agaagaaagt actagcatct ggtctcaaaa acttgcagat catgatgtca tagttggggt480acttgacact ggaatttggc cggaaagtgc tagctttaat gatacaggga tgacaccggt540tcctgctcac tggaaaggaa catgtgaaac tggacgaggc tttcaaaagt atcactgcaa600caggaaaatt gtgggtgcaa gagtgttcta ccggggatat gaagctgcca ctgggaaaat660caatgagaaa aacgaatata aatcacctcg agatcaagat ggacatggta ctcacacagc720agccactgtt gctggctctc cggtacgagg tgcaaatctt cttggttatg cctatggaac780agctagagga atggctcctg gtgcaagaat tgcagcttac aaggtttgct ggactggtgg840gtgcttcagc tcggatattc tgtcggcggt tgatagagcg gtgggtgatg gagtgaatgt900
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<400>3tttattacaa cttttctcta ccaatcaaat ttaaaaaata gaaaaatgaa aatcgatgaa 60ttggatcacc acaatttagc ccaaagaaaa a9权利要求
1.一种棉花纤维特异启动子，其至少含有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的棉花纤维特异启动子，其特征在于其具有如SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
3.一种含有权利要求1或2所述的棉花纤维特异启动子植物表达载体。
4.根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于其具有如图4所示的结构。
5.根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于其具有如图5所示的结构。
6.一种转化体，包含权利要求1或2所述的棉花纤维特异启动子及宿主。
7.根据权利要求6所述的转化体，其特征在于，所述宿主为根癌农杆菌。
8.权利要求1或2所述的棉花纤维特异启动子在制备转基因植物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述转基因植物为烟草或陆地棉。
10.一种含有权利要求1或2所述的棉花纤维特异启动子的转基因植物的制备方法，包括下述步骤(1)将棉花纤维特异的启动子序列可操作地插入表达载体中，构建植物表达载体；(2)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；(3)将所述转化体转化植物，获得转基因植物。
全文摘要
本发明涉及一种棉花纤维特异启动子，该启动子全长1037bp，－634至－543区域为核心区。通过构建含有该启动子的植物表达载体，将其转化到转基因烟草和转基因棉花中，GUS组织化学染色、酶活性检测和GFP荧光纤维检测证实，该启动子在烟草中具有外种皮优势表达活性，在陆地棉中具有纤维表达特异性。
文档编号C12N15/82GK1995350SQ20061015682
公开日2007年7月11日 申请日期2006年11月10日 优先权日2006年11月10日
发明者侯磊, 裴炎, 罗明, 肖月华, 李德谋, 杨霞, 李家宝, 刘灏 申请人:西南大学