专利名称：一种制备葡激酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备葡激酶(Staphylokinase，SAK)的方法，具体地说是涉及一种葡激酶的表达及纯化方法，属于生物工程制药领域。
背景技术：
葡激酶是金葡菌溶源性噬菌体合成的一种胞外蛋白质(de Waart.J.，K.C.Winkler and C.Grootsen Nature 1962，195407～408 Winkler K.C.，deWaart.J.，and C.Grootsen J.Gen.Microbiol.1965，39321～333 Kondo.I.，Kiyotaka F.，Infection and Immunity)1977，18266～272)。自1983年Sako(Sako.T，Tsuchida.N Nucleic Acids Res.1983，117679～7693)、1987年BehnkeD(Behnke D.，Gerlach D.Mol.Gen.Genet.1987，210528～534)、1992年CollenD(Collen D.，Z.A.Zhao，P.Holvoet etal.Fibnolysis 1992，6226～231)等成功将葡激酶基因在大肠杆菌或枯草杆菌中表达以后，科学家们对葡激酶的溶栓机理进行了深入研究。随着动物实验的增多，葡激酶的临床前研究工作进展迅速，其在血栓性疾病临床溶栓治疗应用的前景非常广阔。
目前公开的葡激酶生产制备的方法主要有一、国外文献中报道的方法1、采用CM-cellulose柱层析方法氯化钠连续梯度洗脱一步纯化(Sako TOverproduction of staphylokinase in Escherichia coli and its characterization.FEBS.1985，149(3)557-63)，SDS-PAGE纯度在90％左右，内毒素未测定。
2、采用离子交换层析和分子筛方法纯化(Gerlach D，Kraft R，Behnke DPurification and characterization of the bacterial plasminogen activatorstaphylokinase secreted by a recombinant Bacillus subtilis.Zentralb BakteriolMikrobiol Hyg[A].1988，269(3)314-22.)，SDS-PAGE纯度在90％左右，内毒素未测定。
3、采用SP-Sepharose和Phenyl-Sepharose层析两步纯化方法(Schlott B，Hartmann M，Guhrs KH，etal.Biotechnology 1994，12(2)185-9.)，SDS-PAGE纯度在95％以上，内毒素小于10 Eu/mg。
4、采用金属离子柱方法一步纯化(N端缺失10个氨基酸)(ChattopadhyayD，Stewart JE，DeLucas LJ.Large-scale preparation of the delta1O form ofstaphylokinase by in vitro processing of recombinant staphylokinase with purifiedhuman plasminogen.Appl Biochem Biotechnol.1998，69(3)147-56.)。
二、国内文献报道的主要纯化方法1、CN1096325A，菌体破菌用S-Sepharose离子交换，再结合分子筛方法纯化。
2、CN1307129A，主要使用了两步柱层析(SP-Sepharose F.F，和Phenyl-Sepharose F.F)纯化。
3、CN1394952A，菌体破菌后用50KD超滤膜除杂蛋白，加入NaCL，直接在Phenyl-Sepharose H.P疏水层析柱上经梯度纯化。所纯化的葡激酶为N-端缺失10个氨基酸的衍生物，其纯度可达95％以上(电泳纯)。
4、CN1511952A，菌体破菌用100KD超滤膜除杂蛋白，滤出液上pH8.0 PB直接在Q-Sepharose F.F柱上经0.25M NaCL洗脱纯化，所纯化的葡激酶为N-端缺失15个氨基酸的衍生物。其电泳纯度和HPLC纯度均可达98％以上5、CN1446912A，使用了阴离子交换层析(Q-Sepharose F.F)穿滤、阳离子交换层析(SP-Sepharose F.F)、凝胶过滤层析(Sephacryl S-200)三步连用，纯化重组葡激酶，结果为最终洗脱液电泳检测无杂条带。
6、将6聚组氨酸序列结合在葡激酶C端融合表达，使用金属镍离子柱纯化融合表达的蛋白，该方法未除去融合序列(吴樱，黄鹤，周加文，甘一如利用pET-29b载体进行葡激酶基因表达与其产物的亲和纯化 吉林大学学报(医学版)，2004，30(6)865-867)。所得到的产物为葡激酶融合蛋白(所加上的6聚组氨酸不易去除)，不同于天然的葡激酶。
在专利申请号为200510022492.5的专利申请中，发明人也公开了一种葡激酶的制备方法，该方法是以制备葡激酶和除去其中的热原为目的，需要经过多次离子交换层析和多次超滤后得到最终产品。
在制备重组葡激酶过程中，由于破菌后上清体积偏大，需要反复使用超滤浓缩，在生产过程中，成本高，生产周期长；虽然在吴樱、黄鹤、周加文等的方法中，将6聚组氨酸序列结合在葡激酶C端融合表达，使用金属镍离子柱纯化融合表达的蛋白，可以克服反复使用超滤浓缩的缺陷，但是，融合的6聚组氨酸却很难去掉，所得到的产物为葡激酶融合蛋白，不同于天然的葡激酶，现有已发表的文献不能为其所用。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备葡激酶(Staphylokinase)的方法，具体说包括葡激酶的表达及纯化方法。
本发明制备葡激酶的方法，包括以下步骤a、通过基因工程方法，得到包含具有如SEQ NO.2的氨基酸序列的可溶性融合蛋白的发酵产物；b、分离纯化步骤a得到的融合蛋白先用金属镍离子亲和凝胶柱吸附，并用洗脱液洗脱，得到洗脱产物，即具有如SEQ NO.2的氨基酸序列的可溶性融合蛋白；c、将步骤b融合蛋白用肠激酶酶切后适当稀释，过b步骤所述的凝胶柱，收集穿透液；d、将步骤c穿透液经超滤浓缩后，过Q凝胶柱得葡激酶原液。
所述融合蛋白中，葡激酶氨基酸序列紧紧置于肠激酶识别位点-DDDDK-之后。融合蛋白经肠激酶酶切处理之后，经进一步纯化得到表达的葡激酶。
进一步地，制备步骤a所述的可溶性融合蛋白的方法包括a)用PCR方法得到如SEQ NO.1的基因序列；b)构建含有SEQ NO.1的基因序列的重组质粒，并将重组质粒导入大肠杆菌，得到发酵菌种；c)将发酵菌种接种于含氨苄青霉素100μg/ml的400mlLB培养基中，在250rpm摇床上，30°C下培养至A6002.0左右，再接种到3600ml LB培养基中同前培养至A6003.0左右作为种子液接种于装有36L的高密度发酵培养基的B.Braun D50发酵罐中，控制pH在7.0左右、溶氧在15～75％、温度37℃培养至A60015.0左右，加入IPTG至0.5mM诱导，同前培养3～4小时，在5～15℃、5000rpm条件下离心收集细菌，将其用磷酸缓冲液稀释后，破碎离心得含可溶性融合蛋白的上清液，调pH6.0～8.0，备用。
更具体地，在a)步骤中以葡激酶基因为模板，引物1、2为作PCR扩增引物15’-AAAGGTACCGACGACGACGACAAGTCAAGTTCATTCGACAAAGGA-3’引物25’-AAAGAGCTCTCATTATTTCTTTTCTATAACAACCTT-3’，得到如SEQ NO.1的基因序列；引物1包含KpnI位点，引物2包含SacI位点。
b)将SEQ NO.1的基因序列经KpnI和SacI酶切后插入pET(32a)的KpnI/SacI位点构建重组质粒，并将重组质粒导入大肠杆菌，得到发酵菌种；优选的，步骤b或步骤c所述的金属离子亲和凝胶柱为Ni2+Chelating-Sepharose Fast Flow凝胶柱，流动相为pH6.0～8.0的10mM磷酸缓冲液，并用10～30mmol/L咪唑洗脱。
更优选的，步骤b的流动相为pH为7.0的10mM磷酸缓冲液，咪唑洗脱浓度为20mmol/L进一步地，步骤c中，先将步骤b产物稀释2～10倍后按每10mg融合蛋白加入1～5个单位的肠激酶，15～37℃下酶切10～24小时；更进一步，肠激酶加入量为每10mg融合蛋白加入2单位肠激酶。
优选地，步骤d所述的Q凝胶柱为Q-Sepharose Fast Flow柱，流动相为pH7.0含0.15mmol/L NaCL的20mM磷酸缓冲液；所述超滤浓缩的超滤膜的截留分子量为5000道尔顿。
上述b、c、d各步骤中流动相的流速为5～40ml/min；各种凝胶柱中的层析介质的粒径为50～150μm。
优选的，所述的各种凝胶柱中的层析介质的粒径为70～120μm。
更优选的，所述的各种凝胶柱中的层析介质的粒径为90μm。
本发明中所使用的层析柱均为在市场上销售的常规层析柱，使用的各种层析柱填料也是蛋白质纯化制备领域中常用的填料，均按常规方法装柱或购买预装柱。在本发明方法中自步骤b始所使用的溶液均为无热原溶液，所使用的仪器设备也要经过无热原处理和检验，以确保不会在制备过程中产生新的热原物质。本发明方法缓冲液的流速是常规流速，可以做适当调整。本方法各步骤持续的时间可以根据层析柱体积，缓冲液流速，上样量等具体情况按常识进行适当调整。
本发明葡激酶与药物中可以接受的相应药用辅料或载体等辅助添加成分组合，并按相应的相应制药方法加工，可制成为相应的剂型的药物制剂。例如，与注射药物中允许使用的适当溶剂和/或附加剂配合并按相应的工艺操作处理后，即可以制备成相应的水针、粉针或冻干制剂等肌肉或静脉形式的注射制剂药物。与药学上可以被接受的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用的辅助添加成份混合后，按相应的常规工艺方法处理，即可制成为片剂、丸剂、胶囊剂或适当形式的缓释剂、控释剂等固体制剂形式的口服制剂；与常用的增溶剂、乳化剂、润湿剂、起泡或消泡剂等表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等混合，按相应的常规工艺方法处理，即可制成为水剂、糖浆等液体制剂形式的口服药物或口含制剂。
本发明方法中制备得到的葡激酶能按下述步骤制备成冻干制剂。按葡激酶蛋白量的1.5～3.0倍加入15％～30％注射用人白蛋白(或用5％甘露醇)用作稳定和赋形剂，并用无热原0.15M NaCL pH7.0 20mM磷酸缓冲液定容，配制成5mg/ml的r-Sak蛋白液，用无热原0.22μm膜过滤后即得半成品，检测内毒素含量符合药用要求后，在100级洁净度下，1ml/瓶分装，冷冻干燥，包装即得成品。
本发明的有益效果在于本发明能够克服现有方法在制备过程中破菌后体积过大的不足，直接使用亲和层析方法纯化出目标融合蛋白，通过酶切除去联结在葡激酶分子N端的融合蛋白片段，再次通过亲和层析得到穿滤的葡激酶。纯化步骤的简便并易于放大，所纯化的重组葡激酶纯度能够完全符合药用要求。
本发明改变葡激酶表达方式并对纯化方法进行了优化，结合发明人在200510022492.5专利申请中公开的热原高效去除方法，葡激酶纯度超过99％、活性强、热原质低，超过了《中国药典》2005版第三部对同类产品的要求。该方法材料设备易得，成本低廉，步骤简便、可靠，并能够大规模应用。
图1工程菌目的融合蛋白的表达；图2重组融合蛋白的提取、酶切及葡激酶的纯化。
下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的详细描述对本发明进行说明。但这种说明不应理解为是对本发明的限制，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的技术思想，均属于本发明权利要求所定义的范围。
具体实施例方式
实施例一工程菌的构建及融合蛋白表达以专利申请
发明者吴洽庆, 杨卫华, 李德华, 梁波, 苟兴华, 黎耘, 刘忠荣, 及元乔, 李伯刚 申请人:成都地奥九泓制药厂