专利名称：：马铃薯病毒和类病毒检测试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及一种马铃薯病毒和类病毒的复合RT-PCR检测试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的制备方法及应用技术操作规程，属于植物病毒检验、检疫领域。
背景技术：
：马铃薯(So/fl"w/w加6erasM/wL.)是我国应用价值较高的经济作物，种植面积居世界第一位，面积已达6600万亩，总产量5609.6万吨。马铃薯适宜栽培区域广泛，但病毒病害严重影响了马铃薯的产量和品质，在我国引起马铃薯退化的主要病毒有马铃薯巻叶病毒(尸0加0/ea戶o//v!nw,PLRV)、马铃薯X病毒(尸ototovz>w《PVX)、马铃薯Y病毒(尸ototov&逝y，PVY)、马铃薯S病毒f尸ototoWrwsS,PVS)、马铃薯A病毒(尸ototoWr旭APVA)和马铃薯纺锤块茎类病毒(户ototoj/w加tfeft/6erwra試PSTVd)，且多数是复合感染。马铃薯已被列为我国7大作物之一，也是中国西部最重要的作物品种和主要的支柱型产业，发展势头良好，但目前我国马铃薯单产只有发达国家平均单产的1/3，马铃薯病毒是造成马铃薯产量低、质量差的主要原因。目前生产上普遍采用马铃薯脱毒种薯来防治病毒病的危害，为确保马铃薯原原种、原种的脱毒质量，建立快速、准确、灵敏、高效的马铃薯病毒类病毒检测技术是马铃薯种薯生产的关键技术环节，也是马铃薯产业良性发展的迫切需要。国内马铃薯病毒检测主要是山东农科院和国际马铃薯研究中心提供的ELISA检测试剂盒，这种酶联免疫检测技术依赖于抗血清，血清大多依赖进口，价格高，不适合生产的需要，且免疫学检测技术的灵敏度低和准确性差，在生产t应用具有较大的局限性，极大地限制了我国马铃薯种薯生产病毒检测的普及和应用；同时ELISA不能准确的检测到休眠块茎中的PLRV和PVY病毒，在检测前需打破休眠；此外，对于不具有免疫原性的PSTVd类病毒来说，根本无法使用ELISA技术进行检测。因此生产上迫切需要一种全面、快速、简便、灵敏、廉价的检测技术。聚合酶联式反应(Polymerasechainreaction,PCR)与ELISA检测相比具有灵敏度高、特异性强和准确可靠及稳定性好的特点，被认为是病毒检测技术的一次革命，已在许多植物病毒上应用。常见的马铃薯病毒大多是单链RNA病毒，需要先将病毒RNA反转录后再进行PCR扩增，即反转录聚合酶链式反应(Reverse-transcriptionPolymeraseChainReaction,RT-PCR)技术。随着分子生物学技术的不断发展，近年来已由一次只能检测一种病毒的单一RT-PCR技术发展到可以同步检测两种至多种病毒的双重PCR(d-RT-PCR)、复合RT-PCR(m-RT-PCR)检测。复合RT-PCR检测技术可以同时检测多种病毒和类病毒，在大大提髙检测的准确性和灵敏度的同时，还大大降低了检测的成本、縮短了检测时间，成为马铃薯病毒类病毒RT-PCR检测的方向和主流。加拿大科学家Nie等曾经探讨用随机引物进行马铃薯主要病毒和类病毒的复合RT-PCR检测研究，国内王中康等也开展了有关研究。但是他们都没有对病毒检测过程中存在的假阴性结果的问题提出有效解决的办法，没能构建一种试剂盒来同时检测马铃薯的5种病毒和1种类病毒。研究马铃薯的5种病毒和1种类病毒同步快速RT-PCR检测，解决RT-PCR检测过程中易出现假阴性结果的问题，解决同时检测马铃薯病毒和类病毒的问题，解决脱毒马铃薯产业发展的限制性问题都具有重要的意义。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有检测方法不能同时检测马铃薯病毒和类病毒，检测成本高，时间长的问题；克服RT-PCR检测中的假阴性问题，提供一种新的马铃薯病毒和类病毒的复合RT-PCR检测试剂盒，来同时检测马铃薯病毒和类病毒，且快速、简便、灵敏、廉价。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种马铃薯病毒和类病毒的复合RT-PCR检测试剂盒，由组分I和组分II组成，组分I由将马铃薯病毒和类病毒mRNA逆转录为cDNA第1链的必要试剂所组成，包括逆转录酶、RNA酶抑制剂，dNTP混合物，检测对象的cDNA第l链的互补引物，cDNA第1链反应缓冲液；组分H由以cDNA第l链为摸板进行PCR扩增的必要试剂所组成，包括PCR反应缓冲液，dNTP混合物，MgCl2，TaqDNA聚合酶，复合PCR引物组合等；所述的检测对象合成cDNA第l链的引物是由7对引物中的互补引物按照任意比例所组成的、混合物SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12和SEQIDNO:14。所述的PCR复合引物组合是由以下7对引物所组成SEQIDNO:l、SEQIDNO:2(引物对1);SEQIDNO:3、SEQIDNO:4(引物对2);SEQIDNO:5、SEQIDNO:6(引物对3);SEQIDNO:7、SEQIDNO:8(引物对4);SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO(引物对5);SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12(引物对6)和SEQIDNO:13、SEQIDNO:14(引物对7)。优选的，上述7对引物按照以下比例所组成弓l物对i:引物对2:弓l物对3:弓l物对4:弓l物对5:弓l物对6:弓l物对7=1:i:i:i:i:i:0.5。其中，组分I中还可包含有无RNA酶的去离子水；组分II中还可包含有马铃薯巻叶病毒(PLRV)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)A、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的混合物，即阳性对照样品，该阳性对照无侵染活性。上述试剂盒中，除了组分I中合成cDNA第1链的引物和组分II中PCR引物不能从生物试剂公司购买得到外，其余的试剂或酵都能从国内外普通生物试剂公司购买得到，其中所述的逆转录酶优选为M-MLV逆转录酶。组分I中合成cDNA第1链的引物和组分II中PCR引物可按照序列表中所公开各引物的核苷酸序列将其人工合成后，再将其按照上述比例混合在一起，配制成浓度为50uM的核苷酸混合液。组分I和组分II中各组分的量可根据实际情况(例如待检样品的数量)而定。例如，组分I中各组分的量可以是完成1次cDNA第1链合成反应的用量也可以是完成多次cDNA第l链合成反应的用量，同样，组分II中各组分的量可以是完成1次PCR反应的用量也可以是完成多次PCR反应的用量，这些都是本领域的技术人员很容易掌握或设计的。作为一种参考，本发明马铃薯病毒和类病毒的复合RT-PCR检测试剂盒，组分I中各试剂的量和组分II中各试剂的量可按照如下用量进行组装组分I:50iiM合成cDNA第1链的引物0.5-5000uL5XcDNA第1链反应缓冲液1-5000uL40UuI/1RNA酶抑制剂0.5-5000iiLlOmmolL-1dNTPs0.2-5000uL200UuL"M-MLV反转录酶0.5-5000uL组分IIIOXPCR反应缓冲液l國5000nL25mMMgC120.1-5000nL，0.1-5000nL，0.1-5000nL0.1國500(HiL。l一5000nL10mMdNTPs50uMPCR引物TaqDNA聚合酶阳性对照将上述各种试剂单独分装后，放置于试剂盒中，保存在一20C冰箱里，即得本发明试剂盒。其中，组分I中的各种试剂要严格灭活RNA酶，用于分装组分I各种试剂的容器也要做到无RNA酶污染。本发明试剂盒的使用方法，可参照下述操作规程进行1.合成cDNA第l链待测病原样品RNA(10—100ng/uL)5uL50uMcDNA第l链的引物UL88r，lOmin，O"C5min;再加入下述试剂5XcDNA第1链反应缓冲液6uLRNA酶抑制剂(40UuL'1)1uLdNTPs(lOmmolL-l)2uL反转录酶(200UuL-l)1.5uL补加无RNA酶的去离子水直到反应总体积到30nL;反应条件混匀后37'C保温10min，42'C反应1.5h，即合成cDNA第1链；2.按以下组份进行复合PCR反应(同时设置阳性对照)cDNA第l链产物5jiL，IOXPCR反应缓冲液5&，25mMMgC121^L，lOmMdNTPs1mL，pcr引物混合物1mL，TaqDNA聚合酶1.4&，加灭菌双蒸水补足到50nLpcr扩增条件94。C3min;9化50s，54。C30s，72"Cl.Omin，35个循环;72匸10min。3.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳及判定方法反应结束后取10liLPCR产物经5%聚丙烯酰胺凝胶电泳观察结果，阳性对照均出现各个检测带。检测样品时，如果仅出现N2190bp片段者，则为健康样品；若无190bp的DNA带出现，则为假阴性样品，需要继续进行检测确定；若l卯bp片段和其他片段同时出现，则为感病样品，其中PVX的扩增带为520bp，PVY的扩增带为420bp,PVA为410bp，PSTVd为360bp,PVS为310bp，PLRV为270bp。本发明RT-PCR检测试剂盒中所用到的引物是本研究特异设计的，能够检测病毒的不同株系且容易区分，它们之间没有相互干扰，由于引物设计方面减小了扩增片段的长度，增加了检测的灵敏度。本发明首先从马铃薯病毒和类病毒基因序列克隆和同源性分析入手，首先建立这些病原的单一RT-PCR检测技术，并对PCR产物进行克隆和序列同源性分析，获得无侵染活性的阳性对照，为设计本发明试剂盒中复合RT-PCR特异引物提供序列信息，所设计的引物特异性强，并充分考虑到病毒株系的基因组变异，从基因组最为保守的序列区段设计特异引物，且不同病毒的引物之间不相互互补干扰反应，能检测病毒和类病毒的不同株系、引物之间无互补干扰、且引物扩增条带大小容易区分，可同步检测多重侵染马铃薯的5种主要病毒和1种类病毒。现有检测技术体系方面没有有效解决复合RT-PCR检测过程中存在的假阴性结果的问题。本发明RT-PCR检测试剂盒中引入了马铃薯基因组的mRNA作为内对照，监测整个马铃薯病毒类病毒RT-PCR过程，从根本上解决了马铃薯病毒和类病毒检测中易出现假阴性结果的问题。本试剂盒是用于检测PLRV、PVY、PVX、PVS、PVA和PSTVd的病毒的RNA的RT-PCR检测试剂盒，可以同步快速检测这些病毒和类病毒，釆用了两步RT-PCR法，用于定性检测PLRV、PVY、PVX、PVS、PVA和PSTVd。该试剂盒附加了无侵染活性的阳性对照和植物的内对照RNA，用于内对照实验和阳性对照试验，可以防止假阳性和假阴性的出现。本发明试剂盒具有成本低廉的特点，与我国目前应用的酶联吸附测定法(ELISA)相比，不仅大大提高了马铃薯检测技术水平，同时检测的灵敏度得到了大幅度提高，所用试剂除了M-MLV反转录酶为进口产品外，其余的试剂均为闺产试剂，大大节约了成本和资金，为我国马铃薯病毒、类病毒的检测提供了快速、准确、灵敏、高效的方法。利用本发明试剂盒对田间自然感病和脱毒试管苗的大量样品的检测，证明完全可以对马铃薯病毒类病毒进行快速检验；同时对马铃薯原原种、原种和种苗进行脱毒检验，可以特异性检测出主要病毒的种类。与传统的ELISA和双向电泳法进行了比对，结果该技术具有更髙的稳定性、灵敏度和准确度。本发明检测试剂盒操作简便、快速、成本低，可广泛应用于脱毒马铃薯种薯和种苗的室内检测、生产田检测、抗毒病毒材料的鉴定、筛选及植物检验检疫等方面。图1内对照引物N2的特异性专化RNA扩增产物1:DNsae处理后RT-PCR;2:DNsae处理后PCR;3:样品直接RT-PCR;4:样品直接PCR。图25%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果1，3，5,10:空白对照；2:PLRV产物；4:PVY产物；6:为PLRV和PVY的双扩增产物；7:200bpDNAmarker;8:N2和PLRV的双扩增产物；9:PVY和N2的双扩增产物.ll:N2的单扩增产物图3以N2亚基基因为内对照双重RT-PCR检测PLRV和PVY结果M:PCRmarker(994bp，697bp，515bp，377bp，237bp);l:空白对照；2:健康对照；3-5:大田马铃薯样品。图45%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果1:N2和PSTVd的双扩增产物；2:PSTVd单扩增产物；3:空白对照；M:DNAMarker。图5本发明复合RT-PCR试剂盒检测部分样品结果1-7号采集的不同样品检测结果，见材料部分。M:DNA分子量标准；J:健康对照；K:空白对照。图6本发明复合RT-PCR试剂盒检测部分样品结果8—19号采集的不同样品检测结果，见材料部分。M:DNA分子量标准；J:健康对照；K:空白对照;Z:混合样品多重RT-PCR产物图7多重RT-PCR检测灵敏度试验M:DNA分子量标准；K:空白对照；J:健康对照；l一6:稀释度试验(1X、10X、IOOX、200X、300X、400X)。具体实施方式以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。试验材料1、马铃薯感病样品马铃薯感病部分样品从张家口坝上地区釆集，另外一部分样品为河北慧谷科技有限公司进行脱毒马铃薯种苗检测时获得。这些样品经过马铃薯病毒和类病毒的单一RT-PCR技术检测，其带毒的种类经过确定(表l)。其中样品2号为复合感染PVA、PVS和PVX的烟草叶片，由重庆大学王中康教授惠赠。表i不同马铃薯样品感染病毒和类病毒情况<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2、所用试剂RNA酶抑制剂(Rnasin)购自宝生物公司，M-MLV反转录酶购自Progmega公司,TaqDNA聚合酶、dNTP等购自北京鼎国生物技术有限公司。其它各种化学试剂购自北京化学试剂公司。3、引物序列表2马铃薯病毒和类病毒复合RT-PCR检测所用的引物对及其扩增大小<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>试验例1内对照引物的特异性试验设计的N2引物(SEQIDNO:13和SEQIDNO:14)表现对RNA专化的特异性扩增，提取的样品总RNA经过DNase处理后进行反转录后，PCR扩增出一条特异带，而不经过反转录的步骤PCR扩增无任何条带。NAD2基因引物扩增出190bp的特异带(图1)。本发明将内对照引入到RT-PCR检测试剂盒中，高等植物的N2基因广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实和种子等器官中，且该基因在高等植物中具有很高的保守性，利用N2引物对三生烟、普通烟、心叶烟、番茄、茄子和辣椒等进行了RT-PCR试验，结果也能特异的扩增出目的片段，这说明N2基因在植物中具有一定的保守性，可用做植物RNA病毒检测的内对照。试验例2PLRV和PVY的双重检测对已经复合感染了PLRV和PVY的病毒样品(表l:样品标号IO)进行了双重检测，经5。/。的PAGE电泳表明(图2)，N2特异引物(SEQIDNO:13和SEQIDNO:14)可扩增出一条约190bp的特异片段，PLRV特异引物(SEQIDNO:l和SEQIDNO:2)可扩增出一条约310bp的特异片段，PVY的特异引物(SEQIDNO:3和SEQIDNO:4)则扩增出大约420bp的片段，这与理论设计的大小一致。在进行复合RT-PCR时，分别用N2引物和PLRV复合引物、N2和PVY复合引物、PVY和PLRV复合引物等组合进行了复合扩增，结果均扩增出目的条带(图3)。试验例3内对照RT-PCR检测PSTVd将已提取块茎的样品(表l，样品标号6)总RNA进行双重RT-PCR，经5%的PAGE电泳表明，用N2特异引物可扩增出一条约190bp的特异核苷酸片段，PSTVd特异引物可扩增出一条约360bp的特异核苷酸片段。在进行双重RT-PCR时，结果扩增出两条目的条带，如图4所示。试验例4本发明复合RT-PCR试剂盒检测马铃薯病毒和类病毒一、马铃薯感染病毒材料所收集的马铃薯感染病毒材料已经过ELISA和单一RT-PCR检测，确认出感染病毒的种类(表l)。二、检测试剂盒本发明复合RT-PCR试剂盒三、检测方法1.按照现有技术方法提取样品的高质量的总RNA(例如各生物技术公司的RNA提取试剂盒，或者改良CTAB法提取RNA等〉。2.样品总RNA5wL，20umol/L的cDNA第1链的互补引物1wL。88"C变性10min，冰上冷却3-5min;然后再加入下列试剂20umol/LRNasinlixL，5Xbuffer6uL，dNTPs(lOmmol-L-l)2uL，M-MLV反转录酶1.5uL(200UuL-l)，DEPC水补足到30uL，混匀后37'C保温10min，42X:反应1.5h，即合成cDNA第一链。3.PCR多重扩增(1)10XPCRbuffer5fiL，25mMMgCl21^L，10mMdNTPs1^iL，PCR复合引物组合lnL，TaqDNA聚合酶1.4^L,加灭菌双蒸水补足到50^L，加入一滴矿物油，881C变性510分钟后(2)加入cDNA第1链产物5^L，然后进行PCR循环扩增；PCR扩增条件94"C3min;50s，54'C30s，72°C1.0min，35个循环；72匸10min;4.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析复合PCR扩增产物，银染聚丙烯酰胺凝胶；5.电泳结果分析如果仅出现190bp片段者，则为健康样品；若无190bp的DNA带出现，则为假阴性样品，需要继续进行检测确定；若190bp片段和其他片段同时出现，则为感病样品，其中PVX的扩增带为520bp，PVY的扩增带为420bp，PVA为410bp，PSTVd为360bp，PVS为3l0bp，PLRV为270bp。四、检测结果检测结果见图5和图6。检测结果表明，用本发明试剂盒检测样品，可以准确的检测出样品所感染的病毒和类病毒的种类。本发明所设计引物的特异'生很强，在复合RT-PCR检测中只对病毒的特异带进行了扩增，且不同病毒和类病毒之间的引物没有干扰性，每个病原的特异带均能扩增出来，且内对照的特异带也能清晰的扩增出来。扩增的条带和大小和预期设计的要扩增的基因片段大小一致，且不同病毒扩增的片段的强度不一样，这可能是由于病毒在寄主体内的浓度不同或病毒的引物序列与病毒的基因序列配对程度不同引起的。将所扩增出的片段克隆并测定序列，测序证明所扩增的复合RT-PCR产物为病毒和类病毒的特异片段，N2引物扩增的l卯bp的片段为马铃薯本身基因的成熟的mRNA部分片段，与预期设计序列区间大小一致。试验例5本发明试剂盒多重检测的灵敏度试验为了确定以内对照为基础的本发明多重RT-PCR试剂盒检测马铃薯病毒和类病毒的灵敏度，对感染了PLRV，PVS,PVY的样品(表l)进行了灵敏度试验，将提取的样品RNA(100ng)分别稀释IX、10X、100X、200X、300X、400X的梯度标准，用本发明试剂盒进行多重RT-PCR检测，结果表明在200X(0.3-0.5ng)的稀释度下所有条带仍然可见(图7)。但是不同病毒扩增的片段的强度不一样，这可能是由于样品RNA的起始浓度不同或病毒在寄主体内的浓度不同或病毒的引物序列与病毒的基因序列配对程度不同引起的。加17幼202015序列表<110>河北^T农林科学院经济作物研究所<i2o>马铃班祸毒^祸錄检ai试剂食及几w用<130>卿<160>14<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>幼<212>DNA<213>Sol抑umtuberosumL<柳>1cccaaggaagtttcaccttc<210>2<211>20<212>DNA<213>Sol助umtuberosumL<400>2agaatcgtgccattctaccc<210>3<211>17<212>DNA<213>Solan咖tuberosumL"00>3tgccaactgtgaatggg<210>4<211>20<212>DNA<213>Solan腿tuberos咖L<柳>4gtggtgt柳tctctgtgtt<210>5<211>20<212>DNA<213>So1助ubtuberos咖L<400>5gcaacaaatgaggacctcag<210>6<211>20<212>DNA<213>Solanumtub枕osuaL<400>6tcagcggttgttgttccagt720DNASolan咖tuberosuml.<400>7助tgccgccta助cc卿tc>>>>2020242524〈■>8ggaUtccatcttgaaceigc<400〉9caagccgaaactcttgatgc<210>10<211>20〈212>DNA<213〉SolariumtuberosumL<400>10ccat,catggtccaaactcca<210〉U<211>24〈212〉DNA〈213>SolanumtuberosumL〈400〉11ggatccccgggga犯cctggagcg〈400>12ggatccctgaagcgctcctccgagc<400>13aagatcactgcagttcctttteat<柳>14t.aagatcatagaagcaatgctgcSolan測tuberosum920DNASolanumUiberosuinL1225DNASolanumtuberosumL1324DNASolanumtuberosumLSolan函tuberosumLA:>>>><<<<o123222210032222o1C12io123222权利要求1.一种马铃薯病毒和类病毒的复合RT-PCR检测试剂盒，由组分I和组分II组成；组分I和组分II中的各试剂单独分装，组分I由将马铃薯病毒或类病毒RNA逆转录为cDNA第1链的必需试剂所组成，包括逆转录酶、RNA酶抑制剂，dNTP混合物，检测对象的cDNA第1链的互补引物，反应缓冲液；组分II由进行PCR扩增的必需试剂所组成，包括PCR反应缓冲液，dNTP混合物，MgCl2，TaqDNA聚合酶，PCR复合引物组合；其特征在于所述的检测对象的cDNA第1链的互补引物是由以下7个引物按照任意比例组成的混合物SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12和SEQIDNO14；所述的PCR复合引物组合是由以下7对引物所组成SEQIDNO1、SEQIDNO2(引物对1)；SEQIDNO3、SEQIDNO4(引物对2)；SEQIDNO5、SEQIDNO6(引物对3)；SEQIDNO7、SEQIDNO8(引物对4)；SEQIDNO9、SEQIDNO10(引物对5)；SEQIDNO11、SEQIDNO12(引物对6)；SEQIDNO13、SEQIDNO14(引物对7)。2、按照权利要求1的RT-PCR试剂盒，其特征在于所述PCR复合引物组合中7对引物的组成比例是:引物对i:引物对2:引物对3:引物对4:引物对5:引物对6:引物对7=1:i:2:i:2:2:0.5。3、按照权利要求1的RT-PCR试剂盒，其特征在于组分I的组成为50UM合成cDNA第1链的引物0.5-5000uL，反应缓冲液1-5000VL，RNA酶抑制剂0.5-5000nL，lOmmolL1dNTPs0.2-5000liL,200UuL1M國MLV反转录酶0.5-5000wL;组分II的组成为PCR反应缓冲液l-5000fiL,25mMMgCl20.1-5000jiL，10mMdNTPs0.1-5000nL,50uMPCR复合引物组合0.1-500(HiL，TaqDNA聚合酶0.1-500(HiL。4、按照权利要求1的RT-PCR试剂盒，其特征在于组分I的组成为50UM合成cDNA第1链的引物0.5-5000uL，反应缓冲液1-5000uL,40UuL"RNA酶抑制剂0.5-5000UL，lOmmolL"dNTPs0.2-5000uL，200UUL"M-MLV反转录酶0.5-5000PL;组分H的组成为PCR反应缓冲液l-5000nL，25mMMgCl20.1-5000nL，10mMdNTPs0.1-5000nL，50uMPCR复合引物组合0.1-5000jaL,TaqDNA聚合酶0.1-5000nL。5、按照权利要求1的RT-PCR试剂盒，其特征在于组分I中还包括无RNA酶的去离子水；组分II中还包括有马铃薯巻叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒混合物的无侵染活性的阳性对照。6、权利要求l的RT-PCR试剂盒在检测马铃薯巻叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒中的应用，包括(1)将马铃薯待检样品RNA用组分1的试剂按照常规的反应条件逆转录合成cDNA第1链(2)将cDNA第1链用组分II的试剂按照常规的反应条件进行PCR扩增；(3)结果判定将PCR扩增产物进行5%聚丙烯酰胺凝胶电泳；如果样品仅扩增出了l卯bp片段，则为健康样品；若样品无190bp的DNA带出现，则为假阴性样品，需要继续进行检测确定；若样品扩增产物中，190bp片段和其它片段同时出现，则为感病样品，其中马铃薯X病毒的扩增带为520bp,马铃薯Y病毒的扩增带为420bp，马铃薯A病毒的扩增带为410bp，马铃薯纺锤块茎类病毒的扩增带为360bp,马铃薯S病毒的扩增带为310bp，马铃薯巻叶病毒的扩增带为270bp。7、按照权利要求6的应用，其特征在于，步骤(1)中所述的逆转录是按照以下反应条件来合成cDNA第1链(1)首先加入样品总RNA5uL和20umol/L的检测对象的cDNA第1链的互补引物1uL;88r变性10min，冰上冷却3-5min;(2)再加入下列试剂20umol/LRNA酶抑制剂1uL，5X反应缓冲液6uL，dNTPs2uL，M-MLV反转录酶1.5uL，DEPC水补足到30uL，混匀后37"保温10min，42T反应1.5h。8、按照权利要求6的应用，其特征在于，步骤(2)中所述的PCR扩增条件如下(1)10XPCR反应缓冲液5nL，25mMMgCl21jiL，10mMdNTPs1pL，PCR复合引物组合l^iL，TaqDNA聚合酶1.4^L，加灭菌双蒸水补足到50pL，加入一滴矿物油,88X:变性510分钟；(2)加入cDNA第1链产物5pL，进行PCR循环扩增；PCR扩增条件94"C3min;94'C50s,54'C30s,72"Cl.Omin，35个循环；72'C10min。全文摘要本发明公开了马铃薯病毒和类病毒的复合RT-PCR检测试剂盒及其应用。本发明试剂盒采用了特异的引物组合进行复合逆转录和PCR反应，可以快速、准确、灵敏的同步检测出马铃薯X病毒，马铃薯Y病毒，马铃薯A病毒，马铃薯S病毒，马铃薯卷叶病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒。本发明试剂盒引入了来自马铃薯本身基因的mRNA作为内对照，用于监测马铃薯病毒和类病毒复合检测的过程，解决了马铃薯病毒和类病毒复合RT-PCR分子检测中易出现假阴性结果的问题，同时设置了无侵染活性的阳性对照，用于监督试剂盒试剂的质量。本发明试剂盒操作简便、快速，成本低，可广泛应用于脱毒马铃薯种薯和种苗的室内检测、生产田检测、抗毒病毒材料的鉴定、筛选及植物检验检疫等方面。文档编号C12Q1/70GK101210271SQ20061015612公开日2008年7月2日申请日期2006年12月27日优先权日2006年12月27日发明者铭刘,吴志明,周巧梅,温春秀,伟田,董文琦,谢晓亮,马占元,高秀瑞申请人:河北省农林科学院经济作物研究所