专利名称：一种产β-丙氨酸的基因工程菌及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产P-丙氨酸的基因工程菌及其制备方法，以及其在 制备(3-丙氨酸中的应用。(二) 背景技术|3-丙氨酸，又名(3-氨基丙酸。1972年由Ross和Monroe在尿嘧咬的 降解产物中发现。它是一种非蛋白质氨基酸，是自然界中唯一的p型氨基酸。P-丙氨酸主要的生理活性是合成泛酸、辅酶A。现代医学研究发现， 在哺乳动物的神经系统中，它可作为大脑中的神经传递者；离子通道的激活作用；可治疗由组织缺氧引起的肝损伤。在精细化工领域P-丙氨酸用于合成聚合(3-丙氨酸，电镀緩冲剂，染料 等。在医药工业中，P-丙氨酸可用作许多药物的中间体，例泛酸钩，系维 生素B族物质，是多种代谢所必需的辅酶A的组成部分。肌肽是一种十 分有效的伤口愈合剂。N-(2，5-二氯-4-氰硫基苯)-p-丙氨酸是一种有效的抗 真菌剂，|3-丙氨酸具有较广泛的应用领域和市场前景。目前(3-丙氨酸采用化学合成法生产。化学合成法有三种工艺(1 )丙 烯腈法此法丙烯腈与氨在二苯胺和叔丁醇溶液中反应，生产P-氨基丙 腈，再进行碱解即得；此法的缺点是产物中存在有40%以上的NaCl和杂 质，需要反复纯化，反应过程中产生的NH3污染大气；(2)(3-氨基丙腈 法(3-氨基丙腈与氢氧化钡反应生成P-氨基丙酸钡和氮气，通入C02,钡 盐析出，产生(3-氨基丙酸，钡离子用树脂去除，此法的缺点是生产成本 高；(3)琥珀酰亚胺降解法琥珀酰亚胺在碱性氯酸钠溶液中生成(3-氨 基丙酸，反应液用盐酸调pH,用3倍量的95%乙醇使无机盐析出，滤液
用4倍量的蒸馏水稀释，离子交换树脂交换，交换液脱色，浓缩结晶，此 法需大量乙醇，生产成本高，生产场地安全性要求高。总之化学合成法的 原料、中间体及副产物有毒，对环境污染严重。
卩-丙氨酸在生物体内有多条合成途径。国外对L-天冬氨酸脱羧获得卩-丙氨酸已经有所研究。在L-天冬氨酸a-脱羧酶的作用下，L-天冬氨酸的 a位羧基能立体特异性地脱去生成(3-丙氨酸和C02,随着C02的释放，该 反应基本上是不可逆的。1971年，Nakano等首先表明来自大肠杆菌B抹 的粗提取物中有此酶活性。1979年，Williamson等进一步研究了把大肠 杆菌中的该酶纯化到表观均一后的酶活性。1980年，Cronan等也研究了 (3-丙氨酸在大肠杆菌中的合成，接着，人们又对该酶的晶体结构和形成机 制进行了研究。但由于该酶的活性非常低，直接从自然界中筛选产酶高活 力菌抹比较困难，到目前为止还未见相关报道。1996年，美国NSC技术 有限公司通过基因重组的方法，构建含该酶的菌抹(NS3291)，用于拆分 DL-天冬氨酸。
发明内容本发明即是为了克服自然界中筛选产酶高活力菌抹较为困难的不足， 提供了一种育种目标明确、效率高、合成(3-丙氨酸的能力强的基因工程 菌，以及这种工程菌的制备方法与其在制备(3-丙氨酸中的应用。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种产(3-丙氨酸的基因工程菌，所述的基因工程菌通过如下方法得 到利用PCR扩增含有，"D基因的供体菌的L-天冬氨酸a-脱羧酶基因 pa"D，并将其克隆到能高效表达外源基因的质粒上，得到pa"D基因高表 达载体，再将所得的pa"Z)基因高表达载体转化入受体菌，即得到所述的 产P-丙氨酸的基因工程菌。
所述供体菌为含有，"Z)基因的埃希氏菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、 分枝杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属、变形菌属、固氮菌属、根瘤菌属、 克雷伯氏菌属、螺杆菌属、李斯特菌属、蛭弧菌属、产碱杆菌属、弗朗西 斯菌属、志贺氏菌属、嗜冷杆菌属及嗜肺军团菌属的细菌。所述宿主菌优选的为大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。所述能高效表达外源基因的质粒为下列之一①pET系列，②pUC 系列，③pGEM系列，④pBluescript系列。本发明还涉及一抹可稳定遗传的产P-丙氨酸的基因工程菌大肠杆 菌 BL21(DE3)/pET28 b(+)-panD ( Esc/7erc/7/a.c0// BL21(DE3)/pET28 b(+)-panD),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2006年IO月27 曰，保藏编号CCTCCNO: M206114。(菌落边缘整齐，表面有光泽、湿 润、光滑，能发酵乳糖产酸产气，在伊红美蓝琼脂平板上呈现金龟子色。)制备所述的产(3-丙氨酸的基因工程菌的方法，所述方法如下利用 PCR扩增含有基因的供体菌的L-天冬氨酸a-脱羧酶基因p朋D，并 将其克隆到能高效表达外源基因的质粒上，得到戸"D基因高表达载体， 再将所得的载体转化入大肠杆菌，即得到所述的产(3-丙氨酸的基因工程 菌。j尤选的，所述方法i口下(1 ) PCR扩增供体菌L-天冬氨酸a-脱羧酶基因PCR产物经 凝胶回收后克隆至能高效表达外源基因的质粒上，得到；^"D基 因高表达载体；(2)步骤(1)所得的高表达载体转化克隆宿主菌感受态细胞，获得 含有pa"Z)基因高表达质粒的宿主菌细胞；(3)步骤(2)所得的含有戸"D基因高表达质粒的宿主菌细胞，涂 布到含卡那霉素的适宜于培养细菌的培养基如LB平板上， 20 37。C培养6 24h,即得所述的L-天冬氨酸a-脱羧酶高表达基 因工程菌。优选的，所述基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28 b(+)-panD, 所述方法3o下(1) PCR扩增大肠杆菌DH5a的L-天冬氨酸a-脱羧酶基因pa"D， PCR产物经凝月交回收后通过限制性内切酶SflwH I /所"d III酶 切后克隆至经B"wH I / III同样处理的质粒pET28b(+)载体 上，得到重组质粒pET28b(+)-panD;正向引物AACGGATCCTATGATTCGCACGATGCTG, 反向引物CCAAAGCTTAGCAACCTGTACCGGAATC, PCR反应条件90 98。C变性1 10min;接着进行20 50个循环，参数为94~95°C, i 5min; 50~70°C， 1 3min; 70 75。C， 20 180s;最后72。C延伸 2 30min;(2) 将大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等细菌感受态细胞，置于冰上，完 全解冻后将细胞均匀悬浮，取步骤(1 )所得质粒 pET28b(+)-panD,加入到感受态细胞中混匀，冰上放置5 30min, 10 60。C水浴热激30 120s，再冰上力文置5 30min;加入SOB(SOB 培养基市购或自制，自制配方如下(终浓度计)胰蛋白胨， 20g/L; NaCl， 0.5g/L;酵母膏，5g/L ; MgS04 . 7H20, 5g/L) 或LB( LB培养基可市购或自制，自制配方如下(终浓度计) 蛋白胨，10g/L;酵母膏，5g/L; NaCl， 10g/L; pH7.0。)培养基，
20 37°C, 50 ~ 250r/min振荡培养0.5 2h,室温下3000 5000r/min 离心5 15min,吸去上清液，用培养液将细胞悬浮； (3)步-紫(2)转化产物涂布于含10 100jxg/mL卡那霉素的平才反， 20 37。C培养，长出菌种后重复传代两次，所得菌种提取质粒经 酶切后琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定确认后保存菌种，即得所述 产卩-丙氨酸的基因工程菌——大肠杆菌BL21(DE3)/pET28 b(+)-panD。本发明还涉及所述的产(3-丙氨酸的基因工程菌在制备p-丙氨酸中的 应用。具体的，所述的应用为将所述产P-丙氨酸的基因工程菌经斜面培养基20 37。C活化后接入种子培养基，在20 37°C、 50~250 r/min培养12 48h后，以0.1% 20%接种量转入发酵培养基，20 37°C、 50~250 r/min培养1 24h后，加入诱导物D-半乳糖苷至终浓度0.01 1.5mmo1/ L或乳糖至终浓度0.1 50g/L,在20 37。C、 50 ~ 250 r/min培养12 48h后，离心取菌体，加入底物0.01 lmol/LL-天门冬氨酸溶液，20 80°C、 50 ~ 250 r/min转化l 72h,反应液经分离纯化得到所述P-丙氨酸。所述的斜面培养基、种子培养基、发酵培养基均为培养大肠杆菌的适用培养基，可采用一切可用于培养大肠杆菌的常规培养基，如SOB或LB培养基等。所述用于培养大肠杆菌的常规培养基，可市购，也可自制，SOB培养基自制配方如下(终浓度计)胰蛋白胨，20g/L; NaCl, 0.5g/L;酵母膏，5g/L ; MgS04 . 7H20, 5g/L; LB自制配方如下(终浓度计)蛋白胨，10g/L;酵母膏，5g/L; NaCl， 10g/L; pH7.0。斜面培养基是LB培养基再加入20g/L琼脂。在121。C下灭菌20min。本发明所述的基因工程菌及其制备与应用的有益效果主要体现在
(1 )运用大肠杆菌制备可合成(3-丙氨酸的工程菌(2 )所得工程菌合成p-丙氨酸的能力强；初步研究发现能达到2.94g/L，而出发菌抹用相同方法 检测不出P-丙氨酸；(3)运用基因工程技术对大肠杆菌进行改良，育种 目标明确、效率高。(四)
图1为实施例1构建高表达载体pET28b(+)-panD图语，kan为卡那霉素 抗性基因；图2为p-丙氨酸标准样品HPLC分析结果图，(3-丙氨酸保留时间 15.841min;图3为实施例3所得基因工程菌合成的p-丙氨酸HPLC分析结果图，卩-丙氨酸保留时间16.031min。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一 步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此(所用LB培养基为自制，配方如下(终浓度计)蛋白胨，10g/L;酵 母膏，5g/L; NaCl, 10g/L; pH7.0)实施例1:高表达载体的构建 步骤(1 )根据五.co//的L-天冬氨酸a-脱羧酶基因p朋Z) ( GenBank登录号 NC—000913 ) 的序列设计引物(正向引物 AACGGATCCTATGATTCGCACGATGCTG,下划线的序列为限制 酶 5awH I 切 点 ； 反 向 引 物 CCAAAGCTTAGCAACCTGTACCGGAATC ，下划线的序列为限制 酶州'"d III切点)，利用PCR技术扩增编码区序列；PCR反应条
件95。C变性3min; 4矣着进4亍35个循环，参^:是94。C, lmin; 60°C , lmin和72°C ， 45s;最后在72。C延伸5min。(2) PCR产物经凝胶回收后，用限制酶5amH I / III克隆至 pET28b(+)的相应位点，形成基因高表达载体 pET28b(+)-panD,质粒构建图谱见图1。(3) 取100ji1大肠杆菌DH5a感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻 将细胞均匀悬浮，取所得质粒pET28b(+)-panD5p1,加入到感受态 细胞中轻轻混匀，冰上放置30min。 42"C水浴热激90s,冰上放置 15 20min。加入400^1 LB培养基，37°C, 200 ~ 250 r/min振荡培养 lh。室温下4000r/min离心5min,用枪头吸掉400 pl上清液，用剩 余的培养基将细胞悬浮，获得大量载体pET28b(+)-panD。实施例2:工程菌的获得 步骤(1) 取lOOiil大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，置于冰上，完全解冻后 轻轻将细胞均匀悬浮。(2) 取实施例1所得质粒pET28b(+)-panD5(il,加入到感受态细胞中轻 轻混匀。冰上放置30min。(3 ) 42i:水浴热激90s,水上放置15 20min。(4) 加入400jilLB培养基，37°C, 200 ~ 250 r/min振荡培养lh。(5 )室温下4000r/min离心5min,用枪头吸掉400 上清液，用剩余的 培养基将细胞悬浮。(6) 将转入载体的细菌涂布在LB (含卡那霉素30ng/mL)平板上。(7) 平板在37。C下正向放置lh以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜， 长出菌种后重复传代两次，所得菌种提取质粒经酶切及测序鉴定正确 后保存菌种，即为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28 b(+)-panD。 实施例3: (3-丙氨酸合成能力对比实验将实施例2所得的基因工程菌在LB培养基上培养16 24h后，接入 含卡那霉素30吗/mL的LB液体培养基中，37°C 、 200 r/min摇床培养过 夜。然后以1%的接种量转入相同的LB液体培养基中，250ml装30mlLB 液体培养基，37°C、 200 r/min摇床培养至OD6。o约为0.4~1.0时，加入诱 导物(IPTG终浓度为0.4mmo1/L或加入乳糖至终浓度为8g/L ) ， 30°C、 200 r/min摇床培养12~20h,然后放于37°C 、 200r/min下摇床培养8h。 4°C ， 4500r/min离心lOmin,收集菌体，用10mL无菌水离心洗涤两次，最后 加入5mL 0.2mol/L L画asp (用NaOH调pH至7.0 ) , 37°C 、 200r/min下转 化2d。转化液于4500r/min离心10min取上清，上清液用2，4-二硝基氟苯 柱前书t生样品后经HPLC测定。选取的对照为￡. co"DH5cu co//BL21(DE3)、 E co//BL21(DE3)/ pET28b(+),采用上述相同方法处理。衍生步骤如下取各上清液样品10(iL,依次加入90(iL娃哈哈纯净 水，0.5mol/L碳酸氬钠溶液(pH9.0 ) 1 OOjiL, 1 % 2，4-二硝基氟苯乙腈液 lOO(iL,摇匀，置60。C水浴中避光反应60min，取出放置室温，加入700pL 磷酸緩冲液(pH7.0)。衍生后的样品用反相高效液相色语分析(3-丙氨酸的含量。高效液相 色谱4义为Agilent 1100 Series,色谱柱为Zorbax SB CI8柱(4.6x250mm )。 色谱条件如下流速1.0m 1/min;检测波长360nm;柱温30°C;流 动相A: 50mmol/LNaAc, pH6.4,流动相B:乙睛，采用线性梯度洗脱 时间(min)0—20， B ( % ) 5—33。卩-丙氨酸标样也用相同方法衍生及分析。根据标准物色谱峰的保留时
间定性，根据标准物的标准曲线对样品中(3-丙氨酸进行定量。进样量为20jiL。(3-丙氨酸标准样品HPLC分析结果图谱见图2;实施例2所得的基因工 程菌合成的p-丙氨酸的HPLC分析结果图语见图3 。对照样E co// DH5a、co// BL21(DE3)、 ￡ co/z' BL21(DE3)/ pET28 b(+) 用相同方法没有检测出P-丙氨酸，所以基因工程菌(3-丙氨酸的合成能力比 出发菌抹有显著提高。实施例4: P-丙氨酸合成将实施例2所得的基因工程菌在LB培养基上培养20h后，接入含卡 那霉素30吗/mL的LB液体培养基中，37°C、 200 r/min摇床培养17h。 然后以1%的接种量转入相同的LB液体培养基中，250ml装30mlLB液 体培养基，37°C 、 200 r/min摇床培养2h,加入IPTG至终浓度为0.4mmo1/ L, 28°C、 200r/min摇床培养19h,然后放于37。C、 200r/min下摇床培养 6h。 4°C, 4500r/min离心10min,收集菌体，用10mL无菌水离心洗涤两 次，最后加入5mL 0.2mol/L L-asp(用NaOH调pH至7.0 )， 37°C 、 200r/min 下转化2d。转化液于4500r/min离心10min取上清，上清液用2,4-二硝基 氟苯柱前^"生样品后经HPLC测定。衍生步骤如下取各上清液样品10pL,依次加入90jiL娃哈哈纯净 水，0.5mol/L碳酸氢钠溶液(p:H9.0 ) 100(iL, 1 % 2,4-二硝基氟苯乙腈液 lOOpL,摇匀，置60。C水浴中避光反应60min,取出放置室温，加入700|iL 磷酸緩冲液(pH7.0)。衍生后的样品用反相高效液相色谱分析P-丙氨酸的含量。高效液相 色语仪为Agilent 1100 Series,色谱柱为Zorbax SB CI 8柱(4.6x250mm )。 色谱条件如下流速l.Om 1/min; 4全测波长360nm;柱温30°C;流 动相A: 50mmol/LNaAc, pH6.4,流动相B:乙睛，采用线性梯度洗脱 时间(min)0—20， B ( % ) 5—33。结果显示工程菌转化液中P-丙氨酸含量达到2.94g/L。
权利要求
1. 一种产β-丙氨酸的基因工程菌，所述的基因工程菌通过如下方法得到利用PCR扩增含有panD基因的供体菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD，并将其克隆到能高效表达外源基因的质粒上，得到panD基因高表达载体，再将所得的panD基因高表达载体转化入受体菌，即得到所述的产β-丙氨酸的基因工程菌。
全文摘要
本发明提供了一种产β-丙氨酸的基因工程菌，所述的基因工程菌通过如下方法得到利用PCR扩增含有panD基因的供体菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD，并将其克隆到能高效表达外源基因的质粒上，得到panD基因高表达载体，再将所得的panD基因高表达载体转化入受体菌，即得到所述的产β-丙氨酸的基因工程菌。本发明所述的基因工程菌及其制备与应用的有益效果主要体现在(1)运用大肠杆菌制备可合成β-丙氨酸的工程菌；(2)所得工程菌合成β-丙氨酸的能力强；初步研究发现能达到2.94g/l，而出发菌株用相同方法检测不出β-丙氨酸；(3)运用基因工程技术对大肠杆菌进行改良，育种目标明确、效率高。
文档编号C12N1/21GK101210230SQ20061015555
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月28日 优先权日2006年12月28日
发明者裘娟萍, 高丽娟 申请人:浙江工业大学