专利名称：烟草s期激酶蛋白1基因序列及其编码蛋白质序列和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及S期激酶相关蛋白1基因，具体地说是一种来源于抗病烟草品 种枯斑三生烟(7Wcoria"ato6ac"mvar. SamsunNN)的烟草S期激酶蛋白1基因序列及其编码蛋白质序列和应用。
技术背景S期激酶相关蛋白1 (S-PHASE KINASE-ASSOCIATED PROTEINl， SKP1)是真核生物(烟草)中普遍存在的一类蛋白，是泛素连接酶3 SCF 复合体的核心亚单位。近几年来研究发现，SCF介导的泛素系统在茉莉酸信 号途径和R-基因介导的抗性等生物反应过程中均有作用，但具体通路尚不 太清楚，尤其是在壳寡糖的诱抗中的作用尚无报道。发明内容本发明目的在于提供一种烟草S期激酶蛋白1基因序列及其编码蛋白 质序列和应用。一种烟草S期激酶蛋白1基因序列，具有序列表中SEQ ID NO. 1碱基序列。所述的烟草S期激酶蛋白lcDNA基因序列的编码蛋白，具有序列表中 SEQ IDN0.2编码的氨基酸序列。应用基因序列的壳寡糖诱导植物抗性反应，从而可将所述基因序列用 于制备生物农药。本发明所具有的优点1. 真核生物烟草中普遍存在的一类蛋白，是泛素连接酶3 SCF复合体 的核心亚单位，与烟草的抗病毒活性相关，分子量为17527. 78Da，等电点 4. 57，定位于细胞质，其Skpl结构域位于4-105位氨基酸。2. 对生物农药的应用具有明显指导作用；该基因的克隆对于揭示壳寡 糖诱导植物抗性反应的分子信号通路很有价值，并在寡糖生物农药的应用 方面具有重要的理论指导意义。
图1为本发明S期激酶相关蛋白1 (SKP1)根据衍射数据得到三纬结 构模型图。
具体实施方式
S期激酶相关蛋白1 (S-PHASE KINASE-ASSOCIATED PROTEINl， SKP1)是真核生物(烟草)中普遍存在的一类蛋白，是泛素连接酶3 SCF 复合体的核心亚单位。近几年来研究发现，SCF介导的泛素系统在茉莉酸 信号途径和R-基因介导的抗性等生物反应过程中均有作用，功能上具有多
样性，调节过程广泛；烟草SKP1是在壳寡糖处理条件下特异表达的，因此 与壳寡糖诱导的植物抗性信号传导有着密切的关系。 实施例1l.烟草(枯斑三生烟)的S期激酶相关蛋白1基因的cDNA的克隆及序列1) 50mg/L的壳寡糖喷施烟草叶片，喷水作对照，分别在8h和168h取 样提取总RNA进行DDRT-PCR，将差异片段回收并亚克隆后，测序获得3 '端序列，该片段与本塞姆氏烟草的SKP1 ( S-PHASE KINASE-ASSOCIATED PR0TEIN1)基因同源性为82%。2) 利用CLONTECH公司的试剂盒获得枯斑三生烟草的SKP1基因的5 '端及cDNA的全长，进而推导出氨基酸序列。3) 可被壳寡糖诱导的枯斑三生烟草SKP1具有以下cDNA碱基(参见序 列表l)和蛋白质的氨基酸序列(参见序列表2)。烟草S期激酶相关蛋白l基因(SXP/)的cDNA序列特征基因组序 列653bp,核苷酸、线性双链，最初来源枯斑三生烟草(Nicotianatabacum var.samsun NN);烟草S期激酶相关蛋白l基因(SXP/)的氨基酸序列特征线性、单 链、155氨基酸。4) 根据枯斑三生烟SKP1基因的cDNA全长序列和pET-23b(+)的特点， 设计SKP1基因原核表达的PCR引物序列，分别在引物skples和skplea的 5 '端引入了 Nde I和Xhol I酶切位点(下划线部分)，另在下游引物的酶 切位点后面去掉目的基因的终止密码子以产生融合有His标签的融合蛋白， 引物序列入下SKP1 上游表达引物(skples ) 5' CGGCCCATATGTCCTCCTCAAAGATGATC 3'; SKP1下游表达引物 (skplea)5' GCCGCCTCGAGCTCAAATGCCCAAGCATT 3'，以枯斑三生 烟草总RNA为模板扩增待表达的基因片段，克隆到表达载体pET-23b(+)上， 转化表达菌株BL21 (DE3)诱导表达，表达出与预期蛋白相符的目的蛋白， 且该蛋白的大量表达可以抑制大肠杆菌的增殖，因此该蛋白具有一定的抑 菌活性，可增强植物的抗病性。5) 根据枯斑三生烟SKP1基因的cDNA全长序列设计RNA干扰引物，扩增目的片段，克隆到干扰载体pHANMBAL上构建干扰重组质粒pHANNIBAL-skpla-skpls，将其转化农杆菌LBA4404，然后侵染烟草获得 转基因烟草，结果证明有千扰片段插入的烟草植株抗烟草花叶病毒的抗性 减弱，因此SKP1基因的正常表达对烟草的抗病性起关键的作用。6) 根据枯斑三生烟SKP1基因的cDNA全长序列设计植物过表达扩增弓I 物 SKP1 上 游 表 达 引 物 (skplSLs )-5' CGGCCAGATCTATGTCCTCCTCAAAGATG 3'和SKP1下游表达引物 (skplSLa)-5' GCCGCACTAGTCTCAAATGCCCAAGCATT 3'，分别在引
物skplSLs和skplSLa的5 '端引入了 Bgl II和Spe I酶切位点(下划线部 分)，经过酶切和连接后构建出植物过表达重组质粒pCAMBIAl 1302-SKP1, 转化农杆菌LBA4404然后侵染烟草，实验结果表明在SKP1过表达的情况 下，植物体抗病性和抗逆性都由明显提高。 实施例21. mRNA差异显示及3'末端的克隆材料 感病烟草品种枯斑三生烟(Nicotianatabacum var. samsunNN)于温室中培养至幼苗为4-5片叶时，叶面喷施50mg/L壳寡糖，叶面喷施双蒸水作 为对照，分别在8小时和168小时取材。2. 总RNA提取，定量与完整性检测用双蒸水洗去叶表面尘土，在液氮中研磨，用TRIZOL (GibcoBRL) 试剂提取RNA。 (l)定量测260、 280nm处的吸光值，计算A^/A^的值 以估计总RNA的纯度。通过A湖的值计算总RNA的量。(2)RNA完整性检 测在1%甲醛变性琼脂糖凝胶上分离总RNA，若有两条清晰的带，且大 分子量(28SrRNA)的亮度近似为小分子量(18SrRNA)的亮度的2倍,则说 明总RNA完整。3. mRNA差异显示及差异片段的回收、载体连接一用RNAase free DNAase I去除总RNA中的DNA污染。第一条cDNA 合成在20tU反应体系中加入2.0lU浓度为0.1ug/ul的总RNA， 2.0ul 锚定引物AP (2uM)混匀，7CTC温育5min立即置冰上冷却，力ll 7 . 8 " 1 灭菌的DEPC水，5X反转录缓冲液4.0ul， 2.0ul的dNTP混合液(250 y M每种)，2.0 ti 1的DTT( 100mM),0.2 u 1 Superscript II RT enzyme( 200U/ Pi);反应程序为42°C 5分钟，50。C50分钟，70。C15分钟，holdat4。C。 DD — PCR:在l Oul反应体系中加入1 . 9 5 u 1灭菌的D E P C水， lOXPCR缓冲液lul(无MgCl2)， 1.5 lU MgCl2(25mM),2WdNTP mix(250WVI每种)，1 .7 5 ul随机引物(2PM)， 0.7W四甲基诺丹明标 记的相应的锚定引物(TMR — AP， 5!iM)， 1 W反转录产物，0.1 Units/W的AmpliTaqK酶;反应程序为9 5T变性2分钟；9 2 °C 1 5秒， 5 0°C 3 0秒，7 2°C 2分钟为一个反应循环，重复4次；9 2 °C〗5 秒，6(TC3 0秒，7 2°C 2分钟为一个反应循环，重复3 0次；7 2 。C延伸7分钟；Hold at 4°C。将来自经壳寡糖诱导的8h禾n 1 6 8 h材料 的同一对引物RT —P C R产物(4.0u 1DD-PCR样品+ 1 5 " 1荧光差 显示染料)并排在5. 6 %聚丙烯酰胺尿素胶上分离，5 5 °C， 3 0 0 0 V， 1 0 0 W 5小时，荧光检测，回收差异条带。经AP和ARP两端的L和M13, 通用引物对回收条带再扩增，扩增产物连接到PMD 18-T载体(大连宝生物 工程有限公司)上。4. 阳性克隆片段的鉴定将各连接产物转化大肠杆菌Novanblue，经蓝白斑筛选，分别挑取10个
白斑液体扩大培养并提取质粒(王关林，方宏筠，2002)1%琼脂糖电泳检测 后，选取迁移略慢的质粒经EC0R I和HindIII双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳 检测。 」5. 反向Northern点杂交分析取插入片段一致且与PCR产物大小一致的的质粒2W(0.5^gMl)点到 Hybond-K"尼龙膜上，8(TC烘烤2小时固定，用DIG-dUTP标记探针，按照地高辛试剂盒操作说明进行杂交分析后由大连宝生物工程有限公司用F Primer(M13-47)CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC在ABI PRISM 377 X L DNA Sequencer上测序。6. 序列同源性比较用核苷酸序列同源性比较软件(BLAST)在基因核苷酸数据库中进行 同源性比较分析。结果获得诱导表达的SKP1基因的3'端序列AAA7.cDNA的5'末端及全长的克隆cDNA5 一末端快速扩增按照Clontech公司的SMART RACE cDNA扩增 试剂盒说明书进行。1JJ g喷施壳寡糖8h后的烟草总RNA用于cDNA的合 成，逆转录产物用通用引物混合物(Long:5 '和Short:5 ' -CTAATACGACTCACTATAGGGC-3 ')和根据3 '端序列设计 的5 ' RACE基因特异引物(5' -TGAGATCGAATAGGGTGGCATGGTC- 3')按照 试剂盒说明书扩增目的基因。扩增产物经1%琼脂糖电泳检测并纯化后连接 到PMD18-T载体上，转化大肠杆菌Novanblue,蓝白斑筛选及酶切鉴定后， 由宝生物工程(大连)有限公司测序。获得5'端序列GCTTCTGAGGATGAGCTTAAGG
用Clone Manager软件分析并与3 '序列拼接，根据拼接序列设计扩增 全长的特异引物(5' - TAACAMGTCAGGGGTCCAAAAGC-3')与通用引物(Long:5'禾口 Short:5 ' —CTAATACGACTCACTATAGGGC-3 ') —起以5 ' -RACE-Ready cDNA为模板扩增差显片段的cDNA全长，连接到PMD18-T 载体上转化大肠杆菌Novablue，蓝白斑筛选及酶切鉴定后，由宝生物工程(大连)有限公司测序，获得枯斑三生烟草的SKP1基因cDNA的全长参 见序列表1，GCATTCACTCTCTCTGAGGAAGCGGTGGCTTTGGAATCTCAGACGATAAAGCATATGATTGAAGATGATTGCATCAAGAATGACTTCACTCCAGAGGAAGAAGAGGAGGTTAGGAGGGAGAATGCTTGGTGACTTTGTTA并推导出氨基酸序列参见序列表2:MSSSKMIVKSSDGETFEvlHEEAVAESQTIKHMIEDDC:,HADTsIPPNVTSKIAKVI57EYCKRHVDATKTEDKASED7fiEKGFDSDFVKVDQATFD95LIAANYNIKsDTCTVADMIKGKTPEEIRKTFIKNDFTPEEEEEVRREN AA F实施例31.SKP1蛋白的原核表达 (1)根据SKPl cDNA序列设计并在TaKaRa公司合成了 SKP1基因 的表达蛋白的引物SKP1 上 游 表 达 引 物 (skples )-5' CGGCCCATATGTCCTCCTCAAAGATGATC 3' SKPl 下 游 表 达 弓l 物 (skplea )-5' GCCGCCTCGAGCTCAAATGCCCAAGCATT 3'参考pET-23b(+)的多克隆位点，分别在引物skples和skplea的5 '端引 入了 Nde I和Xhol I酶切位点(下划线部分)。 (2) SKPl cDNA的合成 以SKPl全长亚克隆质粒pMD18-SKPl质粒为模板扩增待表达的SKPl cDNA序列，PCR 扩增反应在25 W反应体系中进行PCR反应体系[stock]1XrXn(50W)[final]无菌双蒸水18.PCR缓冲液10X2. 5^1IXdNTP混合液(1:1:1:1)250MM20刚skplcs10,0. 5ri0.2,Skpl6310MM0. 5^10. 2幽LATag酶5u/W0.0.05 u/WSkpl全长质粒DNAO，lPCR扩增反应条件95。C， 2min4个循环94°C 15sec，52 °C30sec，72°C 2min;30个循环94°C 15sec，68 °C30sec,72°C 2niin;72°C,10min- 4。C,hold将PCR反应扩增的目的片段按照Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0的操作程序回收纯化，在50 u 1反应液体系中用Nde I和Xho I 酶切回收的PCR产物和pET23b载体，37"C反应15 h,P/。琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。其中，10XH缓冲液组分5 0 0 mM Tris-HCl(pH7.5),100mM MgC12,10mM Dithiothreitol, 1000mM NaCl;分别将双酶切后的skpl誦e片段和pET曙23b载体按照Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0的操作程序回收纯化，在25 u 1体系中用T4 DNA连 接酶将skpl-e与pET23b片段连接。反应液体系A:反应液体系BX H缓冲液 SKPl扩增产物 Xho I (10 U/u 1 ) Nde I ( 8 U/ u 1 ) 无菌H20 一 10 X H缓冲液 pET23b质粒 Xhol I (10 U/u 1 ) Nde I ( 8 U/") 无菌H20 反应液体系A:反应液体系B:10 X H缓冲液 SKP1扩增产物 Xh0 I (10 U/u 1 ) Nde I ( 8 U/ u 1 ) 无菌H20 10 X H缓冲液 pET23b质粒 Xhol I (10 U/y 1 ) Nde I ( 8 U/ u 1 ) 无菌H20 2.性质测定(1)重组子的筛选鉴定 挑取LB/Amp平扳培养基上的单菌落接种于2 ml含Amp的液体LB培养 基中，37°C， 150rpm摇培过夜，按照小量质粒DNA提取法提取质粒，1%琼 脂糖凝胶(含0.5Mg/ml溴化乙锭)电泳检测质粒质量。用提取的质粒做模板，在2514反应体系中PCR扩增反应筛选阳性克隆，5 yl 40 ul 1. 5 u 1 2 y 11. 5 u ] 5 ul y 1 u 1 u 134 y 1812PCR反应体系 无菌双蒸水 PCR缓冲液 dNTP混合液(1:1:1:1) skplps skplpa LATag酶Skpl全长质粒DNA PCR反应条件 95 °C, 2min 4个循环94°C 15sec， 30个循环:94°C 15sec, 72°C，lOmin- [stock]10X 250MM IOMM 10, 5u/W1 XrXn(50W) 18.2. 5ri2. (￥1 0. 5rt 0. 5ri 0. 25W[final]IX 20刚 0.2, 0. 2幽 0.05 u/W52 。C 68 。C30sec， 30sec，72 °C 72 °C2min; 2min;— 4。C，hold 1%琼脂糖凝胶(含0.5Mg/ml溴化乙锭)电泳检测PCR反应结果， 扩增出目的产物质粒，用Nde I和XholI双酶切，反应体系如下，反应液体系13 lU8 u 1 U 1 5 ul 16. 5 u 110 X H缓冲液 pET23b-SKPl质粒 Xho I (10 U/y 1 ) Nde I ( 8 U/u 1 )无菌H2037"C反应15h，l。/。琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，将阳性克隆送宝生物 工程(大连)有限公司测序。(2)枯斑三生烟草SKP1蛋白的结构初始结晶条件摸索采用Hampton Reasearch的Kit I和KitII试剂盒， 以及实验室自己配置的PEG 4000和PEG 8000 Kit的稀疏矩阵采样法.经过 对温度、溶液pH、蛋白质浓度、离子强度、添加剂和沉淀剂等条件的摸索，
获得一种长柱状的晶体，可基本满足高分辨率的结构解析要求.晶体生长所 用的蛋白质最好是当日制备的SKP1新鲜蛋白质。最终的结晶条件如下50%聚乙二醇(PEG) 1000,50 mM磷酸钠，50 mM柠檬酸钠pH 4.2.数据在MAR345面探测器上收集，所用光源为RIGUKU的转耙阳极X射 线发生器，电压和电流分别为48 KV和98 Ma，波长为0. 15418 nm。衍射 数据用服L软件包的DENZ0和SCALEPACK程序处理，结果见下表Resolution limit[A]2.6Space groupUnique reflections (resolution range[A])21 328 (30.0-2.60)， 908(2.64-2.60)Completeness [%] (resolution range[A])89.50 (30.0-2.60)， 77.30 (2.64-2.60)实施例4(1)枯斑三生烟草SKPl在大肠杆菌中的诱导表达 将表达菌BL21(DE3)/pET23-skpl及相应的空载体菌接在LB液体培养 基/Amp中，37。C培养过夜，次日取或化后的菌液按1%比例继代培养3 h， 0D值达到0. 5-0. 6时用终浓度为1腿ol/L的IPTG诱导表达，持续振荡培 养4h。将1. 4 ml培养液8000 rpm离心10 min，将上清转入另一 EP管， 200 u 1无菌双蒸水和50 u 1的5X SDS上样缓冲液吹打悬浮细菌，沸水浴 10 min， 12000 rpm离心1 min，取15u 1上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳。 结果扩增出预期的目的蛋白，并且该蛋白对大肠杆菌有较强的抑制作用。 (2)该蛋白对大肠杆菌有较强的抑制作用转基因苗的鉴定 ①RNAi载体的构建 根据枯斑三生烟SKP1基因的cDNA全长序列设计RNA干扰引物，经 SES-WIN软件分析SKP1基因cDNA序列中无Xho I 、 Kpn I 、 Cla I和 BamHl限制性酶切位点，因此在引物中直接引入这些酶切位点，引物序 列如下小写为引入酶切位点(XhoI 、 Kpnl )，导致正向插入 primerl:SKPl正义引物-5' ctcgag CTACGATGTCCTCCTCAA 3' primer2:SKPl反义引物-5' ggtacc TCACTCAAATGCCCAAGC 3'小写为引入酶切位点(BamH I和Cla I )，导致反向插入 primerl:SKPl正义引物-5' ggatcc CTACGATGTCCTCCTCAA 3' primer2:SKPl反义引物-5' atcgat TCACTCAAATGCCCAAGC 3' 2004.10.8正向插入片段的PCR(以sf-8为模板)PCR反应体系[stock]lXrXn(25Pl)[final]无菌双蒸水18. 75WPCR缓冲液10X2.IXdNTP混合液(1:1:1:1)250MM2. (Msri-ss/as0.0. 2,sri-sa/aa翻0.0.2MMLATag酶0. 25W0. 05 u/WSkpl全长质粒DNA0.5W反应程序95°C， 2min 4个循环94°C 15sec 30个循环94°C 15sec 72°C，10min-150°C 30sec 68 °C 30sec 4。C,hold72 °C 2min; 72 °C 2min;说明书第9/13页将PCR产物克隆到PMD18-T载体上形成PSK1(正向片段)和PSK2(含 反向片段)质粒转化大肠杆菌NovaBlue菌株(美国Novagen公司)并提质 粒，PCR检测重组质粒，然后用与RNAi载体相匹配的限制性酶(XhoI和 Kpnl，位于启动子下游和基因内区上游，正义方向)酶切PSK1质粒上克 隆的靶基因序列，将酶切后的靶序列以正义方向克隆到RNAi载体 pHANNIBAL(5824bp)上形成PHSK1;用与RNAi载体相匹配的限制性内切 酶(BamHl禾QClal ，位于基因内区下游与OSC3 '上游之间，反义方向) 分别酶切PSK2上克隆的靶基因序列和PHSK1质粒，将酶切下来的靶基因 序列以反以方向克隆到带有靶基因正义片段的RNAi载体PHSK1上形成 PHSK2。用Notl酶切PHSK2和二元载体PART27，然后连接二者形成 PART27-SKP1。② 农杆菌的转化及烟草叶片外植体的遗传转化将PART27-SKP1经冻融法(电激法获三亲融合法)导入根癌农杆菌 LBA4404 "gro6ac^^m mme/ac/era LBA4404)，经质粒提取酶切鉴定后， 将转化的土壤农杆菌接种到含壮观霉素(Spec Resistance)的液体YEB培 养基中28'C摇床培养17-20h。然后用此培养物按叶盘法转化烟草:取上述土 壤农杆菌培养物稀释到液体M S培养基中，取烟草无菌苗的幼嫩叶片剪成 小块在该稀释液中浸5m i n，吸去多余菌液后,放至含有2.0m g/L6苄基 腺嘌呤、200-500m g/L羧苄青霉素、謂m g/L卡那霉素和0.5m g/LIAA 的固体MS培养基上，在14h白天、14h黑夜的光周期和25。C条件下培养. 约3周后,将生长至长1 c m以上的小苗转移到含300m g/L羧苄青霉素、 100m g/L卡那霉素和5m g/LIAA的固体M S培养基上诱导生根.约2 3周后可见根的形成,从而得到再生完整植株.待这些完整植株生长到大约5 c m时,移栽到花盆中，使之在温室中继续生长③ 转基因植株的PCR分析用C T AB法从烟草叶片中分离植物总DNA.取0.5g材料于液氮中 研成粉末,移至预热的500u L2X C T A B缓冲液中(2。/。C T A B，100mm o 1 / L T r i s C 1 ,20mm o 1 / L E D T A，1.4mm o 1 / L N a C 1 ,p H-8.0)加等体积氯仿:异戊醇抽提,2/3体积异丙醇沉淀，70%乙醇清洗.用转 化植株的总DN A为模板，未转化植株作负对照,进行P C R扩增反应,反应 条件为:94。C预变性10m i n后，94。C变性lm i n，56。C退火lm i n,72°C 延伸2m i n,进行30个循环，最后72"C延伸10m i n.检测结果为阳性的植 株。 实施例5 (1 ) SKP1烟草过表达植株的建立根据SKP1基因的序列，并参考pCAMBIA1302 T-DNA fragment的多克 隆位点，设计SKPl基因在植物中过表达的引物skplSLs和skplSLa，分别 在引物skplSLs和skplSLa的5 '端引入了 Bgl II和Spe I酶切位点(下划 线部分)SKP1 上 游 表 达 弓| 物 (skplSLs )-5' CGGCCAGATCTATGTCCTCCTCAAAGATG 3'SKP1 下 游 表 达 弓i 物 (skplSLa )-5' GCCGCACTAGTCTCAAATGCCCAAGCATT 3'以pMD18-SKPl质粒为模板，用引物skplSLs和skplSLa扩增待表达的 SKP1基因编码区(去掉终止密码子)片段，PCR扩增反应条件为95°C，2min; 94°C, 15sec， 50°C, 30sec， 72。C, 2min, 4个循环；94。C，15sec，68。C,30sec,72。C, 2min, 30个循环；72"C延伸10min。将PCR反应的产物在1%琼脂糖凝胶(含 0.5pg/ml溴化乙锭)中电泳，以DNAMarkIII做为分子量标准，电泳结束 后在302 nm波长的紫外灯下观察结果拍照并回从胶中收目的片段。分别用 Bgl II和Spe I酶双酶切回收纯化的SKP1基因目的片段和载体 pCAMBIA1302，经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，回收纯化目的片段，用T4 DNA连接酶将SKPl连接到双元载体pCAMBIA1302的花椰菜花叶病毒35S 强启动子下游和GFP完全编码区的上游，连接产物转化大肠杆菌TOP10并 用菌落PCR初步筛选阳性重组质粒，将PCR鉴定为阳性的克隆提取质粒并 送宝生物工程(大连)有限公司进行测序。将pCAMBIA-SKPl经冻融法导入根癌农杆菌LBA4404"gra6acfen^w mme/aC/e"sLBA4404)，经质粒提取酶切鉴定后，将转化的土壤农杆菌接种 到含卡那霉素的液体YEB培养基中28。C摇床培养17-20h。然后用此培养物 按叶盘法转化烟草:取上述土壤农杆菌培养物稀释到液体M S培养基中，取烟草无菌苗的幼嫩叶片剪成小块在该稀释液中浸5m i n，吸去多余菌液后, 放至含有2.0mg/L6苄基腺嘌呤、200-500m g/L羧苄青霉素、100mg/ L潮霉素和0.5m g/LIAA的固体MS培养基上,在14h白天、14h黑夜的 光周期和25。C条件下培养.约3周后,将生长至长1 c m以上的小苗转移到 含300m g/L羧苄青霉素、100m g/L卡那霉素和5m g/LIAA的固体MS 培养基上诱导生根.约2 3周后可见根的形成，从而得到再生完整植株.待这 些完整植株生长到大约5 c m时，移栽到花盆中,使之在温室中继续生长。 转基因苗的鉴定同实施例4的转基因植株的P C R分析。 实施例6SKP1在植物抗性中的作用检测将SKP1干扰的烟草苗、SKP1过表达的烟草苗和正常的苗一起种植在 温室内，在烟苗长到5-6叶时，摩擦接种烟草花叶病毒。TMV由本研究组在
普通烟(Nicotiana.Tabacum丄)上活体继代保存。取TMV繁殖寄主上较嫩 的病叶，以5倍体积0.05mol/L pH5.5磷酸缓冲液(含0.05mol/L KH2P04和 0.05mol/L Na2HP04)在研钵中研碎，用4层纱布过滤挤出汁液。加入少量 细石英砂，用毛笔蘸取汁液摩擦接种，尽量做到用力一致均匀。接毒后每 天观察，记录第一批病斑出现的时间和数目。结果为病斑全部产生后的统 计数。采用t检验法进行数据显著性分析。SKP1基因干扰的烟草植株在接毒84h后开始出现病斑，而野生型烟草 在接毒120h后开始出现病斑，SKP1基因过表达的烟草植株在接毒200小 时后才出现病斑。说明SKP1的沉默使得植株降低了抵抗病毒增殖和(或) 其在细胞间移动的能力，提早出现了过敏反应(坏死斑)，而SKP1的过表 达使得植株增强了抵抗病毒增殖和(或)其在细胞间移动的能力，使得过 敏反应(坏死斑)推迟出现。分别取8-10叶期的转基因和野生型烟草14棵，半叶法接种TMV，观 察病斑发展情况，测量病斑直径，计算平均值。结果野生型中枯斑平均直 径为5.9375mm，枯斑总面积占叶片总面积29.375%; SKP1干扰的转基因 苗中枯斑平均直径为7.1875mm，枯斑总面积占叶片总面积33.9375%。 (P <0.051检验后差异显著)，SKP1干扰的转基因苗中枯斑平均直径为 3.335mm,枯斑总面积占叶片总面积24.885%。此结果说明，有SKPl蛋白 表达的野生型烟草及SKP1蛋白过表达的烟草比不含此基因表达产物的 SKP1干扰烟草对TMV的复制有更强的抗性作用。因此，SKP1的正常表达， 对于维持植株的抗病性很重要。 序列表SEQUENCE LISTING <110〉中国科学院大连化学物理研究所<120〉烟草S期激酶蛋白l基因序列及其编码蛋白质序列和应用<130〉<160〉 2〈170> Patent In version 3.1〈210〉 1<211〉 653〈212〉 腿<213〉 枯斑三生烟草(Nicotiana tabacum var. samsun NN)<220〉〈221> CDS〈222〉 (73),. (537)〈223><400> 1gcattcact.c tctctctctc tctctctctc tc.tatctcaa aaaatctcaa ttctagggtt 60agggttacta eg atg tec tec tea aag atg ate gta ttg aag age teg gac 111 Met Ser Ser Ser Lys Met lie Val Leu Lvs Ser Ser Asp 1 5' lbggc gag act Uc gag gtg gag gaa gcg gtg get ttg gaa tct cag acg Glv Glu Thr Phe Glu Val Glu Glu Ala Val Ala Leu Glu Ser Gin Thr 15 20 25159ata aag cat atg att geia gat gat tgc gcc gac acc age ate ccc ctt 207lie lvs His Met lie Glu Asp Asp Cvs Ala Asp Thr Ser lie Pro Leu 303540 45cct aat gtg acc age aaa ate ttg get aag gtt ate gag tac tgc aag 255Pro Asn Val Thr Ser Lys lie leu Ala Lvs Val lie Glu Tyr Cvs Lvs50 5b 6bcgc cat gtt gat get acc aaa act gag gat aag get tct gag gal gag Arg His Val Asp Ala Thr Lvs Thr Glu Asp Lvs Ala Ser Glu Asp Ghi 65 70 75303ctt aag ggc ttt gat tct gat ttc gtt aaa gtt gac cag gcc acc eta Leu Lvs Glv Phe Asp Ser Asp Phe Val I_vs Val Asp Gin人la Thr Leu '80 85 90351Uc gat etc ate ttg get gcc aac tac ttg aac ate aag age ctg ctt Phe Asp Leu lie Leu Ala人la Asn Tvr Leu Asn lie Lvs Ser Leu Leu 95 100 105399 gat Asp 110Leu ThrCvsGinThr 115gtg Valget Ala序列表gac Aspatg Metatt lie 120Lysggg aag Gly LysThrcc3 Pro 125447lieaag li^5aat Asngac Aspttc act Phe Thrcc3 Pro MOGlu495Asn 150get Alatgg Trpgca Alatn gag Phe Glu 155537130145tgaacttt.aa atctcataat ct,ggggataa atttggaata tataatcgta tgaacaatct 597 tUgtgttag taaatatgtg agtseggtat UgcttUgg acccctgact ttgtta 653〈210〉 2〈211〉 155<2i2> PRT<213〉 枯斑三生烟草(Nicotiana tabacum var. samsun画)〈400〉 2Met Ser Ser Ser Lvs Met 1 5lie Val Leu Lvs Ser Ser Asp Glv Gu Thr lb 15Phe Glu Val Glu Glu Ala Val Ala Leu Glu Ser Gin Thr lie Lvs His 20 25 30Met lie Glu Asp Asp Cvs Ala Asp Thr Ser lie Pro Leu Pro Asn Val 35 40 45Thr Ser Lvs Jle Leu Ala Lvs Val lie Glu Tvr Cvs Lvs Arg His Val 50 55 6bAsp Ala Thr Lvs Thr Glu Asp Lvs Ala Ser Glu Asp Glu Leu Lvs Glv 65 70 75 80Phe Asp Ser Asp Phe Val Lvs Val Asp Gin Ala Thr Leu Phe Asp Leu 85 90 95lie Leu Ala Ala Asn Tvr Leu Asn lie Lvs Ser Leu Leu Asp Leu Thr 100 105 110Cvs Gin Thr Val Ala Asp Met lie Lvs Glv Us Thr Pro Glu Glu lie 115 120 125Arg Lys Thr Phe Asn lie Lvs Asn Asp Phe Thr Pro Glu Glu Glu Glu li30 lS5 140Glu Val Arg Arg Glu Asn Ala Trp Ala Phe Glu 145 150 15权利要求
1. 一种烟草S期激酶蛋白1基因序列，其特征在于具有序列表中SEQID NO.1碱基序列。
2. —种权利要求1所述的烟草S期激酶蛋白lcDNA基因序列的编码蛋白， 其特征在于具有序列表中SEQ IDN0.2编码的氨基酸序列。
3. —种权利要求1所述的烟草S期激酶蛋白1的应用，其特征在于应用 基因序列的壳寡糖诱导植物抗性反应，从而可将所述基因序列用于制备生 物农药。
全文摘要
本发明涉及S期激酶相关蛋白1(S-PHASE KINASE-ASSOCIATEDPROTEIN1，SKP1)；具体地说是真核生物(烟草)中普遍存在的一类蛋白，是泛素连接酶3SCF复合体的核心亚单位，与烟草的抗病毒活性相关，分子量为17527.78Da，等电点4.57，定位于细胞质，其Skp1结构域位于4-105位氨基酸。本发明对生物农药的应用具有明显指导作用；该基因的克隆对于揭示壳寡糖诱导植物抗性反应的分子信号通路很有价值，并在寡糖生物农药的应用方面具有重要的理论指导意义。
文档编号C12N15/54GK101210251SQ20061015582
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月29日 优先权日2006年12月29日
发明者张付云, 杜昱光, 白雪芳 申请人:中国科学院大连化学物理研究所