与bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员相互作用的新肽及其用途的制作方法

专利名称：与bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员相互作用的新肽及其用途的制作方法
与BCL-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员相互作用的新肽及其用途
本发明属于搜索和鉴定与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员相互作用 的新肽的领域。
本发明涉及筛选和鉴定那些新肽与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员 间蛋白质相互作用的调节剂的方法。通过这种筛选方法分离的调节剂可用 于调节细胞凋亡型和/或自M噬型程序性细胞死亡。这些调节剂在治疗癌 症过程中给患者施用。
本发明涉;5l每一个都能与Bd-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员相互作用 的五个肽基序并涉及其在癌症患者中引起程序性细胞死亡的用途。
在一个方面，程序性细胞死亡包括细胞凋亡，在另一个方面包括自体 吞噬死亡。细胞凋亡是更熟知的现象。这种类型的细胞死亡包括形态学变 化，如核凝集和DNA片段化，也包括生化现象，如胱天蛋白酶的活化(其 然后降解细胞的关键结构成分从而引起细胞解装配和死亡)。细胞凋亡过 程的调节是复杂的并包括多个胞内信号通路的激活或抑制。自体吞噬死亡 是第二位的不太熟知的程序性细胞死亡机制，在细胞水平上，自体吞噬可 概括为三个阶段起始自体吞噬泡(自嗟体)的形成、自逸体成熟为降解 性泡然后其与溶酶体融合。因此自M噬死亡包括溶酶体降解过程，其特 征在于自体吞嗟泡的累积并且不依赖胱天蛋白酶型调节通路.
保持细胞存活或使其程序性死亡使得尤其是BC1-2蛋白质家族参与的 主要信号通路的调节成为必需.
BCL-2蛋白质家族分为三个主要类别。抗细胞凋亡蛋白质(如Bcl-2、 Bc1-Xl和Bc1-W)在其四个BH结构域中具有高度的同源性。促细胞凋亡 蛋白质分成两类 一类是多结构域蛋白质(如BAX和BAK)，另一类是 促细胞凋亡蛋白质(如BID、 NOXA、 PUMA、 BIK、 BIM和BAD)，其
特征在于存在单一同源结构域-BH3基序(Cory和Adams， The Bcl-2 family: regulators of the cellular life-or-death switch Nature reviews,第12 巻，2002年9月)。
BH3基序为两亲性a螺旋区域，其在Bcl-2蛋白质家族中的序列同一 性相对较4氐。此外，蛋白质中需要存在BH3基序以允许与Bcl-2蛋白质家 族抗细胞凋亡成员相互作用。实际上，Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员的 活性受所述家族的促细胞凋亡基因产物调节，两种蛋白质组装成异二聚体。 当处于那种状态的时候，Bcl-2蛋白质家族的抗细胞凋亡成员是无活性的并 且因此不再具有其抗细胞凋亡活性。此外，BH3基序与Bcl-2蛋白质家族 抗细胞凋亡成员的特异相互作用可由调节剂修饰从而以特定方式引起程序 性细胞死亡。
因此本发明计划筛选和鉴定与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员相互 作用的新肽，从而用这些新肽筛选和鉴定能修饰那些相互作用的化合物以 获得有效用于细胞凋亡下调所涉及病理(尤其是癌症)真正候选药剂.
最开始双杂交系统由两种重组蛋白质在酵母中的检测组成，第一种蛋 白质(称作"饰")为含有与蛋白质A上游结合的DNA结合结构域(或 BD)的融合蛋白。第二种蛋白质也是融合蛋白，通常称作"猎物"，其含 有与蛋白质B结合的激活结构域(或AD)。通常使用的结合结构域和激 活结构域为Gal4或大肠杆菌(五.CWi') Lex A的结构域。蛋白质A和B 分别为Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员和从cDNA库中获得的基序。蛋
上游存在的结合位点(或BS)并且确保该报告基因转录的功能性结^域 (BD曙AD)。
然而，这种常规的双杂交系统具有其局限性.例如，众所周知，此类
双杂交系统获得的假阳性尤其频繁并且证明的是功能相互作用而非结构相 互作用。
国际专利申请WO 99/42612或专利US 6,187,535中描述了允许假阳性
和/或假阴性最小化的更有效技术并且使用含"饰"和"猎物"多肽的重组 单倍体酵母。这个系统允许以比本领域所用的其它常规方法更精确、更高
重复性和更灵敏的方式用单个的"饵"检测更大数量的"猎物"。
使用双杂交系统，发明者已经确定了 Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成 员和下列具有本发明SEQ ID NO.l至SEQ ID NO.5的M酸序列的肽间 存在结构相互作用.那些配偶体间的这种蛋白质相互作用类似于Bcl-2蛋 白质家族抗细胞凋亡和促细胞凋亡配偶体间的细胞凋亡现象调节中存在的 相互作用。
已经在本发明中通过双杂交系统鉴定了具有肽序列SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5的最初肽。 这些肽中的每一个都能以高度特异的方式与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡 成员相互作用.这种相互作用的特异性实际上与该所选肽的序列、三维结 构和/或原始基序的螺旋性相关。
此外，这些肽对应于与Bcl-2、 Bcl-Xt和/或Bcl-W相互作用的精确结 构域并具有允许形成同型或异型二聚体的典型结构标准。
肽基序nh2誦XXXXXXXXLXXXXDXXXXXXXXXX-cooh(SEQ ID NO. 6)M根据本发明的肽序列SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 5的共有序列， 其中X代表任意氨基酸.这个共有序列类似于Bcl-2蛋白质家族促细胞凋 亡成员中存在的BH3基序的序列。
根据本发明的肽的大小确实使它们成为理想候选者用于开发允许高效 筛选能调节那些肽与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员间相互作用的化合 物的测试法。在文献中可以找到大量筛选蛋白质-蛋白质相互作用的测试法 但是它们经常在敏感性和高通量可行性方面具有局限性.通常使用的方法 必需使用与高通量筛选十分不相容的复杂工具(融合蛋白、重组蛋白质等 等)。它们非常频繁地产生高水平背景噪音并且从定量角度来说可信度低 它们提供减少的阅读窗口不能够最佳筛选所测试化合物。
作为已经可利用方法的备选方法，基于荧光偏振的高效筛选测试法已 经在本发明中使用(Owicki等人，Journal of Biomolecular Screening, 5，
2000， 297-306)。这种技术允许例如测量荧光团标记的配体和受体间的相 互作用。原理包括测量与游离配体发射的偏4^目比结合其受体时配体发射 的荧光偏振增加。游离配体的荧光偏振取决于其分子量，并且分子量越高 荧光偏振越大。因此，当用高分子量、具有高水平固有荧光偏振的配体进 行测试时很难可信地评价游离配体和结合配体的荧光偏振差异。另一方面， 使用最小分子量的配体强化了差异并因而使方法的精确度提高。因此可以 更好地评价化合物的真正活性并且开展高通量筛选。
本发明涉及与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员相互作用的肽。这个 肽含有下列氨基^列和那些M^列的功能性变体
a) MATVIHNPLKALGDQFYKEAIEHC (SEQ ID NO.l);
b) VMTQEVGQLLQDMGDDVYQQYRSL (SEQ ID NO.2)
c) RLKHSCLLALKRAADLLGQRSSST (SEQ ID NO.3);
d) DMWDTRIAKLRVSADSFVRQQEA (SEQ ID NO.4);
e) VATRRLSGFLRTLADRLEGTKELL (SEQ ID NO.5);
f) XXXXXXXXLXXXXDXXXXXXXXXX (SEQ ID NO.6); "^J^酸序列"理解为从天然环境中分离的肽序列，尤其是经分离的、
化学合成的和/或纯化的，以及(如果可能)通过基因工程修饰的序列。
"功能性变体"理解为上述肽的M酸序列，其包含保守的取代或保 守的点突变并且具有与序列SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 5分别编码的肽 基;M目同的特性，或者也就是说与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员相互 作用的能力。絲,列SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 5的保守取代或突 变为例如下列取代或突变丙氨酸取代甘氨酸(G--A)、亮氨酸取代缬氨 酸(V—L)、谷氨酸取代天冬氨酸(D-E )、谷胺酰胺取代天冬酰胺(N-Q)、
亮氨酸(L-M)、异亮氨酸取代缬氨酸(V-1)和组氨酸取代谷胺酰胺 (Q—H)。
本发明也涉及编码序列SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 5的肽的核^4 列。分别对应醋列SEQIDNO.l、 SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3、 SEQ
'K)、亮氨酸取代酪氨酸(Y—L)、甲硫氨酸取代
ID NO. 4和SEQ ID NO. 5的这些核苷酸序列如下
a) atggcgactgtcattcacaaccccctgaaagcgctcggggaccagttctacaaggaa gccattgagcactgc (SEQ ID NO.7);
taccggtcactt (SEQ ID NO.8);
c) agacttaaacattcctgcctgctggctctgaagagagcagcggatctcctaggacagcgc tcaagctctact (SEQ ID NO.9);
d) gatatgtgggacactcgtatagccaaactccgagtgtctgctgacagctttgtgagacag caggaggca (SEQ ID NO.10);
e) gttgctacaagacgattaagtggcttcctgaggacacttgcagaccggctggagggcacc aaagaactgctt (SEQ ID NO.ll)。
本发明的这些核酸序列可通it^M目应M酸序列及其变体开始的遗传 密码的途径获得。
那些核酸序列的变体尤其是
-能在严谨务ff下与核酸序列SEQ ID NO. 7至SEQ ID NO. 11或与其 互补的序列杂交以及编码具有与分别具有序列SEQ ID NO. 1至SEQ ID N0.5的肽基4^目同特性的多肽的序列，或者
-与>^类中分离的序列SEQ ID NO. 7至SEQ ID NO. 11同源的哺乳 动物物种的序列。
"严谨务ff"理解为在大约65匸，例如在6 x SSC溶液、0.5 % SDS、 5 x Denhard，s溶液和100 非特异载体DNA或任何其它相等离子强度溶 液中并且于65C在至多0.2 x SSC和0.1 。/。SDS或任何其它相等离子强度溶 液中洗涤之后允许两个单链DNA序列特异杂交的条件。定义严谨条件的 M取决于50 %配对链分离的温度(Tm)。对含有多于30个碱基的序列 来说，Tm通过如下乂》式定义Tm = 81.5+ 0.41(%G + C) +16.6 Log(阳离 子浓度)-0.63(o/。甲酰胺)-(600/4^数量)。对长度低于30个碱基的序列来 说，Tm通过如下公式定义Tm = 4(G+C)+2(A+T)。因此严谨条件可由本 领域技术人员根据序列大小、GC含量和任何其它参数调整，尤其根据
Sambrook等人，2001所述的方法调整(Molecular Cloning: A laboratory Manual,第三版，Cold Spring Harbor, laboratory press,冷泉港，纽约)。 "与序列SEQ ID NO. 7至SEQ ID NO. 11同源的哺乳动物物种的序
尤其是灵长i、大鼠和小鼠中的特性基本相同的各;多肽的序列。两种同
源序列在功能性区域内的同 一性百分比通常高于80 % ，优选地高于90 % 。 本发明也涉及含有根据本发明要求专利保护的核断列SEQ ID NO. 7至SEQ ID NO. 11的重组栽体。栽体理解为允许向宿主细胞中引入核酸
载体。
此种栽体为例如质粒、粘粒、细菌人工染色体或噬菌体，其含有具有 M酸序列SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 5的Jlk^达所必需的序列.
根据本发明的重组栽体优选地含有在宿主细胞中表达具有序列SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. S的肽所必需的序列。这些序列尤其是在宿主细 胞中转录和翻译的启动子序列还有终止子序列。重组载体也可含有编码分 泌信号的序列，其允许将翻译的蛋白质释放到胞外环境中。
本发明也涉及用本发明的重组栽体转化的宿主细胞。在特别的实施方 案中，那些宿主细胞为细菌细胞(如大肠杆菌和链球菌)或真核细胞(如 酵母细胞、丝状真菌细胞、昆虫细胞并且优选地为哺乳动物细胞).
用含有本发明核酸序列的重组栽体转化适当宿主细胞允许表达各个要 求专利保护的肽SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 5。之后可以用M域技术 人员已知并在先有技术中大量描述的各种方法纯化在那些宿主细胞中表达 的蛋白质。需要提到的是，例如通过用多危酸铵沉淀纯化、通过大小排阻层 析纯化和优选地通过亲和层析纯化，
具有^J^醋列SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5的肽也可由N6osystem化学定制合成。通过借 助于"Applied Biosystems 430A"肽合成仪用Boc/苯甲基策略在固体支持 物上合成进行肽序列SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 5及其功能性变体的化
学合成。合成基于在树脂上组装所需序列以及随后的N端和C端官能团的 去保护。以Boc/苯甲基策略为例，必需在肽合成过程中引入氨基酸 Boc-L-Lys(Fmoc)-OH。完整序列组装完毕之后，将氨基官能团去保护并在 存在强酸条件下从树脂上切下肽。
本发明也涉及药物组合物，其包含与一种或更多种可药用赋形剂组合 的、具有絲紗列SEQIDNO. 1、 SEQIDN0.2、 SEQIDN0.3、 SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5的肽作为有效成分。
在本发明中，药物组合物的"赋形剂"理解为任何保证有效成分转运 到待治疗患者的内部血管中的药剂。"有效成分"理解为赋予药物組合物 的药效特性或治疗特性的任何对物质。
通过实例且意味着任何限制的方式提到的非毒性、可药用赋形剂有稀 释剂、溶剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、黏合剂、膨胀剂、崩解 剂、延緩剂、润滑剂、吸光剂、悬浮剂、着色剂或调味剂。
本发明不仅涉及如此考虑并如上定义的药物组合物，还涉及该组合物 在引起程序性细胞死亡的方法中的用途，所述方法包括给患者(尤其是癌 症患者)施用有效量的含本发明肽之一的药物组合物。
本发明也涉及鉴定根据本发明的肽与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成 员间相互作用的调节剂的方法，其包括下列步骤
a) 使所述肽与所述Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员接触；
b) 加入测试化合物；和
c) 测量测试化合物作为肽与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员间蛋白 质相互作用的调节剂的活性，然后与不存在测试化合物务降下的所 述测量值比较.
有利地，鉴定相互作用的调节剂的方法包括下列步骤
a) 荧光标记根据权利要求1的肽；
b) 在存在测试化合物条件下孵育所述肽；
c) 加入Bcl-2蛋白质家族的抗细胞凋亡成员；
d) 测量荧光偏振；e)比较含或不含测试化合物的测量值。 "调节剂"理解为任何能增强、阻止或至少限制特异活性(如蛋白质-蛋白质相互作用、酶促活性或结合细胞受体)的化合物。根据本发明，调 节剂为配偶体(为具有絲,列SEQIDN0.1至SEQIDN0.5的肽) 与BcI-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员间蛋白质相互作用的抑制剂或真正的 激活剂。
本发明也涉及鉴定本发明肽之一的肽与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡 成员间相互作用的抑制剂的方法，其与不存在调节剂条件下这种相互作用 组成的对照相比能降低荧光偏振。
本发明也涉及鉴定本发明肽之一的肽与Bd-2蛋白质家族抗细胞凋亡 成员间相互作用的激活剂的方法，其与不存在调节剂条件下这种相互作用 组成的对照相比能增强荧光偏振。
荧光配体(即荧光肽基序SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 5)在与Bcl-2 蛋白质家族抗细胞凋亡配偶体结合后具有低于相应游离配体的旋转常数， 作为结果，结合的配体发射的荧光变成偏振的，因此，观察到与游离配体 相比结合的配体发射的荧光偏振的增加.
在优选的实施方案中，用于根据本发明的筛选和鉴定方法中的荧光探 针为Bodipy、 Oregon Green,更优选的为荧光素。
更特別地，在本发明的筛选和鉴定过程中作为相互作用配偶体使用的 Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员可为蛋白质Bcl-2、 Bc1-Xl或Bcl-W.
BcI-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员有利地为融合蛋白。"融合蛋白"理 解为是指蛋白质Bcl-2、 Bc1-Xl或Bcl-W的结构域与蛋白质(如GST，谷 胱甘肽S转移酶)的结构域的融合。
本发明也涉及药物组合物，其包含与一种或更多种可药用赋形剂组合 的、根据本发明的鉴定调节剂的方法鉴定的至少一种调节剂、激活剂或抑 制剂作为该组合物的有效成分。
本发明也涉及通过给癌症患者施用有效量上述组合物引起细胞凋亡型
程序性细胞死亡的方法。
上述药物组合物适合通过作用于细胞凋亡型程序性细胞死亡和/或自 体吞噬型程序性细胞死亡用于治疗癌症。
根据本发明的组合物为适于口腔、肠胃外、鼻、经皮肤、直肠、经舌、
眼或呼吸施用的形式，尤其为片剂、糖衣丸、舌下片剂、药嚢、paquets、 胶囊剂、glossettes、锭剂、栓剂、乳骨剂、软骨剂、皮肤用凝胶和可饮用 或可注射的安瓿剂。
本发明由下列图和实施例不限制性地描述
-

图1.与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员相互作用的Cerd4肽的氨 基紗列SEQIDNO.l,
-图2.与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员相互作用的Kiaa 1578肽的 ^J^紗列SEQ ID NO. 2.
國图3.与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员相互作用的Genematch肽 的^J^^列SEQ ID NO. 3.
画图4.与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员相互作用的Loc 51569肽的 氨基紗列SEQ ID NO. 4.
-图5.与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员相互作用的Mina53肽的氨 基財列SEQ ID NO. 5。
-图6.根据本发明的肽序列SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 5的共有基 序SEQ ID NO. 6。
-图7.用荧光偏振测定竟争肽的Ki,其中所述的竟争肽具有与促细胞 凋亡的Bak肽和抗细胞凋亡成员Bcl-XL间相互作用相关的根据本发明的氨 基醋列SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 5 。
國图8.絲財列SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 5及其各自核醋列 SEQ ID NO. 7至SEQ ID NO. 11的汇总表。
实施例1:通过双杂交系统鉴定图l-5所述的肽
用Legrain等人(Nature Genetics, 1997，第16巻，277-282) (US
6,187,535)所述的联合方案在酵母中通过双杂交技术筛选了三种人cDNA 库(胎盘、脑、细胞系CEMC7)。
1) 制备"饵"和"猎物"
a) 所用的"饵"为
画与LexA DNA结合结构域融合的Bcl-XL (登录号Z23115)的C 端截短物(1-209);
-与LexA DNA结合结构域融合的Bcl-2 (登录号XM—008738 )的
C端截短物(1-211)' 在酿酒酵母(5"flcc/wfYwi戸s c靴v油g)菌林L40Agal4 (MATa ade2， trpl-卯l， leu2隱3， 112， lys2-801 ， his3A200 ， LYS2(lexAop)4-fflS3, ura3-52::URA3(lexA叩)8-LacZ， GAL4::KanR)中表达这些倂，并于30" 在缺少色氨酸(DO-Trp)的合成培养基中预培养到光密度OD6oo,为 0.1-0,5(包括)。将50毫升预培M的稀释液(OD600nm = 0.006)在301C赙 育过夜。
b) 通过转化获得酿酒酵母菌林YHGX13 (MTAa Gal4A Gal80A ade2-101::KanR ， his3 ， leu2隱3-112 ， trpl-卯l , ura3-52 URA3::UASGALl-LacZ， Met)，之后在缺少亮氨酸(DO-Leu )的培养 基上选择，其中所述的菌林含有与Gal4转录激活结构域融合表达的cDNA 库的质粒.
2) 结合
用2的"斜"/ "猎物"比例进行结合。
将一定数量的在步骤l)a)获得的酵母"斜"细胞(对应于OD咖，的
50单位)与步骤l)b)中获得的酵母"猎物"混合。离心之后将沉淀重悬于 YPGlu培养基中，涂布到YPGhi培养板上并在301C孵育4小时30分钟。 在DO-Leu-Tip-His培养基中选择含能彼此相互作用的和"猎物" 的结合酵母亮氨酸和色氨酸的缺少使得维持选择压力只允许含两种类型 质粒("辨"/ "猎物")的酵母生长成为可能；培养基中缺少组氨酸4吏得
选择含能彼此相互作用的"辨，，质粒和"猎物"质粒的结合酵母成为可能； 所述的互补使得激活作为报告基因的HIS3基因(编码参与组氨酸生物合 成的酶)成为可能。
3) 鉴定阳性克隆
用"猎物"载体的特异引物从菌落的粗裂解液开始通过PCR扩增根据 段落2)所述的结合方法选择的酵母菌落的"猎物"片段，其中所述的引物 为
ABS1 5，- GCTTTGGAATCACTACAGG-3， (SEQ ID NO. 12); ABS2 5，画CACGATGCACGTTGAAGTG-3， (SEQ ID NO. 13), 然后进行PCR产物测序并通过用数据库比较鉴定获得的序列。
4) 鉴定图l-5所述的肽
对每一个所测试的"辨"片段来说，双杂交系统允许鉴定大量"猎物" 片段。这种鉴定通过用软件程序(如Blastwun，可从华盛顿大学网站获得， http:〃bioweb.pasteur.fr/seqana]/interfaces/blastwu.html) t匕较声斤选"猎物" 的序列进行。
实施例2: j^it实施例1获得的肽与Bcl-2、 Bc1-Xl和/或Bcl-W的相互作 用
1)用荧光偏振测定Ki
用荧光偏振测定Ki包括测量分别具有M酸序列SEQ ID NO. 1至 SEQ ID NO. 5的竟争肽对促细胞凋亡Bak肽和Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋 亡成员(如Bcl-Xj间的相互作用的影响。
以所述顺序混合下列试剂 -终浓度1 nM-100 /*M的竟争肽；
-终浓度15 nM的荧光肽配体(Bak BH3羧基荧光素)； -终浓度100 nM的Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员(Bcl-XL)。
这些试剂溶解于相互作用緩冲液中(Na2HP04 20 mM pH 7.4， EDTA 1 mM， NaCl 50 mM和pluronic acid F-68 0.05% )。
然后在室温将混合物孵育30分钟并在Fusion仪器上(Packard)(在485 nm激发并在530 nm读数)测定荧光偏振。以mP (荧光偏振的单位)表 示数值。
这些荧光偏振分析证明具有M酸序列SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 5的肽为Bak和Bcl-XL间^bf目互作用的竟争肽。这些荧光偏振测试过程中 获得的Ki值如下
Bcl-XiTBak/SEQ ID NO. 1 Ki=9 Mm
Bcl-XiTBak/SEQ ID NO. 2 Ki=32岸
Bcl-XL/Bak/SEQ ID NO. 3 Ki=l /*M
Bcl-XL/Bak/SEQ ID NO. 4 Ki=8 /*M
Bcl-XL/Bak/SE(J ID NO. 5 Ki=20岸
2)用荧光偏振测定各个突变肽基序(L—A)的Ki
用荧光偏振测定Ki包括测量已经从亮氨酸突变成丙氨酸(L-A)的 肽SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 5对促细胞揭亡Bak肽和Bcl-2蛋白质家 族抗细胞凋亡成员(如Bc1-Xl)间的相互作用的影响。
突变形式(L一A)的肽序列SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 5如下
MATVIHNPAKALGDQFYKEAIEHC (SEQ ID NO. 14);
VMTQEVGQLAQDMGDDVYQQYRSL (SEQ ID NO. 15);
RLKHSCLLAAKRAADLLGQRSSST (SEQ ID NO. 16);
DMWDTRIAKARVSADSFVRQQEA (SEQ ID NO. 17);
VATRRLSGFARTLADRLEGTKELL (SEQ ID NO. 18)。
用荧光偏振测定Ki的方案与上述方案相同。
比较荧光偏振分析的结果表明与根据本发明的肽SEQ ID NO. 1至 SEQ ID NO. 5相比突变体(L—A)肽SEQ ID NO. 14至SEQ ID NO. 18 在促细胞凋亡Bak肽和Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员(如BcI-Xl)间
的似目互作用中丧失了的竟争作用。
实施例3:能抑制Bcl-2和/或Bcl-XL与实施例1获得的肽之间相互作用的 化合物的筛选检测
以10微克/毫升的终浓度将所测试化合物分散于384孑L板上(Corning Flat Bottom )。 一个孔用等量不含测试化合物的緩沖^/溶剂填充作为对照。 将实施例1获得的荧光素标记肽加入到孔中以获得1-100 nM的终浓度。然 后加入融合蛋白GST-Bcl-XL、 GST-BcK2或者GST-Bcl-W以使得在含 Na2HP04 20 mM pH 7.4、 EDTA 1 mM、 NaCl 50 mM和pluronic acid F-68 0.05%的緩冲液中终浓度为0.1-1 pM。然后通过En Vision仪器(Packard Perkin-Elmer)测量荧光偏振。与不含测试化合物(对照孔)获得的荧光 偏糾目比，用测试化合物进行的测试中记录到荧光偏振显著降低，得出化 合物具有抑制活性的结论。相反地，与对照相比，用测试化合物的测试中 荧光偏振的显著增加，得出化合物具有激活剂活性的结论。
权利要求
1.与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员相互作用的肽，其特征在于含有选自下列的氨基酸序列及所述氨基酸序列的功能性变体a)MATVIHNPLKALGDQFYKEAIEHC(SEQ ID NO.1)；b)VMTQEVGQLLQDMGDDVYQQYRSL(SEQ ID NO.2)c)RLKHSCLLALKRAADLLGQRSSST(SEQ ID NO.3)；d)DMWDTRIAKLRVSADSFVRQQEA(SEQ ID NO.4)；e)VATRRLSGFLRTLADRLEGTKELL(SEQ ID NO.5)；f)XXXXXXXXLXXXXDXXXXXXXXXX(SEQ ID NO.6)；
2. 核酸序列，其编码根据权利要求1的肽。
3. 根据权利要求2的核酸序列，其特征在于含有选自下列的核苷^列a) atggcgactgtcattcacaaccccctgaaagcgctcggggaccagttctacaaggaa gccattgagcactgc (SEQ ID NO.7);taccggtcactt (SEQ ID NO.8);tcaagctctact (SEQ ID NO.9);caggaggca (SEQ ID NO.10);e)aaagaactgctt (SEQ ID NO.ll)。
4. 重组栽体，其特征在于含有根据权利要求2或3中任一项所迷的核 醋列之一。
5. 根据权利要求4的重组栽体，其特征在于载体为含有表达根据权利 要求l的肽所必需序列的质粒、粘粒、细菌人工染色体或噬菌体。
6. 根据权利要求5的重组栽体，其特征在于表达根据权利要求1的肽 所必需的序列含有转录和翻译的启动子序列。
7. 宿主细胞，其特征在于其已经用权利要求4-6中任一项所述的重组 载体转化。
8. 才艮据权利要求7的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为细菌或真 核细胞。
9. 药物组合物，其包含与一种或更多种可药用赋形剂组合的、才艮据权 利要求1的肽作为有效成分.
10. 引起程序性细胞死亡的方法，其包括给癌症患者施用有效量的根 据权利要求9的药物组合物。
11. 鉴定根据权利要求l的肽与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员间相 互作用的调节剂的方法，其特征在于其包括下列步骤a) 使所述肽与所述Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员接触；b) 加入测试化合物；和c) 测量测试化合物作为肽与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员间蛋白 质相互作用的调节剂的活性，然后与不存在测试化合物条件下的所述测量 值比较。
12. 鉴定根据权利要求ll的相互作用调节剂的方法，其特征在于其包 括下列步骤a) 荧光标记根据权利要求1的肽；b) 在存在测试化合物条件下孵育所述肽；c) 加入BcI-2蛋白质家族的抗细胞凋亡成员；d) 测量荧光偏振；e) 比较含或不含测试化合物的测量值.
13. 才艮据权利要求12的方法，其特征在于肽与Bcl-2蛋白质家族抗细 胞凋亡成员间相互作用的调节剂为增加荧光偏振的激活剂.
14. 根据权利要求12的方法，其特征在于肽与Bcl-2蛋白质家族抗细 胞凋亡成员间相互作用的调节剂为降低荧光偏振的抑制剂。
15. 根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其特征在于荧光探针为荧光素。
16. 根据权利要求11-15中任一项所述的方法，其特征在于Bcl-2蛋白 质家族抗细胞凋亡成员为蛋白质Bcl-2、 Bc1-Xl或Bcl-W。
17. 药物组合物，其包含与一种或更多种可药用赋形剂组合的、用根 据权利要求11-16中任一项所述鉴定调节剂的方法获得的调节剂作为有效 成分。
18. 引起程序性细胞死亡的方法，其包括给癌症患者施用有效量的根 据权利要求17所述的药物组合物。
19. 根据权利要求9或17任一项所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
全文摘要
本发明涉及通过双杂交系统研究和鉴定与BCL-2蛋白质家族的抗细胞凋亡成员相互作用的新肽。更具体而言，本发明涉及筛选和鉴定所述新肽与Bcl-2蛋白质家族抗细胞凋亡成员间蛋白质相互作用的调节剂的方法。可给癌症患者施用基于该方法鉴定的调节剂以诱导细胞凋亡型和/或自体吞噬型程序性细胞死亡。
文档编号C12N15/63GK101111517SQ200680003805
公开日2008年1月23日 申请日期2006年1月31日 优先权日2005年2月1日
发明者J·希克曼, J-C·雷恩, O·热内斯特 申请人:瑟维尔实验室;哈伯里健尼克斯公司