新的具有杀虫活性的细菌蛋白质的制作方法

专利名称：新的具有杀虫活性的细菌蛋白质的制作方法
新的具有杀虫活性的细菌蛋白质 发明领域
本发明涉及害虫控制、特别是昆虫控制领域，提供了编码命名为ISLP 蛋白质的杀虫蛋白质其毒性片段或变体的重组DNA序列，其有效用于保护 生物体不受害虫损伤，如保护植物不被昆虫损伤。还提供了含有编码本发 明的ISLP蛋白质的核酸分子的植物，及使用这些核酸序列来减少害虫如昆 虫对于植物的危害的方法和手段。
背景技术：
使用细菌生物杀虫剂如苏云金芽孢杆菌(5fl"7/附幼wW"g/e附/s, Bt) 是农业及其他领域(即疾病载体)用于昆虫控制的可行选择，这将会以经 济上可持续和环境上友好的方式增加作物产量。Bt的Cry蛋白质是高度特 异性的，对于人类、脊推动物和植物无害，并且是可完全生物降解的，所 以不会在环境中累积残留的毒性产物(Schnepf等，1998)。迄今为止超过 200种c/j基因序列已经被确定并分类成44个家族和不同的亚类(Crickmore 等，1998， 2005)。此外，Bt生产许多可能对毒力有贡献的胞外化合物， 如磷脂酶、蛋白酶、几丁质酶及其他毒素如p-外毒素或VIP蛋白质(Schnepf 等，1998)。
尽管过去十年来进行了广泛研究，但只有少数的细菌杀昆虫毒素大规 模地用于最具破坏性虫害的生物害虫防治应用，例如那些使用Bt植物的应用。
S层是蛋白质原性晶格排列的有序结构，覆盖在许多古细菌和真细菌 的表面(Beveridge等，1997; Sara和Sleytr， 2000)，并构成高达总细胞 蛋白质的15%。 S层蛋白质的功能还没有被精确地说明，但是认为这些蛋白质参与细胞完整性和形状的维持。因为它们是最外层的细胞被膜组分，
还有人假设其可能参与与环境间的大分子交换(Beveridge等，1997)。在 某些革兰氏阴性致病细菌中，它们已经与毒力和补体介导的杀伤抗性相牵 连(Sara和SLeytr， 2000; Pei和Blaser, 19卯)。据描述在蜡状芽孢杆菌 中，S层能促进和人类白细胞及与宿主间的相互作用，促成了 致病性(Kotiranta等，1998)。认为在炭疽芽孢杆菌(及fl"^,"c&)中， S层和荚膜可能协同地和宿主相互作用(Mignot等，2002)。
已描述了炭疽芽孢杆菌中两种不同的S层蛋白质(SAP和EA1 X Mignot 等，2002)。这些蛋白质的存在并非杆菌正常荚膜化所必需的(Mesnage 等，1998)。这些蛋白质以生长阶段依赖性的方式陆续出现，SAP的合成 在EA1合成之前(Mignot等，2002 )。描述了苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(丑. //rwn'wg/e船/51 gfl〃er/fl)的S层蛋白质SlpA， 它与炭疽芽孢杆菌的SAP 蛋白质类似。在苏云金芽孢杆菌幕虫亚种(凡幼MnVigiews/s sti6sp./ m'ri附附) 中描述了S层CTC蛋白质(GenBank登录号AAR23791 )，此蛋白质和炭疽 芽孢杆菌的EA1类似(Sun等，2001 ) 。 CTC分子大小为100 kDa,并在生 长的芽孢形成期能形成类芽孢体。
芽孢杆菌菌林的晶体/芽孢混合物时，存在120 kDa的蛋白质。发现溶解、 离心并透析之后获得的此晶体/芽孢混合物的上清液能延长用传染性伯氏 痴原虫(7Vflw附0(/i'w附Z^rg/ie/)血才羊注射的小鼠的存活。该120 kDa蛋白质 的N端序列(15个氨基酸)显示出和苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种S层蛋白质N 端100%的同源性(Mesimge等，1998报道)。未提供此蛋白质编码基因的 核苷酸序列，但据说编码821个氨基酸残基，推断具有87.5kDa的分子量。 在此文献中未测定分离或纯化的蛋白质或生产此蛋白质的重组宿主针对痴 原虫感染的功效。并且，此文章中没有保藏或具体描述从中分离这种晶体/ 芽孢混合物的菌林。
发明概述本发明提供了分离的杀虫ISLP蛋白质，其特征在于
a) 对于一些害虫具有特异性杀虫活性，而对于其他害虫则没有，且
b) 与细菌S层蛋白质具有至少50。/o的序列同一性，以及这样的蛋白质 其与SEQ ID NO: 2的蛋白质或其毒性片段具有至少50%的序列同一性，且 具有大约50到大约120 kDa的分子量。
本文还提供了分离的杀虫ISLP蛋白质，其特征在于
a) 对于一些昆虫具特异性杀昆虫活性，而对于其他昆虫则没有，
b) 与细菌S层蛋白质具有至少70。/。的序列同一性，
e)大约50到大约120kDa的分子量，以及这样的蛋白质其与SEQID NO: 2的蛋白质或其毒性片段具有至少75%的序列同一性，且具有大约50 到大约120 kDa的分子量。
根据本发明还提供了如上文所定义的ISLP杀虫蛋白质，含有SEQ ID NO: 2中始于第1位氨基酸和第31位氨基酸之间的氨基酸止于第863位氨基 酸的氨基酸序列，或者含有SEQ ID NO: 2中始于第1位氨基酸和第531位氨 基酸之间的氨基酸止于第863位氨基酸的氨基酸序列，例如含有SEQ ID NO: 2氨基酸序列的蛋白质。
本文还包括分离的编码任一上述ISLP蛋白质的DNA序列及嵌合基因， 所述嵌合基因包含a)含有这样的DNA的编码序列，及b)允许在植物细胞 中表达的启动子。在一实施方案中，这样的嵌合基因含有的编码序列是经 优化的合成DNA序列，以便在宿主植物特别是玉米、棉花、大豆、稻、油 菜、花椰菜及甘蓝中表达。
本文还提供了含有此类上述嵌合基因的植物转化栽体。
在本发明另 一实施方案中，提供了含有任一上述嵌合基因的转基因植 物、种子或植物细胞，特别是玉米、棉花、大豆、稻、油菜、花椰菜及甘 蓝的植物、种子或细胞。
虫如昆虫害虫导致的损伤的方法，包括在所述植物的细胞中表达任一上述 嵌合基因的步骤；还有保护植物对抗以所述植物所属的植物物种为食的植物害虫例如昆虫害虫导致的损伤的方法，包括以任 一 上述嵌合基因转化植 物细胞，将所述细胞再生为植物，和获得含有任一这类嵌合基因的所述植 物的后代或繁殖材料例如种子的步骤。
本发明还提供了用于杀死害虫的方法，包括用任一上述ISLP蛋白质接 触所述害虫，特别是这样的害虫是昆虫类害虫的时候；以及保护田间植物 对抗害虫如昆虫的方法，包括对田间植物应用任一上述ISLP蛋白质，或 者以含有此类蛋白质的杀虫组合物的形式，或者以表达所述蛋白质的重组 生物体的形式，特别地，其中所述的生物体是表达此类蛋白质的转基因植 物。
本文还提供了编码任一上述ISLP蛋白质或其毒性片段的任一DNA、或 任一上述嵌合基因，或任一上述ISLP蛋白质在控制或杀死害虫如昆虫害虫 中的用途。
本发明实施方案的详细描述
本发明提供了用于减轻害虫特别是昆虫害虫如鞘翅目(CW^/^ni/i) 或鳞翅目(/wVfe/^m )虫害所导致的植物损伤的方法和手段。本发明还 提供了与从前描述的核酸序列和蛋白质截然不同的新的核酸序列和蛋白 质。这些核酸和蛋白质能用于控制害虫如昆虫害虫，例如通过在植物或植 物细胞中整合并表达至少一种这些新核苷酸序列，或者通过用含有这些核 酸分子编码的毒素的组合物来外部处理植物或植物部分。
本发明提供了新的来自于细菌菌林的杀虫毒素，及其在控制害虫例如 昆虫中的用途。
根据本发明，"核酸序列"意指DNA或RNA分子，是单链或双链形式， 其编码本发明的任一ISLP蛋白质。本文使用的术语"分离的核酸序列，，不 局限于分离状态的核酸序列，还包括不再处于其分离自的天然环境的核酸 序列。因而，才艮据本发明，"分离的ISLP核酸(序列)"或"分离的ISLP 蛋白质(序列)"包括相较于原始细菌生物体的另一细菌宿主中或在植物 核基因组中的核酸或蛋白质(序列)。根据本发明，术语"蛋白质"或"多肽，，可互换使用，是指由氨基酸 链组成的分子，而不考虑任何具体作用方式、大小、三维结构或来源。因
此，本发明ISLP蛋白质的片段或部分在本文仍称为"蛋白质"。本文使用 的短语"分离的蛋白质"不局限于分离状态的蛋白质，还包括不再处于其 天然环境的蛋白质。蛋白质的天然环境意指在其中该蛋白质能被从自然中 找到的环境，即核苷酸序列最初被分离自的菌林。例如，分离的蛋白质可 以体外存在，或是在另一细菌宿主或植物细胞中，或者其能分泌自另一细 菌宿主或植物细胞。
根据本发明，编码新ISLP蛋白质的核酸序列，包括DNA序列，已被分 离和表征，且通过DNA合成人工制备了新形式。本文所述的具体ISLP基因 命名为,'W尸7，而它编码的蛋白质命名为ISLP1。
根据本发明，"ISLP"或"ISLP蛋白质"是杀虫、特别是杀昆虫蛋白 质，大约40到大约250 kDa，特别是约50到约120 kDa，或是约60到约100 kDa，尤其是大约80或大约100 kDa的蛋白质，分离或来源自细菌优选杆菌， 和已知的S层蛋白质如苏云金芽孢杆菌CTC的CTC2蛋白质(GenBank登录 号AAR23791 )具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、优选至 少85%或90%的序列同一性或序列相似性；及其任何毒性片段(如本文定 义)或变体如前体蛋白质、成熟形式、或与信号肽、与选择性标记蛋白质、 或与其他杀虫或杀昆虫蛋白质的融合蛋白质。本文使用的ISLP蛋白质的变 体包括与ISLP蛋白质免疫相关的杀虫优选杀昆虫蛋白质，从而它们能被识 别ISLP的抗体识别。本发明的ISLP优选来源于或见于厚壁菌门
(F,>w/cwtes)芽孢杆菌纲(5a"'〃i')的细菌中(或其上)。在本发明的另 一实施方案中，本发明ISLP来源于或见于芽孢杆菌目(5tf"7/fl&)细菌中
(或其上)。而在本发明另一实施方案中，本发明ISLP来源于或见于芽孢 杆菌科(5""7toce"e )细菌中(或其上)。在本发明另一实施方案中，ISLP 来源于或见于蜡状芽孢杆菌群细菌中(或其上)、或见于短芽孢杆菌属
(^Mv沩fld//^)或芽孢杆菌属(5tf"7/附)，优选蜡状芽孢杆菌、球形芽 孢杆菌(及印/^eWc"s)、炭疽芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(及/Zc/^mybmi&)和苏云金芽孢杆菌中(或其上)。根据本发明的ISLP蛋白质可以在细菌生 命周期的营养生长期和/或芽孢形成期产生，并且一般本质上是分泌型蛋白 质。根据本发明，ISLP蛋白质的毒性优选是特异性的，从而所述ISLP只对 于一些害虫优选昆虫有毒性，而非目标生物如哺乳动物不受影响。本发明 的一个实施方案中，ISLP蛋白质对于哺乳动物无毒，或易于在哺乳动物消 化系统中被降解。
本文使用的"成熟ISLP蛋白质"意指本发明缺少其细菌信号肽的ISLP 蛋白质。本文使用的ISLP蛋白质可以是有全长大小的蛋白质或是截短形 式，只要其杀虫例如杀昆虫活性或控制害虫例如控制昆虫的活性能保留即 可，或者可以是杂合或融合蛋白质形式的几个蛋白质或蛋白质结构域的组 合。
在本发明一个实施方案中，ISLP蛋白质是杀虫蛋白质，特别是杀昆虫 蛋白质，特异性地对某些害虫优选昆虫有毒性，能够形成晶体结构如晶格 阵列或天然细菌细胞外側的S层。本发明的一个实施方案中，这样的ISLP 通常可在分离细菌如苏云金芽孢杆菌(Bt)的晶体/芽孢制品的操作中被分 离或共纯化，不过它们与已知的细菌杀虫或杀昆虫毒素如苏云金芽孢杆菌 Cry、 VIP或Cyt蛋白质(见Crickmore等，1998和2005 )、或其它已知的 杀虫或杀昆虫细菌蛋白质如Bt蛋白质不具显著的序列同一性，优选低于 40%、低于30°/。或低于20%的序列同一性。这些ISLP天然地见于细菌细胞 壁的外侧r能够在芽孢形成时释放到细菌或芽孢的环境中。
在一实施方案中，ISLP是杀虫特别是杀昆虫蛋白质，包含三个S层同 源(SLH)区域，这些区域各自与SEQ ID NO: 2的S层同源区域具有至少 50°/o、或至少60%、或至少70%、特别是至少85%或90%的序列同一性或 相似性。本文使用的SEQ ID NO: 2的ISLP蛋白质的"S层同源区域"是SEQ ID NO: 2中第34-76位氨基酸的区域、第95-136位氨基酸的区域及第162-198 位氨基酸的区域。
如本文定义，本发明还提供了 ISLP蛋白质用于控制或杀死害虫例如昆 虫的用途，例如通过在田间播种种子或种植表达ISLP蛋白质的植物，或者通过对植物上或动物应用ISLP蛋白质来保护不受害虫例如昆虫损伤。还提 供了用于提高产率或增强作物生产力的方法，其包括培养含有编码本发明 ISLP蛋白质的DNA的作物的步骤。
根据本发明，提供了用于自杆菌中分离ISLP蛋白质的步骤。在一实施 方案中，杆菌在分离ISLP蛋白质之前无需或无需太多的传代培养步骤，因 为延长传代会降低ISLP蛋白质的产量。可选的，自其中分离ISLP的杆菌可 以生长在易感害虫优选昆虫害虫中，例如通过将其施加到它们的消化系统 或血淋巴中。该杆菌生产的ISLP蛋白质然后可以从害虫如昆虫中例如从它 的内脏或淋巴中分离，优选从那些在应用ISLP生产菌之后死亡的或显示出 严重的生长抑制的害虫或昆虫中分离。在这个过程中，产生对于某个耙害 虫例如昆虫害虫具高毒性的ISLP的细菌将很容易通过它们对于耙害虫的 明显效应来鉴定。同样，优选靶害虫和体内靶害虫环境能诱导高水平的 ISLP蛋白质。通常ISLP蛋白质能从细菌中分离，例如从培养上清液特别是 离心后芽孢形成培养物、或像苏云金芽孢杆菌的Cry蛋白质那样一般被富 集和分离。本文使用的术语"杆菌"意指杆状细菌。这些包括芽孢杆菌纲、 芽孢杆菌目或芽孢杆菌科的细菌，例如蜡状芽孢杆菌群的细菌，或芽孢杆 菌属的细菌例如苏云金芽孢杆菌。
在本发明的一实施方案中，提供了用于分离新的杀虫优选杀昆虫ISLP 蛋白质，特别是对于鳞翅目或鞘翅目昆虫有毒性的ISLP蛋白质的方法。这 样的方法包括步骤筛选杀虫(优选杀昆虫)杆菌(优选Bt)培养物中与 ISLP具有高度序列相似性的基因，特别是在杀虫(例如杀昆虫)的杆菌菌 林(优选Bt菌抹)中，在PCR分析中Cry或VIP基因阴性，特别是在对于某 些害虫显示出特异性毒性而不对其它害虫作用的菌林中。这样的具有高度
的S层同源区域的引物，例如ISLP1的S层同源区域)来识别。然后可以分 离出相应的基因并通过重组表达技术生产新的ISLP蛋白质。
本文使用的"kDa"意指以千道尔顿表示的蛋白质分子量大小。本文 与术语"大约" 一起使用或就约数("约80kDa")而言的"kDa"，意指在标准的蛋白质SDS-P AGE/Western印迹(即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰 胺凝胶电泳/蛋白质分析)中与分子量标准相比观察到的分子量。 SDS-PAGE/Western印迹使用标准技术进行。优选蛋白质或蛋白质片段通 过免疫交叉反应(例如Western印迹)或通过其特征(例如S层蛋白质或其 片段的典型蛋白质特征)证实为ISLP蛋白质。
本文使用的"S层蛋白质"或"表面层蛋白质，，意指分泌自生产它的 细胞的蛋白质，并且在原核生物特别是细菌表面能形成晶格阵列或点阵。 此类点阵多数通过蛋白质亚基自组装形成于原核生物表面，因而形成平坦 的晶体层面。例子有Luckevich和Beveridge ( 1989) 、 Sleytr和Beveridge
(1999)及Mesnage等(2001 )所述的S层蛋白质，特别是Bt菌林的S层蛋 白质CTC ， GenBank登录编号AAR23791的S层蛋白质。
ISLP蛋白质的一个例子是本发明的ISLP1蛋白质。根据本发明，
"ISLP1蛋白质"意指包含保留杀昆虫活性的SEQIDNO: 2氨基酸序列的 最小毒性片段(下文称为"最小ISLP1毒性片段")的任何蛋白质，特别 是包含SEQ ID NO: 2中始于第1位氨基酸和第31位氨基酸之间的氨基酸止 于第863位氨基酸的氨基酸序列的任何杀昆虫蛋白质，或是含有SEQ ID NO: 2中始于第1位氨基酸和第531位氨基酸之间的氨基酸止于第863位氨 基酸的氨基断列的任何杀昆虫蛋白质，或是含有来自SEQ ID NO: 2蛋白 质的蛋白酶消化特别是胰蛋白酶消化片段的氨基酸序列的任何杀虫蛋白 质，特别是通过胰蛋白酶消化自SEQIDNO:2成熟蛋白质得到的约30、约 40、约50或约60 kDa的蛋白质。本文包括ISLP1蛋白质与植物信号肽如叶 绿体转运肽融合而产生融合蛋白质。这包括含有SEQ ID NO: 2氨基酸序列 的最小毒性片段的杂合或嵌合蛋白质。本文使用的ISLP1蛋白质中包括 SEQIDN0.2蛋白质的杀昆虫蛋白质水解片段，优选胰蛋白酶消化片段， 或SEQ ID NO. 2蛋白质的任何杀昆虫有效片段，以及含有某些氨基酸缺 失、添加或替换而仍保持全部或多数ISLP1蛋白质杀昆虫活性的其变体或 等同体。本文包括成熟的ISLP蛋白质，缺少其信号肽或具有以甲硫氨酸或 以Met-Ala或Met-Asp二肽替换的信号肽。在本定义中还包括SEQ ID NO: 2氨基酸序列的变体，如与SEQ ID NO: 2基本上相似的氨基酸序列，在氨基酸序列水平上具有至少70%、或至少 75%、 80%、 85%、卯％、 95%、 97%、 98%或99%的序列同一性。在本 发明上下文中，"序列同一性，，可以使用威斯康星(Wisconsin) GCG包(麦 迪逊，威斯康星，美国，第10,2版)的GAP程序用成对比对来确定。对于氨 基酸序列比较GAP程序使用下列参数'blosum62，得分矩阵、'空位建 立罚分，(或'空位权重，)为8、而'空位延伸罚分'(或'长度权重，) 为2。根据本发明的杀昆虫蛋白质可能有一些氨基酸添加、替换或缺失而不 会显著改变或降低蛋白质的杀昆虫活性。
本文使用的术语"包含"应被阐释为规定存在所提及的所述特征、要 素、步骤或组分，但不排除存在或增加一个或多个特征、要素、步骤或组 分或其群组。因此，此处提到的"包含序列或区域X"的DNA或蛋白质意 指至少包括或含有该序列或区域X的DNA或蛋白质，因此其它核苷酸或氨 基酸序列可包含在5，(或N-末端)和/或3，(或C-末端)端。例如，核苷酸 序列可以包含编码转运肽和/或5，或3，前导序列的核苷酸序列。
本文使用的ISLP蛋白质的"毒性片段"是ISLP蛋白质的片段或部分， 其保留一些或全部、优选多数杀虫(优选杀昆虫)成熟ISLP蛋白质的毒性。 一般此类毒性片段通过剪切信号肽或通过酶促消化全长或成熟ISLP蛋白 质获得，例如通过害虫优选昆虫肠道酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或其它 在靶害虫消化系统中有活性的蛋白酶例如靶昆虫中肠消化酶来消化。 一般 此类毒性片段具有大约40到大约80 kDa的分子量，优选大约50或大约60 kDa 。本发明ISLP1蛋白质的毒性片段是大约50 kDa的胰蛋白酶消化片段。 ISLP蛋白质的"最小毒性片段"是ISLP蛋白质的最小毒性的片段。这样的 最小毒性片段可以通过酶促切割或通过表达具有核苷酸缺失的/^p DNA来 获得。编码毒性ISLP片段的DNA还可以是化学合成的，因此，毒性片段的 定义包含可从转录和翻译合成DNA获得的毒性片段。包含最小ISLP毒性片 段的任何蛋白质都可用于本发明，并且不仅仅是原始或成熟的ISLP蛋白 质，因为对于毒性并非必需的氨基酸序列可以被缺失或被其他序列替换而仍保持ISLP蛋白质的特征。
ISLP蛋白质的毒性片段还可以通过细菌自溶时ISLP蛋白质的降解和 溶解作用来获得，例如在害虫消化系统中，如昆虫的中肠里，或是在体外 培养物的芽孢形成时获得。出现了仍然能被抗ISLP抗体免疫检测的更小更 可溶的片段，并且能在自溶后用常规技术如抗体介导的纯化来鉴定或分离。
本文使用的"靶害虫，，是害虫，优选昆虫，其能被ISLP所杀死或负面 影响(例如抑制其生长)。当以此害虫或昆虫感染产ISLP蛋白质的细菌或 以之为食时，或以含有分离的ISLP蛋白质的食物喂养时，所述害虫或昆虫 显示出高于对照水平的毒性。
本发明ISLP蛋白质可能的鳞翅目靶昆虫包括但不限于美洲棉铃虫 (T7e/,V^v^7 fl )、才帛螟蛉(^^//"^"/ " flfr附/gem)、澳洲冲帛铃虫(^Te/Zcover/m 戸"c&em)、烟芽夜織(//^//。幼& Wre5re—、欧洲玉米螺(OstWm'fl wMa/is)、 草地夜蛾(S/wrfo/)teni /,wg^"f/fl)、小地老虎(」g/""ris ^w7fl")、才帛红铃虫 (户e"/"o/^/Yi gos柳/C/a)、 三化螺(5W /ro/7/r叹ff /"ce怖/"s)、 稻纵巻叶螺 (Oifl/ /rflf,< c/Y>c&附eflf,Vm//51)、 大螟(5^s"wwVi /w/ere"51)、 玉米斑点螟(CA//o /;fl故〃w51)、 黎豆夜蛾(Jwricflm'" ge附附fftoto)、 大豆夜饿(尸5^"d印/w5i'fl /"c/"rfms)、 大豆食心虫(E/;/"6^tf ""miiff)和i tfc鄉/"5i" /im 。
本发明ISLP蛋白质的其它可能靶昆虫选自苜蓿绿夜蛾(尸/a^y/^mi scfl6,fl)、 甜菜夜械(S/wflfo>/7tera ex/g"fl)、 黄斑夜械(iS^o^/o/;feni Of7i欣og"///) 、 二化螺(C緒o s"/7pr柳fl嗣、/yem'togm附附fl //cfln's"fc、 稻 螺玲(7V((WYmgfl 、稻眉目艮蝶(聊c"/es/s1 、 A/ams/mVi
/m加fl/Zs、牙舀显紋席'J须野螟(Manw附/fl exZgim)、 Manjw附/a f^ra"s、 三点7jC 螟、 稻白螟(5Wr/;o/ /r"g 'Vmo加")、斜紋夜蛾
sflccAani/Zs), 草地夜蛾、粘虫(柳,/r/zmia朋—《"")、 C緒o zamm/附和直 统稻弄蝶CP"r""m gwftfl似)、杨毛臀萤叶曱(v4ge/flwft'cfl fl/m〕、苜蓿叶象 (//"mi "Wcfl)、6尸朋w"]pe朋/s、 i7a/ft.cfl to附6a"'"fl、 墨西哥冲帛铃 象(/4w幼owo附"51 gnmrf/s)、 黄粉虫(J^we6Wo附C/to,)、 赤才以谷盗(7W'6o/ew附稻负泥虫
(Ow/e附a oz^"e) 、 Cote/7is1 6rw""gfl 、 稻7_K象甲(Zis5wAt7r/;/rM51 r fjzof尸A Z/"51)、 黄曲条跳甲(尸/^〃o^e紐crw"/e,ae)、黄曲条跳甲(PAj;//o^^fl 5tn》/"似)、油菜蚤跳甲(i^j;〃/6Jflfes1 pw/ic似/ff似)、芫胥红叶甲CEyito附05^e/is fl附eWc"wfl)、 油菜露尾曱(MeZ/g^幼es aeMe附)、Owto/jwc/iMS 、 油菜蓝 跳曱(尸s^"》""c/ro^oce/ /^/fl)、婉豆细紋跳曱(尸/y;"o""" w"rf"/"to)、马 铃薯曱虫 (Xe/;ftViotoraflr flfece附/iVieflto)、 黄瓜叶甲 (D/flAraric" ""flfe"Vw/;""c似to Mrtflfe"7w尸"/i""to)、 黄瓜十 一 星叶甲(Z)/fl6raft'c" wrtded附/ wwc似似/^Hvzn/()、 北部玉米食才艮虫(Z)zV^ra,Zcfl Afl尸6eW)和西部食 才艮虫(Z)/flA尸W/cfl v//^/em)。
本文使用的术语"islpDNA"或"ISLPDNA"意指编码ISLP蛋白质 的任何DNA,例如编码如上文所定义的"ISLP1蛋白质"的DNA，如SEQ ID NO: 1所示的&//^/ DNA，特别是自第325位核苷酸到第2913位核苷酸， 优选自笫412位核苦酸到第2913位核苷酸。这包括编码SEQ ID NO: 2蛋白 质或如上文所定义的其毒性片段或变体的天然产生的人工或合成的DNA 序列。本文还包括编码杀昆虫蛋白质的DNA序列，其与编码本发明ISLP 蛋白质的DNA足够相似，从而能够(即具有能力)在严格杂交条件下与这 些DNA序列杂交。
本发明还包括根据本发明分离的islp基因的任何启动子及其用途，例如 SEQIDNO:l的fe/j^ DNA的启动子区域，其能够提供用于细菌表达的强 启动子。本文使用的&//;/ DNA的启动子包含SEQ ID NO: l中第l位至第 324位核苷酸的序列。
本文4吏用的"严格杂交条件"特别指下列条件在滤膜上固定相应的 DNA,并将滤膜在42。C于50。/。甲酰胺、5% SSPE、 2 x Denhardt，s试剂和 0.1% SDS中预杂交1到2小时，或者在68'C于6xSSC、 2 x Denhardt，s试剂 和0.1% SDS中预杂交1到2小时。然后直接把变性(地高辛或放射性)标记 的探针加入到预杂交液中，并在上述的合适温度下进行孵育16到24小时。 在孵育后，在室温于2xSSC、 0.1% SDS中洗涂滤膜30分钟，继以在68。C于0.5xSSC和0.1。/0 SDS中洗涤两次，每次30分钟。在-70。C利用增感屏通 过曝光滤膜24到48小时到X光片(柯达XAR-2或等同物)来完成放射性自 显影(20xSSC = 3M NaCl和0,3M柠檬酸钠；100 x Denhardt，s试剂 =2%~ )牛血清白蛋白，2%(w/v) Fieoll 及2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮； SDS =十二烷J^危酸钠；20 x SSPE- 3，6 M NaCl， 0.2 M磷酸钠和0.02 M EDTA pH7.7)。本领域普通技术人员能容易地改良上面说明的具体条件 和参数而保持期望的严格杂交条件。
对于分离本发明DNA序列的变体有很多本领域已知的方法。例如，变
林如杆菌特别是芽孢杆菌属物种中检测和分离。可以制备/s/p DNA序列区 域的特异性或简并引物，并用来扩增已知或新细菌菌林的变体。
本发明&//; DNA的变体包括编码上述ISLP蛋白质变体的DNA序列，或 编码与本发明islp DNA序列如SEQ ID NO: 1、优选第412位至笫2913位核 苷酸具有至少60%、至少65%、至少70%、 80%或90°/。同一性的杀昆虫蛋 白质的DNA序列。提及的序列同一性利用威斯康星GCG包(麦迪逊，威斯 康星，美国)第10.2版的GAP程序计算。对于核酸GAP程序使用下列参数 "nwsgapdna，，得分矩阵，"空位建立罚分"(或"空位权重，，)为50， 而"空位延伸罚分"(或"长度权重")为3。严格杂交条件如上文所定义。
本文使用的ISLP蛋白质的"杀昆虫活性"意味着当用此蛋白质喂养昆 虫(优选通过在重组宿主例如植物中表达)时，此蛋白质杀死昆虫的能力。 如杲蛋白质在至少一个昆虫发育阶段(优选幼虫阶段)具有杀死昆虫的能 力，就应理解为其具有杀昆虫活性。
本文使用的蛋白质的"昆虫控制量"意指足以将以植物为食的处于任 何发育阶段(例如昆虫幼虫)的昆虫所导致的植物损伤的限制在商业上可 接受水平的蛋白质的量。限制昆虫对植物的损伤可能是例如杀死昆虫或抑 制昆虫发育、繁育或生长的结果，从而昆虫对植物造成的损伤更小，且植 物产率不会被显著地不利影响。本文使用的"控制"昆虫意味着当用本发 明ISLP蛋白质处理时获得至少显著的(高于对照值)对于昆虫的生长抑制、发育延迟或繁育抑制。
根据本发明，易感于本发明新ISLP蛋白质的昆虫接触昆虫控制量、优 选杀昆虫剂量的蛋白质。本发明蛋白质的优选靶昆虫是，特别在欧洲、北 美和南美国家、亚洲和澳大利亚，对玉米、棉花、稻、大豆、蔬菜植物、
芸苔属物种的才直物、欧洲油菜(Bmsw'c"/m;uis)、花椰菜、胡萝卜、豌豆、 小麦、大麦、黑麦、番茄、马铃薯、甜菜、切花、玫瑰、水果植物(苹果、 梨、桃、草莓等)、树(如白杨和柳树)及莴苣经济上有害的昆虫害虫。 本文使用的术语"植物"包括整个植物还有植物的部分如叶、茎、种子、 花或根。
本文使用的ISLP蛋白质的"杀虫活性，，意指蛋白质杀死、致病、抑制 生长或以其他方式负面作用于所有或部分植物或动物害虫生物体例如某些 节肢动物、线虫、螨、蛘虫、苍蝇、细菌、病毒、真菌等的活性。本文使 用的植物或动物害虫生物体是任何的活的生物体，它能通过导致部分或全 部植物或动物感染、疾病或死亡、或以其他方式抑制生长、使这样的植物 或动物(优选这些是更小的生物体例如无脊推动物)丧失能力或对其负面 影响来对植物或动物包括人类导致损伤。能够将害虫生物体传递给植物或 动物的媒介生物也被认为是本文所用的害虫生物体，例如诸如蚊子或螳埤 的害虫。
插入到表达栽体来生产大量的ISLP蛋白质。ISLP蛋白质可用于以常规方式 (服fte等,1988; Harlow和Lane， 1988)制备特异性单克隆或多克隆抗 体。
在本发明一个实施方案中，提供了特异性结合ISLP蛋白质的抗体。特 别是提供了结合ISLP蛋白质或其片段或变体的单克隆或多克隆抗体。还包 括单克隆或多克隆抗体的片断，其保留结合用于产生它们(例如单链抗体) 的ISLP蛋白质或片断的能力。ISLP蛋白质的抗体可以通过本领域已知的方 法、使用1SLP蛋白质作为动物(例如兔或小鼠)体内的抗原来制备。用来 制备抗体的合适的方法包括Harlow和Lane《抗体使用实验室手册》("Using Antibodies: A Laboratory Manual")(纽约冷泉港实验室出版社， 1998)和Liddell和Cryer《单克隆抗体实用指南》("A Practical Guide to Monoclonal Antibodies") ( Wiley和Sons， 1991)中描述的那些。抗体可用 于分离、鉴定、表征或纯化其与之结合的ISLP蛋白质。例如，抗体通过允 许抗体和蛋白质形成免疫复合物并检测免疫复合物的存在，例如通过
ELISA或免疫印迹法，可用于检测样品中的ISLP蛋白质。
本发明的另 一实施方案中提供了用于检测ISLP DNA序列的PCR引物 和/或探针及试剂盒。用于从样品中扩增本发明中植物优化的ISLP DNA的 PCR引物对(其中每个引物长至少15到25、优选至少18或20个核苷酸)可 以基于该ISLP序列例如ISLP1序列通过本领域已知的方法来合成(见例如 Dieffenbach和Dveksler (1995)《PCR引物实验室手册》(尸C/ 户W附w/4 丄fl6omtoo; Af朋鄉/), 冷泉港实验室出版社及McPherson等(2000) PC7 -5"s/^.' F/wm 5"c/^rawwd似5ewcA，第一版，德国施普林格出版社 (Springer Verlag)。同样的，SEQ ID NO: l序列的DNA片段、特别是在多 种细菌(优选杆菌)S层蛋白质中具有高度同源性的区域的部分，例如SLH 区域(Mesnage等，2001， Microbiology 147， 1343-1351 )，如上述ISLP1的 SLH区域，可以用作杂交探针。ISLP检测试剂盒可能含有ISLP特异性引物 或者ISLP特异性探针，以及随附的使用所述引物或探针来检测样品中ISLP DNA的说明书。例如，此类检测试剂盒可用来确定是否植物已经被编码本 发明ISLP蛋白质(或其部分)的基因所转化。
因为遗传密码的简并性，某些氨基酸密码可以为其它替换而不会改变 蛋白质的氨基酸序列。此外， 一些氨基酸可以被其他等同氨基酸取代而不 改变或不显著改变蛋白质的杀虫优选杀昆虫活性，或至少不降低蛋白质的 杀虫优选杀昆虫活性。例如，氨基酸取代包括同类的互换氨基酸碱性(如 Arg、 His、 Lys)，酸性(如Asp、 Glu)，非极性(如Ala、 Val、 Trp、 Leu、 Ile、 Pro、 Met、 Phe、 Trp、 Gly)及极性(i口Ser、 Thr、 Tyr、 Cys、 Asn、 Gln)。只要ISLP蛋白质的杀虫活性基本上相同或并未降低至获得害 虫控制例如昆虫控制所需的水平之下，这样的同类取代均落于本发明的范围之内。此外，只要ISLP蛋白质的杀虫活性基本上是相同或并未降低，非 保守氨基酸取代落在本发明的范围之内。本发明DNA序列的变体或等同体 包括编码本文定义的ISLP的DNA序列，在严格杂交条件下能与SEQ ID NO: 1的ZW:PDNA序列杂交。此类变体或等同体应编码与本发明蛋白质具有相 同或基本上相同的杀虫特性的蛋白质，而其他特性例如热稳定性或对蛋白 酶切割的易感性可以被改变。在某些情况下可优选获得毒性相同或大致相 似但热稳定性较低或胃蛋白酶敏感性较高的毒性ISLP，且此类变体可以通 过已知用于随机诱变和筛选的步骤，或通过定点突变本发明的ISLP蛋白质 (例如通过在ISLP蛋白质中引入胃蛋白酶切割位点，见WO 02074799 )来 制备。本文使用的变体或等同体还包括这样的DNA序列，其与本发明天然 ZSX户基因相比具有不同的密码子利用，但编码具有相同杀虫活性并具有相 同或基本上相同的氨基酸序列的蛋白质。Z5丄户DNA序列可以通过调整密 码利用，使之成为植物基因，特别是目的植物属或种(即期望通过可用的 密码子表而从中表达ISLP蛋白质的植物属或种)的天然基因中最优选的， 来进行密码子最佳化(例如更适于在棉花、大豆、玉米或稻中表达)。
对于植物或其他真核生物中的表达，在本发明ISLP基因中要避免、去 除或减少长链的AT或GC核苷酸(如6个或以上的A或T核苷酸链或6个或以 上的G或C核苦酸链)，并可以引入合适的限制性位点。
此外，ISLP蛋白质的N-末端可以进行修饰，以使之具有最佳的翻译起 始环境，由此在蛋白质的N-末端添加或缺失一个或多个氨基酸。在多数情 况下，优选欲在植物细胞中表达的本发明蛋白质以Met-Asp或Met-Ala二肽 起始，以进行最佳的翻译起始，因此有时需要在/S丄户DNA中起始密码子 的下游插入编码Asp或Ala氨基酸的密码子作为新的第二个密码子(如果此 第二个密码子并不已经是Ala或Asp的话)。
DNA序列还可以进行修饰，以去除不合理的剪接位点或转录终止信 号。因为细菌基因可能包含被其他宿主特别是真核宿主如植物识别为5，或 3，剪接位点或转录终止信号的基序，在那些其他宿主中的转录可能无效或 可能过早地终止。可以通过基于计算机的DNA序列分析和/或通过本领域已知的PCR分析来鉴别不合理的剪接位点或转录终止信号。
可根据具体的目的来构建密码子利用不同但编码具有基本上相同的杀 虫活性的相同蛋白质或相似蛋白质的任何DNA序列。已描述在原核和真核 表达系统中改成宿主细胞的密码子利用有助于异质宿主中的基因表达
(Be隱tzen和Hall， 1982; Itakura等，1977)。在文献(Wada等，19卯； Murray等，1989 )和主要的DNA序列数据库(如位于德国海德堡的EMBL ) 及如Nakamura等(2000)所述中可找到密码子利用表。相应地，本领域普通 技术人员能容易地构建合成的DNA序列，以生产相同或基本相同的蛋白 质。显而易见的是， 一旦知道了本发明ISLP蛋白质的氨基酸序列，就可以 制备可选的DNA序列。此类可选的DNA序列包括合成的或半合成的DNA 序列，为使基因中某些位点失活，所述序列已经被改变。这种失活作用可 以通过例如使整体密码子利用情况调整成更为相关的宿主生物(例如希望 在其中进行表达的宿主生物)的密码子利用来实现。用于将密码子利用改 变成宿主细胞优选的多种技术可以在专利和科学文献中找到。只要多数或 全部密码子调控序列或加工元件(如植物多聚腺苷酸信号和剪接位点)为 其他序列所替换，并优选编码区域的AT含量接近宿主生物，确切的密码子 利用改变的方法在本发明中并非关键。
例如上述的对DNA序列的小的修饰可以常规进行，例如通过PCR介导 的诱变(Ho等，1989; White等，1989)。通过使用可用的技术从头DNA 合成期望的编码区可以对DNA序列常规地进行的更为大量的修饰。
短语"基本上相同"当在这里用于指ISLP蛋白质的氨基,列时，意 指与相比较的蛋白质氨基酸序列的差异不超过5%或不超过2% (如果一个 蛋白质较小，则是对于相同长度的区域而言)的氨基^列。当指ISLP蛋 白质的毒性时，短语"基本上相同"意指蛋白质与相比较的蛋白质得到的 平均LCso值比，其平均LCs。值相差不超过2-5倍，优选2倍。本上下文中，
"平均LCso"是导致测试种群50%死亡率的蛋白质浓度，从三次使用相同 生物测定条件进行的独立生物测定计算而来。用Probit分析、使用程序 POLOPC(来自LeOra软件，1987，伯克利，加利福尼亚州)计算LCs。值。可以理解，为了确定LC别值是否存在统计学显著差异，对两比较蛋白质中 每一个的LCso值计算95。/。(或90%)的置信限度(用Probit分析计算的一 个相关参数)。在本发明一个实施方案中，在使用适当对照的相同或可比 试^i殳置中，可以看到如果置信P艮度重叠，两个蛋白质的毒性基本上相同， 如果置信限度不重叠则基本上不同。
体并转化到细菌菌林例如大肠杆菌或其他细菌菌林中，优选在其他杆菌如 苏云金芽孢杆菌中。在本发明的一个实施方案中，为在细菌中表达，在DNA 构建体中纳入了编码ISLP蛋白质细菌信号肽或适合的其他细菌信号肽(例 如来源于宿主细胞产生的分泌蛋白质的信号肽)的DNA序列。然后可以通 过常规的克隆免疫探测方法(French等，1986)用针对ISLP蛋白质制备的 单克隆或多克隆抗体来筛选表达毒素的克隆。
可以筛选细菌克隆用于生产ISLP蛋白质(细胞裂解液或上清液可使用 标准方法跑SDS-PAGE胶并进行标准的western印迹步骤)，细菌或纯化或 半纯化的ISLP蛋白质可以使用本领域已知或在下面所述的方法检测其相 比于对照细菌的杀虫活性。还可以使用标准PCR方法如RT-PCR分析克隆 中编码ISLP蛋白质的mRNA的存在情况。
可以常^L的方式对编码本发明ISLP蛋白质的基因进行测序(Maxam 和Gilbert， 1980; Sanger, 1977 )来得到DNA序列。
序列比较显示&// 基因和以前所述的编码杀虫特别是杀昆虫的细菌毒 素的基因不同，且属于一类新的基因，编码与细菌优选杆菌S层蛋白质具 有显著序列同一性的杀虫或杀昆虫蛋白质。
可以在基因序列分析之后以常规的方式制备。ISLP蛋白质的氨基酸序列可 以由分离的DNA序列确定。短语编码ISLP蛋白质的DNA序列的"杀虫有 效部分(或一部分或片段)"本文也称为"截短的基因"或"截短的DNA"， 本文使用意指编码本文定义的ISLP蛋白质毒性片段的DNA序列。
为了在大肠杆菌、其他细菌菌林或植物中表达编码本发明ISLP蛋白质的DNA序列所有的部分或杀虫有效部分，可以在DNA序列侧翼引入合适的 限制性位点。这可以用熟知的方法(见例如Stanssens等，1989; White等， 1989)通过定点诱变来进行。为提高植物中的表达，本发明的/5X尸基因或 /5X户基因杀虫有效部分可以依据PCT出版物WO 91/16432和WO 93/09218 和出版物EP 0 385 962、 EP 0 359 472和US 5，689,052进行修饰来形成等同 的、修饰的或人工基因或基因部分。/S丄尸基因或基因部分还可以插入到植 物的质体(如叶绿体)或线粒体基因组中，并使用合适的启动子在那里表 达(见例如McBride等，1995; US 5,693,507 )。
为了增强单子叶植物例如玉米或稻中的表达，可在嵌合基因中添加内 含子(例如单子叶内含子)。例如，在5，调控区添加玉米^/W基因内含 子已表明增强玉米中的表达(Callis等，1987)。同样地，如US 5,859,347 中所述，HSP70内含子可以用于增强表达。T5XP基因的DNA序列或它的毒 性片段还可以改变为翻译不确定方式。通过定点内含子插入和/或通过对 密码子利用引入变化，此类改变可能修饰抑制基因部分中存在的DNA序 列。密码子利用变化可以是例如调整密码子利用，使之成为植物，特别是 宿主植物最优选的，而不改变或不显著改变编码的氨基酸序列。
根据本发明的一个实施方案，蛋白质可以靶向到植物细胞中的胞内细 胞器，如质体(如叶绿体)、线粒体，或可能从细胞中分泌出去。为了这 个目的，在本发明一个实施方案中，本发明嵌合基因包含编码信号肽或乾 向肽的编码区，优选植物信号肽或靶向肽，连接于本发明ISLP蛋白质的编 码区。可能包含在本发明蛋白质中的肽是用于叶绿体或其他质体把向的转 运肽，例如来自植物基因的重复转运肽区域，其基因产物被耙向到质体中， Capellades等(US 5,635,618)的经优化转运肽、菠菜中的铁氧还蛋白质 -NADP+氧化还原酶的转运肽(Oelmuller等，1993) 、 Wong等(1992)所 述的转运肽及PCT专利公开WO 00/26371中的耙向肽。可选的肽包括那些 传导连接于此类肽的蛋白质分泌信号的肽，例如马铃薯蛋白酶抑制剂II的 分泌信号(Keil等，1986)、稻a淀粉酶3基因的分泌信号(Sutliff等，1991) 及烟草PR1蛋白质的分泌信号(Cornelissen等，1986)。根据本发明有用的信号肽包括叶绿体转运肽(例如Van Den Broeck 等，1985),或US5，510，471和US5，635，618中经优化的导致蛋白质转运到 叶绿体的叶绿体转运肽、分泌信号肽或将蛋白质耙向到其他质体、线粒体、 内质网或其他细胞器的肽。在天然靶向或分泌蛋白质内可以找到用于靶向 到胞内细胞器或用于分泌出植物细胞或靶向到细胞壁的信号序列，例如 K16sgen等(1989 ) 、 K16sgen和Weil (1991) 、 Neuhaus和Rogers (1998 )、 Bih等(1999 ) 、 Morris等(1999 ) 、 Hesse等(1989 ) 、 Tavladoraki等(1998 )、 Terashima等(1999) 、 Park等(1997) 、 Shcherban等(1995)所述的那 些，所有这些引入本文作为参考。可选的信号序列包括来自玉米、棉花、 大豆或稻的靶向或分泌蛋白质的信号肽序列。
为使ISLP蛋白质分泌到转化的宿主细胞的外面，可以将适当的分泌信 号肽融合到ISLP蛋白质的氨基末端(N-末端)。同样，任何天然细菌分泌 信号肽可以净皮缺失或替换为二肽Met-Ala或Met-Asp或另一信号肽如上述 的植物分泌信号肽。特别地，本发明ISLP蛋白质例如SEQ ID NO: 2所示 ISLP1蛋白质的第l-29位氨基酸包含细菌信号肽。可以移除第l-29位氨基 酸，或将其替换为甲硫氨酸或Met-Ala或Met-Asp二肽，或替换为合适的信 号肽例如上述的植物信号肽。信号肽可以使用基于计算机的分析(使用程 序如信号肽搜索程序(SignalP Vl.l或2.0)、使用合适的矩阵(如用于原 核革兰氏阳性菌)和阈值分少于0.5、阈值分数为0.25或更小(见例如Von Heijne、 Gunnar， 1986和Bendtsen等，2004)，或通过与具有已知信号肽 的相似蛋白质比对来检测。
此外，可以使用本领域已知方法(见例如VanRie等，1990)计算本发 明ISLP蛋白质的结合特性，来确定是否本发明ISLP蛋白质能结合害虫如昆 虫内脏中不被其他细菌蛋白质识别(或竟争)的位点。和已知杀昆虫蛋白 质例如Cry、 Cyt或VIP毒素家族的Bt毒素相比，能结合相应易感昆虫的不 同结合位点的一类新的杀昆虫蛋白质很有价值。此类蛋白质可以用来代替 昆虫已经对于其具有抗性的已知细菌蛋白质，或用来与具有不同作用方式 的杀昆虫细菌蛋白质联合来防止或延緩昆虫对细菌蛋白质抗性的发展，特别是在植物中(优选同时)表达的情况下。因为本发明的ISLP毒素的特性， 它们尤其可用于转化植物例如单子叶如玉米和稻以及和双子叶如棉花、蔬 菜作物、豌豆和大豆，来保护这些植物免受昆虫损伤。本发明ISLP蛋白质 的作用方式和当前用于转基因植物产品的已知Bt毒素如杆菌的Cry或VIP 蛋白质相比是不同的。此类结合特性可以通过如上面或美国专利6，291，156 和6，137，033所述的常规结合测试来测定。
特别是出于对特定昆虫害虫的昆虫抗性管理目的，优选本发明的ISLP 联合另一昆虫控制蛋白质特别是细菌Cry蛋白质例如CrylF、 Cry2A或 CrylAc蛋白质或VIP或VIP样蛋白质如VIP3A，优选对于此类ISLP蛋白质 识别的至少一个结合位点不识别的蛋白质。与本发明ISLP蛋白质联合的特 别是在植物(例如玉米、棉花、芸苔属物种(例如花椰菜或甘蓝)、稻或 大豆植物)中同时表达的合适的昆虫控制蛋白质包括，但不局限于Cry 蛋白质如CrylB、 CrylC、 CrylD或CrylE蛋白质或其毒性片段；包含CrylF 毒性片段的蛋白质或来源于CrylF蛋白质的杂合蛋白(例如US 6，326，169、 US 6,281,016、 US 6，218，188中所述的杂合CrylA-CrylF蛋白质或其毒性片 段)；包含CrylA型蛋白质或其毒性片段的蛋白质，优选CrylAc蛋白质或 来源于CrylAc蛋白质的杂合蛋白(例如US 5,880,275中描述的杂合 CrylAb-CrylAc蛋白质)或如在EP451878中所述的包含CrylAb蛋白质或 其杀昆虫片段；包含Cry2Ab蛋白质毒性片段的蛋白质，例如在美国专利 6,489,542中描述的Cry2Ab蛋白质-转运肽融合蛋白质；包含如 WO02/057664中所述Cry2Ae、 Cry2Af或Cry2Ag毒性片段的蛋白质；包含 如WO01/47952中所述的Cry蛋白质毒性片段的蛋白质；包含如Estruch等 (1996)及US 6，291,156所述的VIP3Aa蛋白质或其毒性片段的蛋白质；如 WO98/50427所述来自致病杆菌属物种(Xew^^Mws spp.)的杀昆虫蛋白 质；来自于沙雷氏菌属(Scrarifl)(特别来自嗜线虫沙雷氏菌 ^似/ 0/^//"))或光杆菌属物种(尸/^似^"/^附)菌林的杀昆虫蛋白质，例如在 WO98/08932中所述来自光杆菌的Tc蛋白质(例如Waterfield等，2001; Ffrench-Constant和Bowen， 2000)。在一实施方案中，此类共表达通过用编码本发明ISLP蛋白质的DNA转化已经表达昆虫控制蛋白质的植物、或是 通过以已知昆虫控制蛋白质转化的植物和以一个或多个本发明ISLP蛋白 质转化的植物杂交能容易地得到。对于玉米、稻、棉花或大豆植物，可以 使用ISLP蛋白质作为第一个昆虫控制蛋白质，并使用CrylAb、 CrylAc、 Cry2Ae或VIP3Aa蛋白质或包含它们毒性片段的蛋白质、杂合蛋白或其变 体作为第二个昆虫控制蛋白质。在EP 0 408 403中描述了用于获得不同杀 昆虫蛋白质在同一植物中的表达以致力于最小化或防止对于转基因昆虫抗 性植物抗性发展的方法。不同的蛋白质可以表达于同一植物，或每一个能 被表达于单一的植物尔后通过单一植物彼此杂交而在同一植物中组合。例 如，在杂种种子生产中，每一亲本植物能表达单一蛋白质。通过杂交亲本 植物来产生杂种，两蛋白质在杂合植物中被组合在一起。在某些情况中， 可优选在植物的同 一位点或遗传座位插入不同的毒性基因，以便于在该植 物的后代中基因不会分离。
广为人知的是Bt Cry蛋白质表达成原毒素，通过在昆虫肠内蛋白质水 解它可转化为毒性核心。当本发明ISLP蛋白质和BtCry蛋白质组合时，可 以理解，可以使用编码全长原毒素或者毒性核心或者任何中间体形式的 基因。
出于筛选目的和/或增强控制杂草的选择，本发明的转基因植物也可以 用赋予广谱除草剂(例如基于草丁膦或草甘膦的除草剂)抗性的蛋白质的 编码DNA进行转化。
杀虫有效75X尸基因的部分或其等同体，优选/S丄户嵌合基因，编码ISLP 蛋白质的杀虫有效部分，可以用常规方式稳定地插入单一植物细胞的核基 因组中。并且如此转化的植物细胞可以用常规方式用于产生控制害虫例如 昆虫害虫的转化植物。在这一点上，在农杆菌中的包含编码ISLP蛋白质的 DNA的T-DNA载体可用于转化植物细胞。其后，可以用例如在EP 0 116 718、 EP 0 270 822、 PCT文献WO 84/02913和乂A开的欧洲专利申请EPO 242 246及在Gould等(1991)中所述的方法从转化植物细胞再生转化植物。构 建用于农杆菌介导的植物转化的T-DNA载体在本领域广为人知。T-DNA载体可以是如EP 0 120 561和EP 0 120 515所述的双元载体或者如EP 0 116 718所述的能通过同源重组整合进农杆菌Ti质粒的共整合载体。优选 T-DNA载体每个包含位于T-DNA边界序列之间的、或至少位于右边界序列 左侧的有效连接于杀虫有效Zy丄尸基因部分的启动子。Gielen等(1984 )描 述了边界序列。其它类型的载体可使用例如直接基因转移(例如在EP 0 223 247中所述)、花粉介导的转化(例如在EP 0 270 356和WO 85/01856中所 述)、原生质体转化(例如在US 4，684，611中所述)、植物RNA病毒介导 的转化(例如在EP 0 067 553和US 4，407，956中所述)、脂质体介导的转 化(例如在US 4，536，475中所述)的方法及如最近描述的用于转化某些玉 米(例如US 6，140，553; Fromm等，1990; Gordon-Kamm等，19卯)和稻 (SWmamoto等，1989; Datta等，1990 )品系的其它方法和一般用于转化 单子叶的方法(PCT文献WO 92/09696)来转化植物细胞。合适的用于棉 花转化的方法见述于PCT专利文献WO 00/71733。有关稻转化，参考在 WO92/09696、 WO94/00977和WO95/06722中所迷的方法。
本文使用的术语"玉蜀黍，，和"玉米"同义，指玉蜀黍(Zefl /mi")。 本文使用的棉花指棉属物种((7仍^p/w附spp.)，特别是陆地棉(G. Zi,V^"似附)和海岛棉(G. 6tfMflfife"se )。术语"稻，，指稻属物种(0o^fl spp.), 特别是水稻(a sflftVfl)。"大豆"指大豆属物种(G/_v"'""pp),特别是大 豆(G".附ax)。本文使用的蔬菜植物或蔬菜指黄瓜、番茄、莴苣、布鲁塞尔 菊苣、芸苔属植物如花椰菜或甘蓝、韭菜、生菜、洋葱、(西)瓜、朝鲜 蓟、胡萝卜或胡椒。
除转化核基因组以外，本发明还包括转化质体基因组(例如叶绿体基 因组)。Kota等(1999)已描述了在烟草叶绿体中过表达Cry2Aa蛋白质 的方法。
产生的转化植物可以用于常规植物育种方案来生产更多的具有相同特 征的转化植物，或用于向相同或相关植物种类的其它品种中引入杀虫有效 /5X户基因的部分。从转化植物得到的种子包含编码ISLP蛋白质作为稳定的 基因组插入物的基因。转化植物的细胞可以用常规方式培养来生产ISLP毒素或蛋白质的杀虫有效部分，它可以回收，用于常规杀昆虫组合物特别是 抗鳞翅目的杀昆虫组合物。
杀虫有^L/5X户基因部分插入于植物细胞基因组中，从而插入的基因位 于指导植物细胞中基因部分表达的启动子的下游(即3，)并在其控制下。 这可以通过在植物细胞基因组例如在细胞核或质体(例如叶绿体)基因组 内插入/5X户嵌合基因来实现。
合适的启动子包括，但不局限于强组成型花椰菜花叶病毒(CaMV) 分离林CM1841 (Gardner等，1981) 、 CabbB-S (Franck等，1980)和 CabbB-JI (Hull和Howell， 1987)的35S启动子("35S启动子");Odell 等(1985)所述的35S启动子；来自泛素家族的启动子(例如Christensen 等，1992、 EP 0 342 926、还见于Cornejo等，1993的玉米泛素启动子)； gos2启动子(dePater等，1992) ; emu启动子(Last等，1990);拟南芥 肌动蛋白启动子例如An等(1996)所述的启动子；稻肌动蛋白质启动子例 如Zhang等(1991)所述的启动子及在US 5，641，876中描述的启动子；木薯 叶脉花叶病毒启动子(WO 97/48819, Verdaguer等，1998 );来自 Subterranean Clover Stunt病毒的pPLEX系列启动子(WO 96/06932，特 别是S7启动子)；醇脱氢酶启动子例如pAdhlS ( GenBank登录号X04049、 X00581 )及分别驱动T-DNA 1，和2，基因表达的TR1，启动子和TR2，启动子 (分别为"TR1，启动子"和"TR2，启动子")(Velten等，1984)。可选地， 可以使用不是组成型的而是特异于一种或多种植物组织或器官(如叶子和/ 或根部)的启动子，由此插入的/S丄尸基因部分只表达于特异组织或器官的 细胞中。例如，如US 5,254，799所披露，通过将杀虫有效基因部分放置在 光诱导型启动子例如植物本身或另 一植物如豌豆的核酮糖-l，5-二磷酸羧化 酶小亚基基因启动子的控制下，杀虫有^t/5X户基因部分可以选择性地表达 在植物(如玉米、棉花、稻、大豆)叶子中。例如，可如此选择启动子以 使本发明/SZP基因只表达于靶害虫如昆虫害虫以之为食的那些组织或细 胞中，以便于易感靼害虫的吃食导致对于宿主植物相比于不表达ZS丄户基因 的植物的损伤降低。因而，通过在根特异性启动子控制之下表达ISLP基因，可以有效控制主要损伤根部的害虫。在WO00/29566中叙述了优先在根部 作用的启动子。用于根部优先表达的合适的启动子是在US 5，633，363中所 述的ZRP启动子(及其修饰)。另一个可选的是使用其表达为诱导型的启 动子，例如创伤诱导型启动子如例子Cordera等(1994)叙述的MPI启 动子，它是通过(如由昆虫吃食所导致的)创伤诱导，或是由化学品例如 Aoyama和Chua (1997 )所述的地塞米柏H秀导的启动子，或是由温度诱导 的启动子例如US 5，447，858中描述的热休克启动子，或是由其它外部刺激 诱导的启动子。在单子叶植物例如玉米和稻中，农杆菌TR2，启动子或其 变体是优选的创伤诱导型启动子，用来驱动本发明嵌合ISLP基因的转录， 见WO 03/093483。
杀虫有^t75丄尸基因可以插入植物基因组，以便所插入的基因部分是在 合适的3，末端转录调控信号(即转录物形成和多腺苷酸化信号)的上游(即 5，)。这优选通过将/^SX尸嵌合基因插入到植物细胞基因组内来获得。合适 的多腺苷酸化和转录物形成信号包括CaMV 35S基因、胭脂碱合酶基因 (Depicker等，1982)、章鱼碱合酶基因(Gielen等，1984)和T誦DNA基 因7 (Velten和Schell， 1985)的那些信号，其作用为转化植物细胞中的3， 不翻译DNA序列。
使用已知的方法如电穿孔或三亲本交配能够将T-DNA载体引入至农 杆菌。
杀虫有效ZW^基因部分可以任选地作为杂合基因(US 5,254,799; Vaeck等，1987)插入到植物基因组中，位于和选择性或能够做为标记的 基因例如编码卡那霉素抗性的weo基因(EP 0 242 236)的同一启动子的控 制下，以便于植物表达的融合蛋白质能够容易地检测。
还可以使用转化植物细胞来在植物细胞培养物中生产大量的本发明蛋 白质，例如产生可以经合适的配制后应用于作物的ISLP蛋白质。当本文提 及转基因植物细胞时，是指如此类分离状态或在组织培养物中的植物细胞 (或也有植物原生质体)，或者包含在植物或在分化的器官或组织中的植 物细胞(或原生质体)，两种可能性本文都特别包括进来。因此，在说明书或权利要求中涉及的植物细胞意味着不仅指培养物中分离的细胞，还指 任何植物细胞,无论它可能位于或可能存在于哪种类型植物组织或器官中。
编码杀昆虫特别是抗鳞翅目蛋白质的所有或部分ZS/JP基因还可以用
于转化其它微生物包括细菌如苏云金芽孢杆菌，其可能已经具有抗鳞翅目 或鞘翅目的杀昆虫活性。因此，可以生产转化的份菌林，其可用于抗击广 谱的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫害虫，或者用于抗击另外的鳞翅目昆虫害虫。
用掺入适当克隆载体中的本发明全部或部分/5X户基因转化细菌例如假单 胞菌属(/^e"rfo附o"fl51)、农杆菌属(々ra6""m'"附)、杆菌属(5fl"7/ws)或埃希 氏菌属(E^^rZc/^Vz)的细菌，可用常规方式进行，使用例如在Mahillon等 (1989 )和在PCT专利文献WO卯/06999中所述的常规电穿孔技术。
包含本发明/5Z尸基因的转化杆菌属菌林可以用常规方法(Dulmage， 1981; Bernhard和Utz，1993)发酵，来提供高产量的细胞。在合适的生长 条件下，这些菌林可以产生高产量的ISLP蛋白质。
在其中能够表达/^丄尸基因的可选的合适的宿主微生物有真菌、藻类或 病毒，特别是植物侵占物种(如(内)共生体)或害虫如昆虫害虫的病原 体。
杀昆虫的特别是抗鳞翅目的本发明组合物可以使用以/S丄户基因转化 的微生物、或ISLP蛋白质、或杀昆虫有效ISLP部分作为活性成分加以合适 的载剂、稀释剂、乳化剂和/或分歉剂通过常规方式配制(例如，如Bernhard 和Utz所述，1993)。这类杀昆虫组合物可以配制为可湿性散剂、丸剂、颗 粒剂或尘剂或者作为以水性或非水性溶剂配成的液体^f象泡沫剂、凝胶剂、 混悬剂、浓缩剂等。包含杀昆虫细菌芽孢的组合物的例子在W096/10083 中有描述。
根据本发明，控制昆虫特别是鳞翅目或鞘翅目的方法可包括施加(如 喷洒)杀昆虫量的ISLP蛋白质或包含本发明ISLP蛋白质或包含以本发明 /S丄P基因转化的宿主细胞的组合物到欲保护的地点(区域)。要保护的地 点可包括例如昆虫害虫的栖息地或生长植被(如应用到树叶)或待生长植 被的区域(如应用到土壤或水源)。在一实施方案中，依据本发明的组合物包括杀昆虫量的至少一种本发明的ISLP蛋白质，其可以由细菌宿主产 生。此类组合物可以被应用于叶子、土壤或种皮。
本文使用的术语"接触"指"与…进行物理接触"。用杀昆虫蛋白质 接触植物意思是使杀昆虫蛋白质接触植物细胞，或者在内部(例如通过在 植物中表达)或者在外部(例如通过外部施加包含杀虫蛋白质的组合物于 植物)。可以理解，该术语不指示接触时间长度，而是包含任何时间单位 的接触。当提及包括用本发明杀昆虫蛋白质接触植物(或其细胞或組织) 的保护所述植物抵抗昆虫损伤的方法时，接触可能是足够长而且足够广泛
(使用足够高量的蛋白质接触足够大量的细胞)来预防或减轻昆虫损伤。
本发明还涉及用于控制鳞翅目或鞘翅目棉花害虫或摄取棉花昆虫害虫 如棉籽象鼻虫、棉螟蛉、蚜虫或棉铃虫、棉蚜虫(/1/;/^^w矽/^)、桃蚜
(Af，s/;w^)、草盲棒、粉虱、椿象、牧草虫或绿盲蜂(Oe卵ftVwifes rf"W附)的方法。可以用本发明方法控制的具体鳞翅目棉花害虫包括，但 不局限于选自美洲棉铃虫、棉螟蛉、澳洲棉铃虫(本地螟蛉)、烟芽夜 蛾(烟草对虫)、草地夜蛾(秋粘虫)和棉红铃虫(粉红螟蛉)的那些。 控制棉花昆虫害虫的方法包括向要保护的区域或植物施加本文定义的 ISLP蛋白质。这可以通过以本发明ISLP蛋白质接触棉花植物来实现，例如 通过种植以本发明ISLP基因转化的植物如棉花植物，或喷洒含有本发明 ISLP蛋白质的组合物。本发明还涉及本发明ISLP蛋白质在抵抗鳞翅目、辨 虫或鞘翅目棉花昆虫害虫以最小化棉花植物损伤中的用途。
本发明ISLP蛋白质如ISLP1蛋白质的靶昆虫害虫还可以是墨西哥豆瓢 虫(￡^//"^"<^",/1^泡)， 一种墨西哥豆曱。这不但是北美多种豆科作物的 一种严重的害虫，还是亚洲和非洲其他作物如葫芦、茄科植物、豆类、玉 米、高粱、稻、小麦、棉花、芝麻、莴苣、大豆和扛豆的一个严重问题。 本发明还涉及控制鳞翅目或鞘翅目玉米害虫或蚜虫如玉米辨
(i Ao/m/0s&AM附附flf/^y )、麦二叉辨(iSc/j&fl/ /r&gm附/"w附)或*匕坊、才帛 铃虫、粘虫、夜蛾、茎杆钻心虫、线虫、玉米钻心虫或玉米根虫的方法。 可以通过本发明的方法来控制的具体玉米害虫可以选自美洲棉铃虫、小地老虎(黑夜蛾)、欧洲玉米螟、玉米食根虫(Z)Z"6TOft'cflspp.)和草地夜 蛾(秋粘虫)。该方法包括向要保护的区域或植物施加本文定义的ISLP蛋 白质。这可以通过以本发明ISLP蛋白质接触玉米植物来实现，例如通过种 植以本发明ISLP基因转化的玉米植物，或喷洒含有本发明ISLP蛋白质的组 合物。本发明还涉及本发明ISLP蛋白质在抵抗鳞翅目玉米昆虫害虫以最小 化玉米植物损伤中的用途。
本发明还涉及控制鳞翅目或鞘翅目稻害虫或摄取稻上的昆虫如稻叶蝉 或稻蝗、稻(黑)蝽、稻钻心虫、稻苞虫、稻夜蛾、稻粘虫、稻螟虫和稻 纵巻叶螟或蛴螬的方法。可以通过本发明的方法来控制的具体鳞翅目稻昆 虫害虫可以选自黄色螟虫(三化螟)、稻纵巻叶螟、粉色螟虫(大螟)和玉 米斑点螟(C7i/to/mWe//^)。该方法包括向要保护的区域或植物施加本文定 义的ISLP蛋白质。这可以通过以本发明ISLP蛋白质接触稻植物来实现，例 如通过种植以本发明ISLP基因转化的稻植物，或喷洒含有本发明ISLP蛋白 质的组合物。本发明还涉及本发明ISLP蛋白质在抵抗鳞翅目、椅虫或鞘翅 目稻昆虫害虫以最小化稻植物损伤中的用途。
本发明还涉及控制鳞翅目、辨虫或鞘翅目大豆害虫的方法。可以通过 本发明的方法来控制的具体大豆害虫可以选自黎豆夜蛾、大豆夜蛾、甜 茱夜蛾、黄斑粘虫(黄斑夜蛾)、美洲棉铃虫、大豆食心虫(五/ Z/iW/" fl/w"附a) 和及"c/h》/Mw'a wm。该方法包括向要保护的区域或植物施加本文定义的ISLP 蛋白质如ISLP1。这可以通过以本发明ISLP蛋白质接触大豆植物来实现， 例如通过种植以本发明ISLP基因转化的大豆植物，或喷洒含有本发明ISLP 蛋白质的组合物。本发明还涉及本发明ISLP蛋白质在抵抗鳞翅目大豆昆虫 害虫以最小化大豆植物损伤中的用途。
为获得ISLP毒素或蛋白质，可以用常规方式在适当的培养基中培养表 达ISLP蛋白质的重组宿主细胞。产生的ISLP蛋白质可以分离和纯化自裂解 的细胞或(当分泌时)来自培养基。如果蛋白质不是分泌的，细胞能够用 常规方法如酶降解、通过超声或通过使用去垢剂等来裂解。然后可以通过 标准技术例如层析、提取、电泳等来分离和纯化ISLP蛋白质。本文使用的术语"基因"意味着包含可以在细胞内被转录成RNA分子 (如mRNA)的区域("转录区")的任何DNA或RNA片段，有效连接于 合适的调控区域例如植物可表达启动子。因而基因可能包含数个有效连接 的片段如启动子、5'前导序列、编码区和含有多腺苷酸化位点的3，非翻译 序列。特定生物体(如植物物种或细菌菌林)的内源基因是天然地见于该 生物体的基因。当提及本发明ISLP DNA时，"嵌合基因"指具有不同于 天然存在的、驱动ZWJ^基因在其天然宿主细胞中表达的细菌5，和/或3，调 控序列的5，和/或3，调控序列的ISLP DNA序列。
当提及本发明ISLP基因时，术语"基因表达"意指在其中DNA编码区 有效连接于合适的调控区如启动子、被转录并翻译成蛋白质的过程。
为本发明目的，两个相关核苷酸或氨基酸序列的"序列同一性"表达
为百分数，意指在两个最佳比对的序列中具有相同的残基的位置数(xioO) 除以比较的位置数。空位，即比对中残基于一条序列中存在但不在另一条 中存在的位置，被认为是具有不同残基的位置(对于不同长度的序列，大 小等于最短序列的大小，例如在比对ISLP片段和全长S层蛋白质的情况下， 比较相对于S层蛋白质中相同大小的对应部分)。为本发明目的要计算两 个序列间的序列同一性，可以使用GAP程序，它使用Needleman和Wunsch 算法(1970 )并由威斯康星包(第10,2版，遗传学计算机组(GCG)， 575 Science Drive,麦迪逊，威斯康星53711，美国)提供。使用的GAP参数为 空位建立罚分=50 (核苷酸)/8 (氨基酸)，空位延伸罚分=3 (核苷 酸)/ 2 (氨基酸)，并且评分矩阵为"nwsgapdna"(核苷酸)或"blosum62" (氨基酸)。GAP使用Needleman和Wunsch全球比对算法来在其整个长度 上比对两个序列，最大化匹配的数目并最小化空位的数目。缺省的参数为 空位建立罚分=50 (核苷酸)/8 (蛋白质)和空位延伸罚分=3 (核苷酸) /2 (蛋白质)。对于核酸，使用的缺省的评分矩阵是"nwsgapdna"，而 对于蛋白质缺省的评分矩阵是"blosum62" ( Henikoff & Henikoff， 1992)。 类似的，序列相似性百分数可以在这类比对中用标准软件获得，它不仅显 示相同残基的百分数还包括不同但具有相似性质(例如本文定义的对于蛋白质比对中保守氨基酸的差异)的残基。适用于确定序列同一性百分数和
序列相似性百分数的算法的例子是BLAST和BLAST 2.0算法，在Altschul 等(1977)和Altschul等(1990)中有描述。
本发明的这些和/或其他实施方案在权利要求书中有所反映，权利要求 书构成本发明说明书的一部分。
序列表说明
下述实施例举例说明了本发明，并不是提供来限制本发明或要求保护 的范围的。在实施例、权利要求书和说明书中提及的序列如下所述 SEQIDNO: 1: &// 7基因的DNA编码序列和氨基酸序列 SEQIDNO: 2: ISLP1蛋白质的氨基酸序列 SEQIDNO: 3: PCR引物ISLPlXder SEQIDNO: 4: PCR引物ISLPlXrev SEQIDNO: 5: PCR引物BSLX-1 SEQIDNO: 6: PCR引物BSLX-4 SEQIDNO: 7: PCR引物BSLX-3 SEQIDNO: 8: PCR引物BSLX-2 SEQIDNO: 9: PCR引物BSLN-5 SEQIDNO:10: PCR引物BSLN-6 SEQIDNO:ll: PCR引物BSLP-8 SEQIDNO:12: PCR引物BSLP画7 SEQIDNO:13: PCR引物EAGB-4
SEQIDNO: 14:分离的成熟ISLPl蛋白质N-末端的氨基酸序列 SEQ ID NO: 15: ISLPl蛋白质N-末端大约50 kDa胰蛋白酶片段的氨基 酸序列
除非在实施例中另外规定，所有重组DNA技术按照标准方法进行，见 述于Sambrook和Russell U001)《分子克隆实验室指南》第三版，冷泉港实验室出版社，纽约；Ausubel等(1994 )《现代分子生物学通用方法》 第l、 2巻，美国及Brown (1998 ) Mo/"w/"r BiW( g);Zfl6Fflx第二版，巻I、 II, Academic Press (UK)。用于植物分子操作的标准材料和方法见述于 R.D.D. Croy的尸/fl"ZAfo/""/"r5/ofo^Ia6/ax ( 1993)，由BIOS Scientific Publications Ltd ( UK)与Blackwell Scientific Publications, UK联合出版。
(1995)《户C7 f/浙.'义^^皇措/^》，冷泉港实验室出版社和McPherson 等(2000 )尸C/ 匿5fls/a.. Fra附fiflc&ramii/ to Sewc/i,第一版，德国施普 林格出版社中找到。
应该了解前述的仅仅是本发明具体实施方案的详细描述，并且对于公 布的实施方案的众多改动可以根据本文的公开来进行而不悖离本发明的精 神或范围。因此前面的描述不意味着限制本发明的范围。更准确的是，本 发明的范围只由附加的权利要求书和其等同物来决定。
实施例 辨橫才法
细菌菌林苏云金芽孢杆菌(Bt)通过醋酸选择法(Travers等，1987) 分离自死昆虫(墨西哥豆瓢虫)样品。在均质化和分离Bt菌林之前，墨西 哥豆胍虫死尸以1%次氯酸钠和灭菌水洗涤两次。
生物测定使用叶浸技术用芽孢/晶体悬液进行抗墨西哥豆瓢虫的生 物测定。茱豆(/^"M( /wsvw/gaWs)植物的叶子浸泡在毒素稀释液中，然后使 之干燥。每个处理的叶子用一龄的五只幼虫测试不同的蛋白质浓度。每个 浓度进行四次重复。6天后确定死亡率和叶子的损伤。如前所述(Bravo等， 1998 )在人工食料中进行抗烟草天蛾(Af做卤oi ^x似)或草地夜蛾一龄幼虫 的生物测定。如lbarra等(2003)所述在100ml水中进行抗埃及伊蚊(j^fes fl^^pri)幼虫的生物测定。
纯化ISLP1菌林中存在的晶体包涵体ISLP1菌林在含固体营养肉 汤芽孢形成培养基(Lereclus等，1995)的皮氏培养皿中生长。芽孢/晶体混合物收集于5 ml灭菌水中，在IO，OOO rpm离心10分钟，回收上清并丟弃 只含芽孢的沉淀。为从上清中去除所有芽孢，重复此步骤5次。最后晶体包 涵体通过在19，000 rpm离心30分4中回收。晶体蛋白质溶解于pH 10.5的50 mM Na2C03 、 0.2%卩-巯基乙醇中并通过在Q-seph arose柱FPLC Pharmacia (Q-琼脂糖柱快速液相色谱，法玛西亚)阴离子交换层析来纯化 (Hill, 1983 )。
N-末端测序在7% SDS-PAGE电泳并如厂商指示在半干式转膜室中 将其转移至聚偏二乙烯二氟膜(马萨诸塞州贝德福德密理博公司Millipore Co.， Bedford, MA)上后，ISLP1菌林产生蛋白质的N端测序在美国马萨 诸塞州剑桥市哈佛大学的哈佛大学微量化学研究室(Harvard Microchemistry Facility)进行。还对利用HPLC分子篩层析(Gtiereca和 Bravo, 1999)纯化的ISLP1晶体蛋白质的胰蛋白酶片段的N端序列进行了 分析。
免疫兔子通过皮下注射以ISLP1蛋白质免疫新西兰白兔。溶于PBS 中的l毫克ISLP1蛋白质以弗氏完全佐剂乳化后注射在兔子背部的五个位 点。兔子以用不完全佐剂混合的1毫克ISLP1蛋白质加强免疫3次，每次间 隔15天。在首次免疫后40天分离血液样品。
确定ISLP1基因的DNA序列基于ISLP1蛋白质的N端序列，设计了 扩增1536 bp PCR产物的两个PCR引物，ISLPlXder (ACGCTCTAGATAGCAGGTAAATCATTCCCAGACG， SEQ ID NO. 3) 和ISLPlXrev (ACGCTCTAGATCGCCGTATTGGTCAGTTGTTAC， SEQ ID NO. 4)。通过标准技术(Sambrook等，1989 )用尸/" DNA聚合酶 (Stratagene La Jolla， CA,因为其高保真性)进行了PCR反应。总DNA 提取自ISLP1菌林(Msadek等，1990)并用作所有PCR反应的模板。PCR 产物用来做Blast分析，并得到了两个S层基因相关序列(登录号u38842和 x99724)。比对这些序列证明了它们具有相似的5，和3，末端。从这些S层基 因的5，和3，末端及从ISLP1扩增片段的内部序列设计了 4条PCR引物。引物 BSLX-1 (GCTCTAGATGAGAGTGCTTTATAGGAAAAT, SEQ ID NO:5)和BSLX-4 (GCTCTAGATCTTCAGCCGGAGCGTATGTACC， SEQ ID NO:6)扩增553bp的5，端片段，而引物BSLX画3
(GCTCTAGATACTGCTGAGGCTGCTGGTGAGG， SEQ ID NO: 7 )和 BSLX-2 ( GCTCTAGATCCTCGACCTGCTTCACTATCA， SEQ ID NO: 8)扩增1372 bp的3，片段。每个PCR片段用WW (美国马萨诸塞州贝弗 利纽英伦生物技术公司New England BioLabs， Beverly, MA )消化，并克 隆进事先经X6"i消化的pBluescript SK ( Stratagene， La Jolla， CA )。连 接产物通过酚/氯仿提取纯化、乙醇沉淀并电转化到TGl大肠杆菌电感受态 细胞(Leredus等，1989 )。转化子克隆生长在补加有氨节青霉素(100 ng/ml) 的LB琼脂平板上，菌落与甘油(20%)混合并储存在-70。C。这些质粒命 名为ISLP1-SL1 、 ISLP1-SL2和ISLP1-SL3 ，并对它们的插入DNA用自动 DNA测序装置进行了测序。
在苏云金芽孢杆菌中克隆和表达ISLP1蛋白质完整的Wpl基因 通过克隆三个PCR片段到质粒pHT315 (Lereclus等，1989)中重构。第一 个PCR产物包含启动子区域，用引物BSLX-1和BSLN-5
(TCTTTGCCATGGTATAAATTTCCTCCTTC， SEQ ID NO: 9 )得到。 引物BSLX-1在5，端具有多出的IO bp,包含AT6W限制性位点，而引物 BSLN-5具有内部的7Vo^限制性位点。第二个PCR片段用含有内部7V"/限 制性位点的引物BSLN画6 ( TTATACCATGGCAAAGACTAACTCTTAC， SEQ ID NO: 10)和包括&// /基因的独特A"限制性位点的引物BSLP-8
(AAAACTGCAGAAGTACCGTCAGCACTTGCTTC， SEQ ID NO: 11 ) 获得。最后，笫三个PCR片段用也是用包括独特A"限制性位点的引物 BSLP-7 ( AACGCTGCAGTTGTAACACTTGGTGGTAAAG, SEQ ID NO: 12 )和类似于BSLX-2但在5，端具有包含Bfl附fl7限制性位点的多余8 bp的引 物EAGB画4 ( CGGGATCCTCCTCGACCTGCGTCACTATCA， SEQ ID NO:13)扩增。纯化每个PCR产物并用相应的限制性酶消化，并分别亚克 隆到pBluescript KS。纯化这些质粒中包含的DNA片段、连接并插入至事 先以JVT6"/和5fl/iifl/消化的质粒pHT315中。连接反应的产物直接转化到由Didier Lereclus博士 (法国巴斯德研究所Pasteur Institute, France )友情 提供的晶体缺陷型(acrystalliferous )苏云金芽孢杆菌菌株407 ( Lereclus 等，1989)中，并在30'C生长于补加7.5ng/ml红霉素的LB中。产生的质粒 命名为pHT-ISLPl。包含pHT-ISLPl的Bt菌林生长在含补加了红霉素的固 体HCT培养基的皮氏平板中。芽孢/晶体混合物收集于2 ml灭菌水并用于 Western印迹试验。如厂家所述，用抗SL-ISLP1多克隆抗体(1/10,000; 1 小时)进行检测，并用偶联有辣根过氧化物酶(HR )的山羊抗兔抗体(Sigma, St. Louis, MO ) (1/7,500; l小时)继以SuperSignal化学发光底物(Pierce, Rockford，Il)来显现。
S层蛋白质的化学提取 ISLP1菌林即含pHT-ISLPl的Bt菌株及晶体缺陷型的Bt菌抹407生长 于BHI (Difco)肉汤培养基中至600 nm O.D.值达0.9，以获得全部为旺 盛生长的细胞。通过离心(10,000 rpml0分钟)来沉淀细月包。如Luckevich 和Beveridge ( 1989 )所述洗涂沉淀，并重悬于初始体积的1/50的1、 1.5 或2M盐酸胍(pH2.5)中，来特异性地提取细胞表面锚定的蛋白质。样 品在IO，OOO rpm离心10分4中，含细菌细月包的沉淀和含提取蛋白质的上清4妄 着通过加入三氯乙酸(TCA)到终浓度10% (20分钟，-20°C )来沉淀， 在IO，OOO rpm离心10分钟，以水洗涂两次并悬浮于0.03 N NaOH。 力口入等 体积的Laemmli2x样品上样緩冲液。样品煮沸5分钟，并上样于两块10%
SDS-PAGE胶。 一块胶以考马斯亮蓝染色，而另一块重复的胶电转至聚偏 二乙烯二氟(PVDF) Immobilon(止动剂)膜(安玛西亚生物技术公司 Amersham Biosciences )上，如上所述使用抗SL-ISLP1多克隆抗体来进行 Western印迹检测。
赵
分离对墨西哥豆瓢虫有活性的Bt菌林在墨西哥从墨西哥豆瓢虫死 尸上分离的四个Bt菌林被用于抗墨西哥豆瓢虫幼虫(鞘翅目瓢虫科(Coccinellidae))的毒性测定。这些菌株非常相似，因为它们全都生产 相似的由100 kDa蛋白质构成的晶体，并具有相同的总蛋白质模式。当以 100和IOOO ng/cn^进行测试时，四林菌显示了对于墨西哥豆孤虫幼虫 100%的致死率。我们选择了这些菌株中的一个，命名为ISLP1，并如材料 和方法中所述，通过连续的离心继以阴离子交换层析来纯化晶体包涵体。 用此菌林的芽孢/晶体混合物进行的抗墨西哥豆瓢虫幼虫的生物测试显示 16ng/cii^的致死浓度(LC5。 ) ( 7-25的95%置信限度)，发现使用纯晶体 蛋白质的LC邻为8.6 ng/cm2 ( 4-14的95%置信限度)。纯晶体或芽孢/晶 体混合物(高达IO,OOO ng/cm2)对于鳞翅目昆虫烟草天蛾或草地夜蛾的一 龄幼虫不显示毒性，且对于双翅目()埃及伊蚊的四龄幼虫未发现 毒性。
通过寸吏用通用的和特异于<formula>formula see original document page 37</formula>c/j9 、 cfj/7 、 cfj/J 、 cfjW和O，"爿基因的引物的PCR反应来表征 ISLP1菌林(Bravo等，1998; Ceron等，1994; Ceron等,1995)，所有 PCR反应均为阴性。然后使用Aguino de Muro和Priest ( Aguino de Muro 和Priest, 1993 )设计的引物扩增了ISLP1菌林的16S RNAr基因，该16S DNA序列的Blast分析证实了该ISLP1菌林属于苏云金芽孢杆菌类。
表征在晶体包涵体中发现的ISLP1蛋白质 ISLP1菌林产生的100 kDa蛋白质通过阴离子交换层析纯化后，转膜到 Immobilon PSQ，并得到了蛋白质的氨基端序列。此氨基酸序列 (AGKSFPDVPAGH， SEQ ID NO: 14 )对应于于来自地衣芽孢杆菌OlpA (GenBank登录号U38842, Ge11Pept登录号AAC44405 )和炭疽芽孢杆菌 EA1 (GenBank登录号X99724， GenPept登录号CAA68063)的S层蛋白质 前体前导肽之后的头12个氨基酸。进行了纯ISLP1蛋白质的胰蛋白酶消化， 并通过HPLC分子篩层析纯化了约50 kDa的片段。获得的内部18个氨基酸 的序列也见于Olpl和EAl S层蛋白质KLPVTFVTTDQYGDPYGAN (SEQ ID NO: 15)。根据此蛋白质得到的两个N-末端序列设计了PCR引物(ISLPlXder和 ISLPlXrev)，并用于扩增经DNA测序的内部片段。所产生序列的Blast分 析显示与两个S层基因o/;;A和e"g ( GenBank登录号u38842和x99724 )序列 具有高分。使用此信息及这些基因的DNA序列比对，设计了新的PCR引物， 用于扩增两个其它的重叠PCR产物。 一个包括ATG密码子的上游500bp， 以含有推定的启动子，而另一个包括推定的终止密码子之后的200 bp。获 得了完整的&// /基因的序列(SEQIDNO: 1)，此序列中发现的开放阅 读框(ORF)包含2，589个核苷酸，它之前为Shine-Dalgarno序列。在终止 密码子下游的22个核苷酸处观察到回文结构。比较测序蛋白质的N-末端和 从核苷酸序列推断的氨基酸序列的N-末端，证实了此蛋白质也是合成为具 有29个氨基酸信号肽的前体多肽。切除信号序列的成熟蛋白质的N-末端在 SEQ ID NO: 2第30位氨基酸位点处。在蛋白质序列中存在3个S层同源基序 (SLH)，观察到第一个位于笫34-76位氨基酸区域，第二个位于第95-136 位氨基酸区域，而第三个在第162-198位氨基酸区域(全部为SEQ ID NO: 2 中的氨基酸位点)。
最后，如在材料和方法中所述，通过分别扩增三个在A^ /和户W/限 制性位点重叠的PCR片段，完整的&//;7基因被直接克隆进晶体缺陷型苏云 金芽孢杆菌菌林407。不可能得到含有此构建体的大肠杆菌转化子。其他作 者发现在许多情况下在大肠杆菌中克隆具有其调控区的S层基因会导致问 题(Mesnage等，2001; Sun等，2001 )。产生的表达ISLPl蛋白质的Bt 菌林通过用针对纯ISLP1蛋白质生产的多克隆抗体免疫检测蛋白质来判 断。当在IOO和IOOO ng/en^测定时，相比于转化有pHT315穿梭载体、不 表达ISLP1蛋白质、对墨西哥豆瓢虫幼虫不显示任何毒性的对照菌株，此 菌林的生孢培养物显示了对于墨西哥豆瓢虫幼虫的100%致死率。
在ISLP1菌抹中表达ISLP1 我们分析了在SP芽孢形成培养基中生长期间ISLP1蛋白质的表达。此 蛋白质表达于营养生长期和芽孢形成期。在营养生长期，该蛋白质和细菌締合，因为所有通过Western印迹检测到的蛋白质都发现在离心培养物后 获得的细菌沉淀里。然而，在芽孢形成期ISLP1蛋白质也发现在离心培养 物的上清中。
Luckevich和Beveridge (1989 )描述了用于苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种S 层蛋白质的特异性提取方法。我们使用此方法来检测是否ISLP1具有结合 来自初始菌林和转化菌林的细胞表面的能力。在低pH条件下用2 M离液 剂处理营养生长期细胞，导致SL-ISLP1蛋白质的特异性提取，这通过 SDS-PAGE和Western印迹分析提取蛋白质可以判断。SL-ISLP1蛋白质只 存在于ISLPl菌林和Bt转化子菌林中，此蛋白质在407晶体缺陷型菌林中没 有。与Luckevich和Beveridge (1989)报道类似的是，只有用2M离液剂处 理才能提取该ISLP1蛋白质，用低些浓度的离液剂(l-1.5M)不能从细菌 细胞中提取该蛋白质。
也在其它Bt菌林如Bt库斯塔克(A:wrato/t/)亚种HDl和HD73、 Bt以色列 (&raW"s的亚种HD567、 Bt鮎泽(似'z"nW)亚种HD137、 Bt多窝(to/ww幼/)亚 种HD125、 Bt莫里逊(附M他卵/)拟步行甲(&wWW柳&)亚种中进行了此蛋白 质的Western印迹检测，显示此蛋白质并不产生于这些菌株。使用引物 ISLPlXder和ISLPlXrev来PCR分析这些菌林也证实了这些Bt菌林不含 ISLP1编码序列。
ISLP1蛋白质(SEQ ID NO: 2)与来自炭疽芽孢杆菌的EA1 S层蛋白 质(对于包括信号肽的蛋白质有92%的序列同一性)及在苏云金芽孢杆菌 中报道的CTC2蛋白质(对于包括信号肽的蛋白质有89。/。的序列同一性) 具有高度的序列同一性。ISLP1蛋白质与另一炭疽芽孢杆菌S层蛋白质 SAP的氨基酸序列同源性只有32 %。参考文献Aguino de Muro和Priest. (1993) FEMS Microbiol Lett. 112: 205-210.Altschul等(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402.Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410.An等(1996) Plant J. 10， 107.Aoyama和Chua (1997) Plant Journal 11:605-612Ausubel等 (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols,巻1和2，USA.Bennetzen & Hall (1982) J. Biol. Chem. 257， 3026-3031 Bendtsen等(2004) J. Mol. Biol" 340:783-795.Bernhard， K.和Utz， R. (1993) "Production of Bacillus thuringiensis insecticides for experimental and commercial uses", In Bacillus thuringiensis, An Environmental Biopesticide: Theory and Practice, 255-267页，编辑Entwistle, P.F.， Cory， J.S.， Bailey， M.J.和Higgs， S.， John Wiley and Sons, New York.Beveridge等(1997) FEMS Microbiol Rev 20: 99-149Bih等(1999)， J. Biol. Chem. 274， 22884-22894.Bravo等(1998) Appl. Environm. 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权利要求
1.分离的杀虫蛋白质，其特征在于a)对于一些害虫具有特异性杀虫活性，而对于其它害虫没有，且b)与细菌S层蛋白质具有至少50％的序列同一性。
2. 权利要求l的蛋白质，其特征在于a) 对于一些昆虫具有特异性杀昆虫活性，而对于其它昆虫没有，b) 与细菌S层蛋白质具有至少70。/。的序列同一性，c) 大约50到大约U0kDa的分子量。
3. 权利要求l的蛋白质，其与SEQIDNO: 2的蛋白质或其毒性片段具 有至少50%的序列同一性，并且其分子量为大约50到大约120kDa。
4. 权利要求2的蛋白质，其与SEQIDNO:2的蛋白质或其毒性片段具 有至少50%的序列同一性，并且其分子量为大约50到大约120kDa。
5. 权利要求4的蛋白质，包含SEQIDNO:2中始于第l位氨基酸和笫31 位氨基酸之间的氨基酸止于第863位氨基酸的氨基酸序列。
6. 权利要求4的蛋白质，包含SEQ ID NO: 2中始于第1位氨基酸和笫 531位氨基酸之间的氨基酸止于第863位氨基酸的氨基酸序列。
7. 权利要求4的蛋白质，包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
8. 分离的DNA，编码权利要求1到7中任一项的蛋白质。
9. 嵌合基因，包含a) 包含权利要求8的DNA的编码序列，及b) 允许在植物细胞中表达的启动子。
10. 权利要求9的嵌合基因，其中所述编码序列是经优化的合成DNA 序列，以便在宿主植物中进行表达。
11. 权利要求10的嵌合基因，其中所述宿主植物选自玉米、棉花、大 豆、稻、油菜、花椰菜和甘蓝。
12. 植物转化载体，包含权利要求9到11中任一项的嵌合基因。
13. 转基因植物、种子或植物细胞，包含权利要求9到11中任一项的嵌合基因。
14.权利要求13的植物、种子或细胞，其中所述植物选自玉米、棉花、 大豆、稻、油菜、花椰菜和甘蓝。
15. 保护植物抵抗由以所述植物所属的植物物种为食的植物害虫如昆虫害虫导致的损伤的方法，包括在所述植物的细胞中表达权利要求9到11 中任一项的嵌合基因的步骤。
16. 保护植物抵抗由以所述植物所属的植物物种为食的植物害虫如昆虫害虫导致的损伤的方法，包括以权利要求9到11中任一项的嵌合基因转化植物细胞，将所述细胞再生为植物，和获得含有所述嵌合基因的所述植物 的后代和繁殖材料如种子的步骤。
17. 杀死害虫的方法，包括用权利要求1到7中任一项的蛋白质接触所 述害虫。
18. 权利要求17的方法，其中所述害虫是昆虫害虫。
19. 权利要求8的DNA在控制或杀死害虫如昆虫害虫中的用途。
20. 权利要求9到11中任一项的嵌合基因在控制或杀死害虫如昆虫害 虫中的用途。
21. 权利要求1到7中任一项的蛋白质在控制或杀死害虫如昆虫害虫中 的用途。
22. 保护田间植物免受害虫如昆虫损伤的方法，包括或者以包含权 利要求l到7中任一项的蛋白质的杀虫组合物的形式，或者以表达所述蛋白 质的重组生物体的形式，对田间植物应用权利要求l到7中任一项的蛋白质。
23. 权利要求21的方法，其中所述重组生物体是表达权利要求1到7中 任一项的蛋白质的转基因植物。
全文摘要
本发明提供了类似S层蛋白质的杀虫特别是杀昆虫蛋白质，还有其变体或突变体及编码它们的DNA。还提供了使用所述DNA或蛋白质用于控制害虫特别是植物昆虫害虫的方法和手段。
文档编号C12N15/82GK101300268SQ200680032864
公开日2008年11月5日 申请日期2006年7月4日 优先权日2005年7月8日
发明者A·布拉沃-德-拉-帕拉, M·索贝隆恰维斯 申请人:墨西哥国立自治大学