专利名称：：用于真菌厚垣孢普克尼亚的厚垣孢子生产的液体培养基的制作方法
技术领域：
：本发明涉及在液体培养生产真菌厚垣孢普克尼亚(;oc/zo"/acWawj^os;on'a)的厚垣孢子。也涉及这些液体培养基的营养素和组分。这些培养基可以是完全合成的，而且通过连续添加单个纯营养素而组成，或它们可能是复杂混合物，其通过从生物产品中提取而得到，所述生物产品具有生产真菌厚垣孢普克尼亚的厚垣孢子的能力。本发明还涉及液体培养基的组分以生产大于104个厚垣孢子/1111培养基。
背景技术：
：目前，正如10BC/OILB研究手册(Kerry&Bourne,2002)所详细描述，真菌厚垣孢普克尼亚的厚垣孢子仅能够使用固体培养基而生产。用于实验室中，可以使用琼脂培养基生产厚垣孢子，例如，最常用(Keny&Bourne,2002)的CMA(玉米粉琼脂)。厚垣孢子的大量生产常基于从谷类得到的固体培养基，尤其是大麦、玉米(Kerry&Bourne,2002)或大米(Atkins"a/.,2003)。它可以使用全谷物、破碎谷物或经研磨的谷物，单独地或与惰性原料相混合以提高培养基的物理特性。使用液体培养基生产厚垣孢子不是不可行就是根据使用的培养基的产量非常小(小于103个厚垣孢子/1111培养基)。还没有公开的专利涉及用真菌厚垣孢普克尼亚且使用液体培养基而生产厚垣孢子。目前，没有可知的能够大量(大于10S个厚垣孢子/ml培养基)生产真菌厚垣孢普克尼亚的厚垣孢子液体培养基(Liu,X.Z.&Chen,S.Y.,2003;Mo，M."a/.，2005)
发明内容本发明要解决的主要问题是解决之前在液体培养基生产厚垣孢子的不可能性。本发明的特征在于提供了使真菌厚垣孢普克尼亚生长的液体培养基的组分，用以在浸入式液体培养中生产厚垣孢子，该培养基通过纯底物的混合得到，或动物源或植物源的复合产物的混合而得到，其中组分内包括蛋白质、脂类和矿物盐。关于上述问题，在本发明前是有液体培养基系统大量生产真菌厚垣孢普克尼亚，从而大量生产厚垣孢子(大于1(^个厚垣孢子/ml培养基)是不可能的。本发明的特征在于提供了适于大量生产厚垣孢子的液体培养基的组分，而且提供了适于生产大于1(^个厚垣孢子/ml培养基的培养基的组分。具体实施方式已发展的液体培养基用作微囊生长的底物，而且跟随真菌厚垣孢普克尼亚的厚垣孢子(砖格厚垣孢子或粉末孢子类型的分生孢子)的浸入式生产。培养基的成分用蒸馏水混合，其中的大部分是固体的，尽管它们有些具有液体或固体的天然形态。依据使用的底物类型，这些成分形成水溶液、乳浊液或悬浮液，而且最终混合物是一种复合乳浊液，其中两性和极性的底物包裹了那些具有很小极性的成分。然而，通过这种方式形成的培养基产出稳定的混合物，在室温和常压下(10-25"C而且接近1个大气压)通常具有很小的浑浊度。所有的培养基在接种厚垣孢普克尼亚前都需要灭菌。这很重要，因为这些培养基营养丰富而且因此支持大量不同种类的，即那些污染培养基成分的生物体生长。是培养基最终组分的一部分的底物的种类包括球蛋白、磷脂、甘油三酸脂、可溶性糖和矿物盐。下面描述进入培养基组分的底物及其足量的浓度球蛋白白蛋白和/或酪蛋白禾口/或球蛋白一0.05g/l-500g/l;磷脂磷脂酰胆碱和/或磷脂酰乙醇胺和/或其它磷脂的复合混合物，如卵磷脂一0.05g/l-100g/l;甘油三酸脂向日葵油或任一其它的植物油一0g/l-100g/l;可溶性糖蔗糖和/或其它二糖和/或葡萄糖和/或其它单糖和/或其它可溶性糖一0g/l-50g/l;矿物盐a)韩0画25mM;b)氯0-25mM;c)钠0-50mM;d)镁0-25mM;e)硫酸盐0-25mM;f)钾0-50mM;g)磷酸盐0-25mM;h)铁0-5mM;h)硝酸盐0-50mM。生产大于10s个厚垣孢子/ml培养基的液体培养基的实例如下所述白蛋白或酪蛋白一lg/1磷脂酰胆碱或卵磷脂一lg/1向日葵油一1g/1氯化钠(NaCl)—0.4g/1七水硫酸镁(MgS047H20)一0.5g/1磷酸氢二钾(KH2S04)—lg/1氢氧化钠(NaOH)—0.2g/1硫酸钾(K2S04)—0.6g/1硫酸铁(FeS047H20)—0.02g/1只要上述成分根据特定的最低含量而进入了它们的组分，所述培养基可包含复合混合物，如植物源或动物源的产物。植物源的产物实例为自谷类、富蛋白质谷物、富油类谷物、或其它植物的提取物或悬浮液，所述其它植物如玉米、小麦、燕麦、大麦、大米、豆类、豌豆、蚕豆禾口大豆。动物源的产物实例为自任一动物的蛋或奶的产物，它们的副产物，或其它任一动物源的产物混合物。应用实例实验室内，真菌厚垣孢普克尼亚的厚垣孢子菌株PcMR(参见国际专利请求WO2005121314)生产和发展。A-命名AL的培养基的使用(白蛋白+卵磷脂培养基)表1-种类A的盐混合物的组分种类A的盐混合物的组分<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>使用的AL培养基的组分(g/1):3.25g白蛋白(鸡蛋，II型，Sigma-Aldrich)+^大豆卵磷脂+5.32经种类A的盐混合物(表1)用AL培养基的方法和结果所述结果是用250ml三角烧瓶内培养而获得的，其中每个含100ml的AL培养基，接种lml的10天PcMR培养生成物，所述PcMR在25°C，察氏培养基内(表2)培养，且在其中没有产出厚垣孢子。表2-察氏培养基组分察氏培养基组分(g/1)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在25。C静态培养30天，每天摇一次。结果(表3)表示了在实验室内为实验室目的而生产厚垣孢子的AL培养基的生产率。表3-用AL培养基的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>B-使用名为OS(蛋+糖培养基)的培养基使用的OS培养基的组分(g/1):106g鸡蛋(蛋白+蛋黄)+3(^蔗糖。用AL培养基的方法和结果所述结果是用250ml三角烧瓶内培养而获得的，其中每个含100ml的OS培养基，接种lml的10天PcMR培养生成物，所述PcMR在25。C，察氏培养基内(表2)培养，且在其中没有产出厚垣孢子。在25t:静态培养30天，每天摇一次。结果(表4)表示了为实验室或工业生产目的而生产厚垣孢子的OS培养基的生产率。表4_用OS培养基的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>工业实用性器内进行浸入式液体培养，而且通过使用具有工业用途的厚垣孢普克尼亚菌株，即选择的用于对线虫根癌(root-knotnematodes)(根结线虫属-Me/ozWogy"e)进行生物控制的菌株，这些培养基能够用于真菌厚垣孢普克尼亚的厚垣孢子的大量生产。一个用于从液体悬浮液提取固体颗粒的提取方法(参加国际专利请求WO2005115584)，可以补充该大量生产厚垣孢子的技术，以大量生产随后可用于生物控制应用的厚垣孢子。参考文献Atkins,SimonD.，Hidalge-Diaz,Leopoldo,Clark,IanM.Morton,C.Oliver,Oca,NivianMontesde，Gray,Paul.A.andKerry,Brian.R.(2003);Approachesformonitoringthereleaseof尸oc/zom'ac/z/am>^w/on-(3var.catenulate，abiocontrolagentofroot-knotnematodes;A^/co/ogyWeyearc/z;107(2):206-212.Liu,XingzhongZ.andChen,SenyuY.(2003);NutritionalrequirementsofPochoniachlamydosporiaandARF18;fungalparasitesifnematodeeggs;Jc憩/q/7"ve/^e6na^erec/mo/ogy;83:10-15.Kerry,B.R.andBourne,J.M.(ed.)(2002)AmanualforresearchonFer"c/〃/w附c/z/awt/as^oWww,aPotentialBiologicalControlAgentforRoot-KnotNematodes.IOBC/WPRS,Gent,Belgium,84pp.Mo,MingHe,Xu，Ch腿KunandZhang,KeQin(2005》EffectsofCarbonandNitrogensources,carbon-to-nitrogenratio,andinitialpHonthegrowthofnematophagousfungus尸oc/zom'ac/z/a，(ic^o".(3inliquidculture;j^fycopa/^o/og/a'.159:381-387.权利要求1、使真菌厚垣孢普克尼亚在培养中生长的液体培养基，其特征在于所述培养基起动了粉末孢子类型的分生孢子、或特定的砖格厚垣孢子、或单纯的厚垣孢子的生产，从而获得厚垣孢子的产量大于104个厚垣孢子/ml，而且所述培养基的组分中含有大于0.05g/l的蛋白质和大于0.05g/l的脂质。2、根据权利要求1所述的使真菌厚垣孢普克尼亚在培养中生长的液体培养基，其特征在于所述培养基含有大于0.05g/l的蛋白质，其优选含量为lg/1-100g/l。3、根据权利要求1或2所述的使真菌厚垣孢普克尼亚在培养中生长的液体培养基，其特征在于所述培养基含有任一类型蛋白质，优选为从任一生物体提取的球蛋白，如白蛋白、酪蛋白、或具有相似结构和接近于球体的最终形状的其它蛋白。4、根据权利要求1所述的使真菌厚垣孢普克尼亚在培养中生长的液体培养基，其特征在于所述培养基含有大于0.05g/l的脂质，其优选含量为lg/l-100g/1。5、根据权利要求1或4所述的使真菌厚垣孢普克尼亚在培养中生长的液体培养基，其特征在于所述培养基含有任一类型脂质，优选为从任一生物体提取的磷脂、或甘油三酸脂、或两种的混合物。6、根据权利要求1、4或5所述的使真菌厚垣孢普克尼亚在培养中生长的液体培养基，其特征在于所述培养基含有磷脂，优选为磷脂酰胆碱、或磷脂酰乙醇胺、或包括这样或那样磷脂的磷脂混合物、以及其它磷脂。7、根据权利要求1、4或5所述的使真菌厚垣孢普克尼亚在培养中生长的液体培养基，其特征在于所述培养基含有甘油三酸脂，优选其富含脂肪酸，如油酸、亚油酸、棕榈油酸和硬脂酸，然而也可以包括能够加入至液体培养基的其它脂肪酸。8、根据权利要求1所述的使真菌厚垣孢普克尼亚在培养中生长的液体培养基，其特征在于所述培养基含有矿物盐，优选具有下述的种类和浓度a),丐0陽25mM;b)氯0-25mM;c)钠0-50mM;d)镁0-25mM;e)硫酸盐0-25mM;f)钾0-50mM;g)磷酸盐0-25mM;h)铁0-5mM;h)硝酸盐0-50mM。9、根据权利要求1所述的使真菌厚垣孢普克尼亚在培养中生长的液体培养基，其特征在于所述培养基能够使得厚垣孢子的产量达到1(^个厚垣孢子/ml，而且所述培养基组分中含有碳水化合物、矿物盐、蛋白质和脂质。10、根据权利要求1或9所述的使真菌厚垣孢普克尼亚在培养中生长的液体培养基，其特征在于所述培养基组分中含有以下元素a)1g/l-50g/l碳水化合物来源，如蔗糖、葡萄糖或其它糖；b)1g/l-50g/l球蛋白来源，优选为白蛋白、酪蛋白或其它蛋白；c)0.1g/1-10g/1磷脂来源，优选为磷脂酰胆碱、卵磷脂或其它磷脂；d)0.1g/l-10g/l甘油三酸脂来源，优选其在室温下为液体且富含脂肪酸，如油酸、亚油酸、棕榈油酸和硬脂酸，然而也可以包括其它脂肪酸；e)盐类混合物，优选包括下述种类和浓度el)!丐l-25mM;e2)氯5-25mM;e3)钠5-50mM;e4)镁5-25mM;e5)硫酸盐5-25mM;e6)钾5-50mM;e7)磷酸盐5-25mM;e8)铁0.01-5mM;e9)硝酸盐0-50mM。11、根据权利要求1-10任一权利要求所述的使真菌厚垣孢普克尼亚在培养中生长的液体培养基，其特征在于所述培养基组分中含有植物源的产物，优选为自谷类种子、蛋白质种子、油类种子、或其它植物种子的提取物或悬浮液，所述其它植物种子如玉米、小麦、燕麦、大麦、大米、豆类、豌豆、蚕豆和大豆。12、根据权利要求1-10任一权利要求所述的使真菌厚垣孢普克尼亚在培养中生长的液体培养基，其特征在于所述培养基组分中含有动物源的产物，优选起源自任一动物的蛋或奶、它们的副产物，或其它任一动物源的产物混合物。全文摘要本发明涉及使真菌厚垣孢普克尼亚在培养中生长的液体培养基，所述培养基用于起动粉末孢子类型的分生孢子、或所命名的厚垣孢子的生产。所述培养基使得发酵过程易于操作，获得了大于10<sup>6</sup>个厚垣孢子/ml的产量。所述厚垣孢子能够随后通过过滤和在液体悬浮液中分离固体颗粒而被简单地提取。无论是在小试规模还是在商业规模，这些厚垣孢子可以大量被收集，而且通过食线虫真菌厚垣孢普克尼亚(P.chlamydosporia)，而被用作对根结线虫属(Meloidgynespp.)进行生物控制的产品。文档编号C12N1/14GK101263221SQ200680032851公开日2008年9月10日申请日期2006年9月13日优先权日2005年9月13日发明者卡洛斯·曼纽尔·安图内斯·佛朗哥申请人:埃武拉大学