专利名称：来自avicennia marina的用于赋予植物耐盐性的脱水素基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及单子叶或双子叶植物转化，其中该植物选自由以下组成的组中水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、烟草、番茄、豌豆、大豆、芸苔、花生、鹰嘴豆和树豆(pigeon pea)。
一个实施方案提供选自由LBA4404、EHA101和EHA105组成的组中的农杆菌菌株。
另一实施方案提供选自由叶、茎、根、胚轴和胚组成的组中的外植体。
再一实施方案提供包括如SEQ ID NO1中所示的多核苷酸序列或其片段或变体的转化植物细胞。
另一实施方案提供用与SEQ ID NO1具有至少80％相似性的多核苷酸序列转化的转基因植物，该SEQ ID NO1编码具有如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的脱水素多肽。
另一实施方案提供选自由以下组成的组中的转基因植物烟草、番茄、豌豆、大豆、芸苔、鹰嘴豆、树豆、水稻、玉米、小麦、大麦和高粱。
再一实施方案提供植物、植物部分、种子、植物细胞和其后代，其中，该植物、植物部分、种子、植物细胞或其后代包括所述重组结构。
本发明提供来自A.marina的cDNA序列(SEQ ID NO2)和由所述cDNA序列编码的蛋白。编码脱水素的基因的该核苷酸序列如SEQ ID NO1中所示，并且其是由本发明包含的示例性序列。由此基因编码的蛋白示于SEQ ID NO3中。编码DHN的序列(SEQ ID NO1)，以及从其衍生的序列，还提供可用于从其它生物体中分离基因和相关基因的探针。本发明还涉及表达所述基因的耐盐转基因植物，以及用于生产表达所述基因产物的转基因植物的方法，该方法包括从来自一个月大的经盐激发的A.marina小苗的叶的总mRNA中分离DHN cDNA，以将编码DHN的该cDNA可操作地连接至35S CaMV启动子和胭脂氨酸合成酶的方式使其在作为表达盒(pDHN1)的植物转化载体中克隆。该植物转化载体另外含有报告基因盒和抗生素筛选盒用于转基因植物的筛选。本发明还涉及农杆菌介导的植物转化方法以生产包括编码A.marina的DHN蛋白的多核苷酸序列的耐盐植物。本发明还涉及从Avicennia marina分离赋予耐盐性的独特转录物的方法，该方法包括用于增强转录物的表达的关键步骤。
本发明涉及编码来自Avicennia marina的用于赋予耐盐性的类似于推定的植物磺肽素(phytosulfokine)肽前体的新未知蛋白的核酸序列。
本发明还涉及从Avicennia marina分离赋予耐盐性的独特转录物的方法，该方法包括用于增强所述转录物表达的关键步骤。
本发明优选的实施方案涉及从Avicennia marina分离DHNcDNA。从一个月大的Avicennia marina小苗的叶组织中分离总RNA，该小苗在采摘前已用NaCl处理48小时。这些条件对于诱导DHN转录物至允许它们的克隆在cDNA文库中作为cDNA插入片段的水平来说是关键的。根据Chomczynski和Sacchi(1987)使总RNA从盐胁迫植物的叶组织分离。总mRNA还可使用本领域已知的方法提取。本发明还涉及AmDHN诱导的动力学，使一个月大的A.marina小苗在0.5X MS营养液中适应72小时，然后暴露于盐胁迫、渗透胁迫和ABA处理下。将根和叶组织分别冷冻用于总RNA分离。在实施例1中提供详细的生长条件和随后用于RNA分离的程序。
本发明还涉及使用上述分离的A.marina RNA构建cDNA文库。通过SizeSep-400离心柱将从Poly(A+)mRNA制备的cDNA按大小分离(size fractionated)并直接克隆在pSPORT1的SalI(5′)/Not I(3′)位点。本领域已知的cDNA合成方法包括使用寡(dT)引物和反转录酶，用poly(A+)RNA作为反转录模板以合成第一链cDNA。这些用于合成cDNA和在合适的载体中克隆的方法是本领域公知的。关于试验细节，见实施例2。
本发明涉及载有AmDHN cDNA作为插入片段的确定克隆的测序。使用M13/pUC18正向和反向引物用双脱氧链终止法(Sanger等，1977)确定全长cDNA的两条链的完整核酸序列。将此cDNA插入片段在Pst I(5′)/Hind III(3′)位点亚克隆入pBluescript SK载体。将此重组克隆命名为pDHN1。将在pDHN1中的插入片段测序确认。该核酸和蛋白序列如SEQ ID NO2和SEQ ID NO3中所示。
通过一步反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)从分离自暴露于0.5M NaCl胁迫12小时的A.marina的根的信使RNA(mRNA)分离完整编码区域。使用引物PC57 FWD 2(SEQ ID NO5)和PC57 REV1(SEQ ID NO6)。序列分析的方法方面在实施例3中讨论。将等量的总RNA(30μg)在1.2％MOPS-甲醛凝胶上电泳，转移至尼龙膜并通过UV交联固定。将该膜用探针杂交，结果在
图1中给出。
PC57 FWD2 5′-GCTCTAGAATGGCAGAGTACGGCGAC-3’SEQ ID NO5 PC57 REV1 5′-CCGCTCGAGTTAATGGTGGCCGCCG-3′SEQ ID NO6 在再一实施方案中，本发明涉及检查在原核系统中该AmDHN蛋白的表达。使用为方便克隆含限制性位点的基因特异引物扩增AmDHN的cDNA(SEQ ID NO2)。将该扩增片段用Xba I和Xho I双消化，并直接克隆入载体pET28a E.coli表达载体的Nhe I和Xho I位点。通过使用通用引物的自动DNA测序来确认所克隆的插入片段。实施例4给出了关于随后用于构建蛋白表达载体的方法的详细资料。通过本领域已知的方法进行蛋白提取和定量。随后，进行Western印迹。对于试验的详细资料请参见实施例5。
本发明的另一实施方案涉及在烟草(Nicotiana tobacum)cv.Wisconsin中表达A.marina脱水素。将在pBluescript SK载体中命名为AmDHN的所克隆的脱水素基因在Pst I(5′)/Hind III(3′)位点用Bam H1酶切，并连入植物转化线性化载体pCAMBIA2301中。将所得重组载体命名为pMADY1。该重组载体pMADY1具有驱动AmDHN脱水素基因(SEQ ID NO1)表达的CaMV 35S启动子。载体pMADY1的图示在图2中示出。然后，通过冻融，将此结构，pMADY1，转入Agrobacterium tumefaciens菌株EHA105中，详细内容见实施例6。
在再一实施方案中，本发明涉及使用标准程序的烟草的农杆菌介导的转化。使用含AmDHN的农杆菌菌株共培养经灭菌的烟草叶片圆盘，其也是用于烟草转化的优选方法。用于植物转化的可选择的方法可以包括其中将金或钨微粒用意欲整合入基因组的质粒包裹，并轰击进入植物组织中的基因枪法(biolistic method)。本领域技术人员熟知的其它植物转化技术包括电穿孔、显微注射、聚乙二醇法。将已生根的植物转移到土壤中并栽培直到成熟。该程序的详细内容由实施例7提供。经转化的植物通过该植物的茎、叶和根部分的β-葡萄糖苷酶(GUS)染色确认。用于GUS染色的程序参照Jefferson RA等，1987(参见实施例8)。还使用标准程序例如PCR分析和Southern杂交、同工酶分析来进行确认。
在另一实施方案中，本发明提供对应于AmDHN基因的启动子序列。含有那些元件(elements)的基因的侧翼区域通过使用cDNA作为探针筛选基因组文库而常规分离。然而，基因组文库的筛选是耗时的方法。TAIL PCR是用于基因组步移的快速而有效的方法。可以使用本领域公知的方法来分离启动子序列。使用标准TAIL-PCR程序(Liu和Whittier，1995)来分离来自A.marina的脱水素基因的启动子。为了TAIL PCR，提取总基因组DNA。设计基因特异引物并与简并引物组合使用。详细内容参见实施例9。
在近5’端设计三个基因特异嵌套引物。引物长度范围为23-26个核苷酸，并具有69℃的Tm。
所使用的该嵌套基因特异引物为 TR15’-TACGGTGGTGCCGGTGGTTCCAT-3’SEQ ID NO7 TR25’-TGGGATTGCCATACTCGTCGGTCT-3’SEQ ID NO8 TR35’-CTCTGCCATATTCTCTGAGCTTAAAG-3’SEQ ID NO 9 使用以下任意简并引物 AD15’-NGTCGASWGANAWGAA-3’SEQ ID NO10 AD25’-TGWGNAGSANCASAGA-3’SEQ ID NO11 AD35’-WGTGNAGWANCANAGA-3’SEQ ID NO12 AD45’-STTGNTASTNCTNTGC-3’ SEQ ID NO13 引物AD1、AD2、AD3和AD4分别具有以下解链温度 46℃、34℃、34℃和45℃。从750个碱基对启动子片段设计第二套嵌套基因特异引物，它们包括 PROMR15’-GGAGAGATATGACACTTGTCGA-3’SEQ IDNO14 PROMR25’-GTCGGTTGCAAGACAAGTTAAG-3’SEQ IDNO15 PROMR35’-CACCCACTATGAATGTATCATTG-3’SEQ IDNO16 一个实施方案提供使用链酶抗生物素顺磁颗粒和生物素标记的寡d(T)18引物从总RNA种群富集的来自A.marina的mRNA。与200ng生物素标记的寡d(T)引物一起，将250μg在10mM TrisCl，pH7.5；0.5M KCl(缓冲液A)中的总RNA加热至65℃，并在冰上冷却。通过用链酶抗生物素顺磁珠悬浮液(在缓冲液A中平衡)温育使生物素捕获的mRNA固定。将该磁珠用10mM Tris Cl，pH7.5；0.5M KCl洗涤，使mRNA在DEPC水中洗脱，并通过冷冻干燥浓缩。在1.2％甲醛-琼脂糖凝胶上检测洗脱的mRNA的浓度和完整性(Sambrook et al.1989)。
而本发明的再一实施方案涉及通过叶片圆盘分析法分析由在A.marina转化体中过表达DHN而赋予的耐盐性(参见实施例10)。
而本发明的再一实施方案涉及通过对整个植株进行盐胁迫处理分析由在A.marina转化体中过表达DHN而赋予的耐盐性(参见实施例10)。
尽管为理解清楚的目的已通过示图和实施例的方式详细描述了前述方面，但是在本发明的教导下，本领域普通技术人员容易由此进行某些变化和改进，而不脱离所附的权利要求精神和范围。
实施例 给出以下实施例，以向本领域普通技术人员提供如何进行和使用本发明的完整的内容和描述，并且不意欲限制发明人认为的他们的发明的范围，它们也不意欲表示以下实施例是进行的全部和仅有的试验。关于使用的附图，已努力确保精确性。
实施例1 植物生长条件和RNA提取 从其天然红树林栖息地印度的Pichavaram，Tamil Nadu收集A.marina种子。使种子在以下条件下生长在填满沙子的盘中，在37℃温室中，12小时亮/暗光周期(从6时至18时照明)，在近淹没条件下，每天浇水。
为了构建cDNA文库，使一个月大的A.marina小苗(四叶阶段)在0.5X Murashige Skoog(MS)培养基(不调整pH值)中适应72小时。随后，将该植株转移至补充有0.5M NaCl的0.5X MS培养基中48小时。
为研究AmDHN诱导的动力学，使一个月大的A.marina小苗在0.5X MS营养液中适应72小时，然后暴露于盐胁迫、渗透胁迫和ABA处理。将根和叶组织分布冷冻用于总RNA分离。
盐胁迫将植株(A.marina)用含0.5M NaCl的0.5X MS胁迫，在NaCl处理6h、12h、24h、48h，以及撤除盐后12h和24h时，冷冻叶和根组织。
渗透胁迫将植株用含800mM甘露醇的0.5X MS胁迫，在甘露醇处理12h、24h、48h，以及撤除甘露醇后12h和24h时，冷冻叶和根组织。
ABA处理将植株用含100μM ABA的0.5X MS胁迫，在ABA处理6h、12h、24h、48h，以及撤除ABA后12h和24h时，冷冻叶和根组织。
为了RT-PCR，将RNA从暴露于0.5M NaCl胁迫12小时的A.marina的根部分离。
收集叶组织并根据由Chomczynski和Sacchi，1987给出的方法分离总RNA。从集中的植株中收集叶组织，并将5g组织在液氮中浸软(macerated)，悬浮于18ml的RNA提取缓冲液中。向该浆液中，依次加入1.8ml 2M醋酸钠(pH4.0)、18ml水饱和酚和3.6ml 49∶1的氯仿∶异戊醇，并通过倒置混合。将该内容物混合并在冰上冷却15分钟。最终，将该悬浮液在4℃在10,000×g离心10分钟。离心后，将水相转移至新管中，并与等体积冰冷的异戊醇混合，在-20℃温育1小时。将该样品在4℃在10,000×g离心20分钟，将沉淀溶于5ml RNA提取缓冲液。将该RNA用等体积的冰冷的异戊醇再次沉淀。将该沉淀用70％乙醇洗涤并最终溶于DEPC水中。通过测量A260/A280比率来以分光光度法(spectrophotometrically)检查RNA制品的纯度。在1.8和2.0之间的A260/A280值表示该RNA是完整和纯的。最终，通过测量A260估计样品中的总RNA。如Sambrook等(1989)所述通过在寡(dT)-纤维素上的亲和色谱分离Poly(A+)mRNA。
实施例2 构建cDNA文库 通过SizeSep-400离心柱(Amersham-Pharmacia Biotech)将从Poly(A+)mRNA(Superscript Lambda System，Invitrogen)制备的cDNA按大小分离，并直接克隆在pSPORT1的Sal I(5′)/Not I(3′)位点。将已连接的cDNA文库转化入E.coli DH5α中。获得约105重组子的文库。通过碱裂解法(Feliciello和Chinali 1993)提取来自随机挑选的克隆的质粒DNA。通过碱裂解法从3ml E.coli培养物中分离质粒DNA。将细胞收集在小离心管中。将沉淀溶于100μl TEG溶液[25mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA(pH8.0)和50mM葡萄糖]中并在冰上放置20分钟。随后，向其加入200μl裂解缓冲液(0.2M NaOH和1％SDS，新制)。充分混合并在冰上放置20分钟。向该裂解液中加入150μl 3M醋酸钾(pH5.2)，通过倒置温和混合并在冰上放置20分钟。将样品在10,000×g离心10分钟。取出上清液并加入2μl RNAse A(10mg/ml)，并在37℃温育1小时。将该上清液与等体积的苯酚∶氯仿(1∶1v/v)混合，并在10,000×g离心10分钟。将水相混合并转移至含等体积氯仿的新管中，并在10,000×g离心10分钟。将水相转移至新管中，并与2.5倍体积的冰冷的乙醇混合，放置在-20℃以沉淀1h。将该样品在10,000×g离心10分钟，将沉淀在70％乙醇中洗涤，空气干燥并溶于50μl TE缓冲液。
实施例3 AmDHN的序列分析 使用双脱氧链终止法(Sanger等，1977)，用ABI 310自动DNA测序仪(Perkin-Elmer)，使用M13/pUC18正向和反向引物(SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)确定全长cDNA的两条链的完整核酸序列。在此研究中使用50个克隆用于进一步分析。从所筛选的cDNA克隆中，在Pst I(5′)/Hind III(3′)位点将该cDNA插入片段亚克隆入pBluescript SK载体。将此重组克隆命名为pDHN1。将在pDHN1中的该插入物测序确定。通过一步反转录酶-聚合酶链式反应，从分离自暴露于0.5M NaCl胁迫12小时的A.marina的根的信使RNA(mRNA)分离完整编码区域。使用引物PC57 FWD 2(SEQ ID NO5)和PC 57 REV1(SEQ ID NO6)。采用以下PCR条件在9700 DNA热循环仪(Perkin-Elmer)中，(50℃，30分钟，94℃变性2分钟)，然后35个循环(94℃，1分钟；50℃，1分钟；72℃，1分钟)，然后72℃，7分钟。发现该RT-PCR产物为588个碱基对长(SEQ ID NO2)，并编码195个氨基酸(SEQ ID NO3)。将此重组克隆命名为pDHN2。
实施例4 构建蛋白表达载体 使用Taq聚合酶和含有称为PC57FWD2(SEQ ID NO5)的Xba I位点及含有称为PC57REV1(SEQ ID NO6)的Xho I限制性位点的基因特异引物扩增AmDHN的cDNA。将扩增片段用XbaI/Xho I消化，并连入pET28a E.coli表达载体(Novagen，Madison，WI)的Nhe I/Xho I位点。通过使用通用引物的自动DNA测序来确认所克隆的插入片段。使用本领域公知的标准程序将该所得重组载体pET28aDHN导入E.coli BL21(DE3)pLysS细胞。使含质粒pET28a:DHN的重组细胞在Luria Bertrani培养基中在卡那霉素筛选(50μg/ml)下，在220rpm和37℃生长。当细胞达到OD600为0.5时，通过添加IPTG诱导重组AmDHN表达至最终浓度为1mM。诱导3小时后收集细胞。通过12％(w/v)SDS-PAGE确认重组蛋白AmDHN的表达。蛋白尺寸为23.6kDa。
实施例5 蛋白提取和Western 在液氮中冷冻小苗的叶，并在4℃的含2mM PMSF、10％甘油、5mM DTT、1mM EDTA的Tris-HCl缓冲液(100mM，pH7.5)中均化(1∶5w/v)，在4℃在7000×g离心10分钟。收集上清液用于进一步试验。使用牛血清白蛋白作为标准通过Bradford’s染料结合技术定量总蛋白提取物。通过12％SDS凝胶分离80μg总蛋白并转移至硝酸纤维素膜。使用3％在Tris缓冲的盐水(TBS)中的脱脂奶粉加Tween 20在室温下封闭非特异结合位点1小时。将该硝酸纤维素膜用一抗(产生的多克隆E.coli抗-脱水素)在室温下温育1小时，并用TBS洗涤，然后，将其用碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG(goat anti-rabbit IgG alkaline phosphataseconjugate)(用TBS中的脱脂奶粉1∶1000稀释)温育1小时。使用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)检测二抗。
实施例6 构建植物转化载体 为使A.marina脱水素在烟草(Nicotiana tobacum)cv.Wisconsin中表达，将在pBluescript SK载体中命名为AmDHN的所克隆的cDNA在Pst I(5′)/Hind III(3′)位点用Bam H1酶切，并连入线性化植物转化载体pCAMBIA 2301中。将所得重组载体命名为pMADY1。该重组载体pMADY1具有驱动具有内含子的AmDHN脱水素基因(SEQ ID NO1)表达的CaMV 35S启动子。载体pMADY1的图示在图2中示出。然后，通过冻融法将此结构，pMADY1转入Agrobacterium tumefaciens菌株EHA105中。
实施例7 烟草转化 使用标准步骤进行农杆菌介导的烟草转化。将烟草叶片圆盘切割并转入含3％蔗糖、1mg/l BAP、1mg/l NAA、0.8％细菌琼脂的pH5.6的Murashige和Skoog(MS)培养基中，转化前在28℃在16小时光照和8小时黑暗中24小时。将已转化的农杆菌菌株的过夜培养物(5ml)重悬浮于一百毫升具有3％蔗糖的pH5.6的0.5XMS液体培养基中。然后，将该叶片圆盘与重悬的AmDHN转化的农杆菌共培养30分钟。将该叶片圆盘在无菌No.1 Whatmann盘上干燥，并转入含3％蔗糖的1mg/l BAP、1mg/l NAA和0.8％细菌琼脂，pH5.6的MS培养基中，在28℃在16小时光照和8小时黑暗中48小时。将该叶片圆盘在具有3％蔗糖、pH5.6的含250mg/ml氨噻肟头孢霉素的MS培养基中洗涤数次。叶片圆盘上过量的湿气用无菌Whatmann No.1滤纸吸收。然后，将该叶片圆盘在28℃在16小时光照和8小时黑暗中放置在选择培养基，即含250mg/ml氨噻肟头孢霉素和50mg/l卡那霉素的含有3％蔗糖、1mg/l BAP、1mg/l NAA、0.8％细菌琼脂的pH5.6的MS培养基上。每14天将该叶片圆盘转移至新鲜选择的培养基上，直到看到很多根再生。在最初放置在选择培养基上后20-35天看到根再生。在28℃(在16小时光照和8小时黑暗中)将分离的根转入生根培养基(含250mg/ml氨噻肟头孢霉素和50mg/l卡那霉素的含3％蔗糖、0.8％细菌琼脂的pH5.6的MS培养基)中。在根在培养基中确立之后，每14天将该植株转入新鲜的生根培养基，每次转移从先前的植株上切下的根。将已生根的植株转移到土中，并生长直到成熟。使用载体pMADY1总共得到25个转化植株。
实施例8 转化植株的确认 通过植株的茎、叶和根切片的β-葡萄糖苷酶(GUS)染色确认转化植株。用于GUS染色的步骤参照Jefferson RA等，1987。还通过使用标准步骤如PCR分析和Southern杂交、同工酶分析进行确认。
实施例9 通过TAIL PCR分离AmDHN启动子 为了TAIL PCR，使用标准步骤提取总基因组DNA。设计基因特异引物并与简并引物组合使用。将Avicennia marina基因组DNA用作模板用于第一反应。使用先前的PCR产物作为模板进行两个连续PCR循环。以连续的方式使用普通任意引物和基因特异引物。在1.5％琼脂糖凝胶的相邻泳道上分离第一，第二和第三反应的产物，确认对应于基因特异引物的相对位置的显示不同大小的不连续PCR产物。临近5’端设计3个基因特异嵌套引物。引物长度范围为23-26个核苷，并具有69℃的Tm。所使用的嵌套基因特异引物的核苷酸序列示于SEQ ID NO7、SEQ IDNO8和SEQ ID NO9。
所使用的任意简并引物的核苷酸序列示于SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13。
引物AD1(SEQ ID NO10)、AD2(SEQ ID NO11)、AD3(SEQID NO12)和AD4(SEQ ID NO13)分别具有以下解链温度46℃、34℃、34℃和45℃。由750个碱基对启动子片段设计第二套嵌套基因特异引物，这些包括PROMR1(SEQ ID NO14)、PROMR2(SEQ ID NO15)和PROMR3(SEQ ID NO16)。
第二套引物长度范围为22-23个核苷酸，具有59℃的解链温度。该第二启动子片段长度为55个碱基对。总启动子长度为843bp。每一第一次反应混合物(20μl)包含以下2.5μl 10×PCR缓冲液、200μM各种dNTP、0.2μM基因特异引物和2μMAD引物的任一种、1单位Taq DNA聚合酶和25ng基因组DNA。使用标准TAIL-PCR程序(Liu and Whittier，1995)的热条件进行第一扩增。制备含有相同成分的第二PCR混合物(25μl)。用39μl蒸馏水稀释1微升第一PCR产物，并将1μl经稀释的DNA加入第二PCR混合物中。使用标准TAIL-PCR程序(Liu and Whittier，1995)的热条件进行第二扩增。制备含有相同成分的第三次PCR混合物(25μl)。用9μl蒸馏水稀释1微升第二PCR产物，并将1μl此经稀释的DNA加入第三PCR混合物中。使用标准TAIL-PCR程序(Liu andWhittier，1995)的热条件进行第三扩增。来自TR1、TR2和TR3反应的扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析，并将与引物位置一致的产物大小的差别用作标准。将正确大小的片段再扩增，凝胶洗脱并连入TA载体。对相应的细菌克隆进行质粒分离，并将此DNA用作用于DNA测序的模板。
实施例10 在转基因烟草植株中的盐胁迫分析 NaCl溶液叶片圆盘分析 使26个来自对照组和转基因植株的叶片圆盘漂浮于100mM NaCl溶液和H2O(水对照组)上用于此试验。估计对照组和转基因植株的叶绿素损失百分比。对照组叶片圆盘在NaCl中显示可见的损伤。发现，对照组植株显示70％叶绿素损失而转基因植株显示39％的叶绿素损失。
整个植株盐胁迫处理 通过进行整个植株盐胁迫处理分析由在A.marina转化体中过表达DHN而赋予的耐盐性。同样在对照组与转基因植株之间进行表型生长延迟研究。使转基因植株与对照组一起在最初在1/2MS中生长1周。然后，将它们转入补充有150mM和200mMNaCl的1/2MS培养基中。观察到，在150mM NaCl中，当与对照组植株相比时，转基因植株表现良好的生根。在200mM NaCl中，对照组和转基因植株都不生根。还发现，在150mM和200mMNaCl胁迫下，转基因植株受到更少的损伤。在生长于花盆中并用150mM NaCl溶液浇灌的11/2周的对照组和转基因植株中表型生长延迟不明显。植株显示增强的耐盐性。
序列表
<110>斯瓦米那坦研究基金会(M.S.Swaminathan Research Foundation)
艾杰·帕里丹(Parida，Ajay)
皮蒂·安格拉·梅塔(Mehta Angela，Preeti)
佳亚特里·文卡塔拉曼(Venkatraman，Gayatri)
<120>来自Avicennia marina的用于赋予植物耐盐性的脱水素基因
<130>PCT0041
<160>16
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1026
<212>DNA
<213>Avicennia marina
<400>1
cggacgcgtg gggtgtatct cgtatttcag atatctttaa gctcagagaa tatggcagag
60
tacggcgacc aatacgggcg acagaccgac gagtatggca atcccatccg ccagactggt
120
gagtttggag ctaccggggc ttacggggct aatcagcagt atggaaccac cggcaccacc
180
gtagggtatg ggactgatca gtgtgtcacc accgtcacga ccggggctca gaagactgac
240
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300
accaccgggg aatatgggac ccacggtggt gggattgctc caggagcaac tgatgctggc
360
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420
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480
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540
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780
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840
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900
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960
gttgtatgat atgtaattaa tgcgtatata tgaatgaata cttttgtgtt aaaaaaaaaa
1020
aaaaaa
1026
<210>2
<211>588
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>2
atggcagagt acggcgacca atacgggcga cagaccgacg agtatggcaa tcccatccgc
60
cagactggtg agtttggagc taccggggct tacggggcta atcagcagta tggaaccacc
120
ggcaccaccg tagggtatgg gactgatcag tgtgtcacca ccgtcacgac cggggctcag
180
aagactgacc agtatggaac ccccggcacg accggagcat atgggactga tcagtatgga
240
accaccggca ccaccgggga atatgggacc cacggtggtg ggattgctcc aggagcaact
300
gatgctggcc tagctggcgg cggcggaggc caccgccgct tgggcagctc aggcagctcg
360
tcctcagagg acgacgggca aggtgggagg agaaagaagg ggataaagga gaagataaaa
420
gagaagctac ccggcggcgg tcacggggat gatcagactc accccactcc acctggcagc
480
ggcggatatg gttatgagca cgggggagcg gccgaaagcc cagagcatga agagaagaag
540
ggaataatgg ataagataaa ggaaaagctg cccggcggcc accattaa
588
<210>3
<211>249
<212>PRT
<213>Avicennia marina
<400>3
Met Ala Glu Tyr Gly Asp Gln Tyr Gly Arg Gln Thr Asp Glu Tyr Gly
1 5 10 15
Asn Pro Ile Arg Gln Thr Gly Glu Phe Gly Ala Thr Gly Ala Tyr Gly
20 25 30
Ala Asn Gln Gln Tyr Gly Thr Thr Gly Thr Thr Val Gly Tyr Gly Thr
35 40 45
Asp Gln Cys Val Thr Thr Val Thr Thr Gly Ala Gln Lys Thr Asp Gln
50 55 60
Tyr Gly Thr Pro Gly Thr Thr Gly Ala Tyr Gly Thr Asp Gln Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Thr Gly Thr Thr Gly Glu Tyr Gly Thr His Gly Gly Gly Ile Ala
85 90 95
Pro Gly Ala Thr Asp Ala Gly Leu Ala Gly Gly Gly Gly Gly His Arg
100 105 110
Arg Leu Gly Ser Ser Gly Ser Ser Val Cys Asp Tyr Lys Leu Asn Phe
115 120 125
Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Val Cys Met Cys Ala Asn Ser Arg Ile
130 135 140
Thr Ile Phe Tyr Phe Leu His Glu Trp Gln Ser Ser Glu Asp Asp Gly
145 150 155 160
Gln Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Ile Lys Glu Lys Ile Lys Glu Lys
165 170 175
Leu Pro Gly Gly Gly His Gly Asp Asp Gln Thr His Pro Thr Pro Pro
180 185 190
Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Tyr Glu His Gly Gly Ala Ala Glu Ser Pro
195 200 205
Glu His Glu Glu Lys Lys Gly Ile Met Asp Lys Ile Lys Glu Lys Ala
210 215 220
Ala Glu Ser Pro Glu His Glu Glu Lys Lys Gly Ile Met Asp Lys Ile
225 230 235 240
Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly His His
245
<210>4
<211>793
<212>DNA
<213>Avicennia marina
<400>4
ggtcgagtga gaagaatagg ttgtgaatat ggtggtcgag tgagatgaag tgatggtatg
60
agccaaatgg gccagccata gaagtgccta aattgtttgg gacaatgata cattcatagt
120
gggtgacacc tgtgaggccc aaattgacca atgcatgtag attctaccat atcatgccag
180
gtgaccacca ataatcatca tccatcatca gttattggtt ccttcttcac cttaacttgt
240
cttgcaaccg acaacttcgc cttttcccaa cggtcaactt ttgtcatacc caaataacca
300
tcgcttcatc tgtatacgtg gctctgcgtt gatcacatca caatcgacaa gtgtcatatc
360
tctccgagac taatgcatgt atggatccaa tctaaataaa ctagataagc ttttcagtaa
420
cgtgtgatta taaaattccg tggattcaaa ctttaccgaa aattttaagt tgaattccat
480
tcatgtatat cttctgagtt ggactttagt ttatcattct gtgggtttat ccacatttgc
540
cgacaacgga cacctgtcca aatcttgctg gagatgtgga acccaagatc ccaacgtggc
600
atctgcataa tttattgcat gcaacacctg cgagttttcc ctgtcatccg ctttcgagac
660
tgcgcatccc ttgcattcta tatatatatc cccccccccg catggcagta taccattgca
720
tcagttcgta gaactatcat tttcagtgta tctcgtattt cagaaatctt taagctcaga
780
gaatatggca gag
793
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>5
gctctagaat ggcagagtac ggcgac
26
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>6
ccgctcgagt taatggtggc cgccg
25
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>7
tacggtggtg ccggtggttc cat
23
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>8
tgggattgcc atactcgtcg gtct
24
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>9
ctctgccata ttctctgagc ttaaag
26
<210>10
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<220>
<221>misc特征
<222>(1)..(1)
<223>n为a、c、g或t
<220>
<221>misc特征
<222>(11)..(11)
<223>n为a、c、g或t
<400>10
ngtcgaswga nawgaa
16
<210>11
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<220>
<221>misc特征
<222>(5)..(5)
<223>n为a、c、g或t
<220>
<221>misc特征
<222>(10)..(10)
<223>n为a、c、g或t
<400>11
tgwgnagsan casaga
16
<210>12
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<220>
<221>misc特征
<222>(5)..(5)
<223>n为a、c、g或t
<220>
<221>misc特征
<222>(10)..(10)
<223>n为a、c、g或t
<220>
<221>misc特征
<222>(13)..(13)
<223>n为a、c、g或t
<400>12
wgtgnagwan canaga
16
<210>13
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<220>
<221>misc特征
<222>(5)..(5)
<223>n为a、c、g或t
<220>
<221>misc特征
<222>(10)..(10)
<223>n为a、c、g或t
<220>
<221>misc特征
<222>(13)..(13)
<223>n为a、c、g或t
<400>13
sttgntastn ctntgc
16
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>14
ggagagatat gacacttgtc ga
22
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>15
gtcggttgca agacaagtta ag
22
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>16
<acccactat gaatgtatca ttg
3
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种分离的多核苷酸序列，其包含与SEQ ID NO1具有至少80％相似性的多核苷酸序列，该SEQ ID NO1编码具有如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的脱水素多肽。
2.一种分离的多核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO1中所示的多核苷酸序列，该SEQ ID NO1编码具有如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的脱水素多肽。
3.一种在植物中赋予耐盐性的多肽序列，其具有如SEQ IDNO3中所示的氨基酸序列。
4.一种用于转化植物以赋予耐盐性的重组结构，其包括选自由35S CaMV、胭脂氨酸合成酶、OCS、AdhI、AdhII和Ubi-1组成的组中的启动子，其中该启动子可操作地连接至如SEQ IDNO1中所示的多核苷酸序列，或者其片段或变体。
5.一种在植物细胞中起作用的分离的启动子，该启动子包括
a.如SEQ ID NO4中所示的多核苷酸序列，或
b.具有如SEQ ID NO4中所示的多核苷酸序列的至少200个连续核苷酸的多核苷酸序列。
6.一种重组载体，其包括可操作地连接至目标异源DNA序列的根据权利要求5所述的启动子。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其中该异源DNA序列编码选自由以下组成的组中的蛋白抗虫蛋白、抗细菌性疾病蛋白、抗真菌性疾病蛋白、抗病毒性疾病蛋白、抗线虫性疾病蛋白、抗除草剂蛋白、影响谷类组成或质量的蛋白、可选择标记蛋白、可筛选标记蛋白、影响植物农艺特性的蛋白和耐胁迫蛋白。
8.一种转化植物以在植物中赋予耐盐性的方法，所述方法包括用重组载体转化植物以生产耐盐植物，该重组载体包括可操作地连接至根据权利要求1所述的多核苷酸序列，或者其片段或变体的启动子。
9.根据权利要求8所述的方法，其中转化通过选自由以下组成的组中的方法进行农杆菌介导的转化、基因枪轰击法、真空渗入法、原位转化和化学方法。
10.根据权利要求9所述的方法，其中农杆菌介导的转化方法包括
a.构建根据权利要求4所述的重组结构，
b.使该重组结构转移进入农杆菌菌株，以生产重组农杆菌菌株，
c.从植物获得合适的外植体，
d.用该重组农杆菌菌株培养该外植体，以生产转化的植物细胞，
e.培养该经转化的植物细胞以生产转化植物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述植物为单子叶或双子叶植物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中该单子叶植物选自由水稻、玉米、小麦、大麦和高粱组成的组中。
13.根据权利要求11所述的方法，其中该双子叶植物选自由烟草、番茄、豌豆、大豆、芸苔、花生、鹰嘴豆和树豆组成的组中。
14.根据权利要求10所述的方法，其中农杆菌选自由LBA4404、EHA101和EHA105组成的组中。
15.根据权利要求10所述的方法，其中该外植体选自由叶、茎、根、胚轴和胚组成的组中。
16.一种转基因植物，其用包含与SEQ ID NO1具有至少80％相似性的多核苷酸序列的多核苷酸序列转化，该SEQ IDNO1编码具有如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的脱水素蛋白。
17.根据权利要求16所述的转基因植物，其中所述植物选自由烟草、番茄、豌豆、大豆、芸苔、鹰嘴豆、树豆、水稻、玉米、小麦、大麦和高粱组成的组中。
18.一种植物、植物部分、种子、植物细胞或其后代，其中该植物、植物部分、种子、植物细胞或其后代包括根据权利要求4所述的重组结构。
权利要求
1.一种分离的多核苷酸序列，其与SEQ ID NO1具有至少80％相似性，该SEQ ID NO1编码具有如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的脱水素多肽。
2.一种用于转化植物以赋予耐盐性的重组结构，其中所述结构包括可操作地连接至如SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列，或者其片段或变体的调控序列。
3.根据权利要求2所述的重组结构，其中所述调控序列选自由35S CaMV启动子、胭脂氨酸合成酶启动子、OCS、AdhI、AdhII和Ubi-1组成的组中。
4.一种在植物细胞中起作用的分离的启动子，该启动子包括
a.示于SEQ ID NO4中的多核苷酸序列，或
b.具有示于SEQ ID NO4中的多核苷酸序列的至少200个连续核苷酸的多核苷酸序列。
5.一种重组载体，其包括可操作地连接至目标异源DNA序列的根据权利要求4所述的启动子。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其中该异源DNA序列编码选自由以下组成的组中的蛋白抗虫蛋白、抗细菌性疾病蛋白、抗真菌性疾病蛋白、抗病毒性疾病蛋白、抗线虫性疾病蛋白、抗除草剂蛋白、影响谷类组成或质量的蛋白、可选择标记蛋白、可筛选标记蛋白、影响植物农艺特性的蛋白和抗胁迫蛋白。
7.一种转化植物以在植物中赋予耐盐性的方法，所述方法包括用重组载体转化植物以生产耐盐植物，该重组载体包括可操作地连接至根据权利要求1所述的多核苷酸序列的调控序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其中该转化通过选自由以下组成的组中的方法进行农杆菌介导的转化、基因枪轰击法、真空渗入法、原位转化和化学方法。
9.根据权利要求8所述的方法，其中农杆菌介导的转化方法包括
a.构建根据权利要求2所述的重组结构，
b.使步骤(a)的重组结构转移进入农杆菌菌株，以生产重组农杆菌菌株，
c.从植物获得合适的外植体，
d.用步骤(b)的重组农杆菌菌株培养该外植体，以生产转化的植物细胞，
e.培养该经转化的植物细胞以生产转化植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物为单子叶或双子叶植物。
11.根据权利要求9所述的方法，其中该单子叶植物选自由水稻、玉米、小麦、大麦和高粱组成的组中。
12.根据权利要求9所述的方法，其中该双子叶植物选自由烟草、番茄、豌豆、大豆、芸苔、花生、鹰嘴豆和树豆组成的组中。
13.根据权利要求9所述的方法，其中农杆菌选自由LBA4404、EHA101和EHA105组成的组中。
14.根据权利要求9所述的方法，其中该外植体选自由叶、茎、根、胚轴和胚组成的组中。
15.一种转基因植物，其用与SEQ ID NO1具有至少80％相似性的多核苷酸序列转化，该SEQ ID NO1编码具有如SEQID NO3所示的氨基酸序列的脱水素蛋白。
16.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物选自由烟草、番茄、豌豆、大豆、芸苔、鹰嘴豆、树豆、水稻、玉米、小麦、大麦和高粱组成的组中。
17.一种植物、植物部分、种子、植物细胞或其后代，其中该植物、植物部分、种子、植物细胞或其后代包括根据权利要求2所述的重组结构。
全文摘要
本发明涉及通过用编码脱水素(DHN)蛋白的分离的核苷酸序列转化植物来生产耐盐植物的方法。本发明进一步提供表达Avicennia marina的脱水素基因的转基因植物。使用功能基因组，此基因来源于耐盐红树林Avicennia marina的cDNA文库的大规模EST测序。
文档编号C12N15/29GK101297039SQ200680037003
公开日2008年10月29日 申请日期2006年7月31日 优先权日2005年8月3日
发明者艾杰·帕里丹, 皮蒂·梅塔·安格拉, 佳亚特里·文卡塔拉曼 申请人:斯瓦米那坦研究基金会