多孔性和抗张强度提高的胶原蛋白基质及其利用机械刺激系统的制备方法

专利名称：：多孔性和抗张强度提高的胶原蛋白基质及其利用机械刺激系统的制备方法
技术领域：
：本发明涉及利用机械刺激系统制备多孔性和抗张强度提高的胶原蛋白基质的方法。具体来说，在向胶原蛋白凝胶底部周期性非连续地施加物理力量的条件下，刺激含有细胞的凝胶。将物理力量横向施加于胶原蛋白凝胶的底部，由此诱导细胞和胶原蛋白基质同时接受不同类型的力量。该诱导向细胞发出复杂信号，因此调控胶原蛋白的产生和消化，以产生多孔性和抗张强度提高的胶原蛋白基质。改善的胶原蛋白基质可用于制备人工器官，也可作为真皮填充物或真皮替代物。
背景技术：
：生物材料如胶原蛋白，越来越多地用于药用领域，并且应用于损伤的结缔组织的重建和基因治疗。胶原蛋白基质(collagenmatrix)适合各类细胞的生长，并以基质、凝胶或膜等形式广泛用于制备重建的组织。但是，通过凝胶化的胶原蛋白溶液制备的胶原蛋白基质很脆弱，而不适合人工器官的培养，如人工皮肤、软骨和骨骼等。为了解决上述问题，现已开发了多种多样的技术，如包括尼龙等聚合体的使用、胶原蛋白网丝的使用、以及胶原蛋白和壳聚糖(chitosan)混合使用等，但获得的产品并不能令人满意。因此，急需制备更紧凑的胶原蛋白基质的方法，并且此方法对组织工程改造也非常重要。生物体可以呼吸和运动、并不断和外部环境相互作用。但是在试验条件下，细胞在调控的条件下培养于反应器中，而无任何外部刺激。换句话说，培养的条件如空气、温度、湿度等通常不同于细胞的天然条件，因此，在培养系统中，开始使用物理刺激，以提供更与体内类似的环境。据报道，不同的机械刺激激发不同的细胞应答。在骨细胞中，剪应力(Shearstress)刺激通过骨细胞连接蛋白(connexin)的移动，而诱发前列腺素E2(ProstaGlandinE2，PGE2)的游离(CherianPPetal,MolBiolCell,16(7):3100-6，2005);软骨组织培养时，周期性压迫能显著增加胶原蛋白合成(WaldmanSDetal,TissueEng.Sep-Oct;10(9-10):1323-31,2004)等等。根据上述研究结果，拉长的机械刺激(WangJQetal,AnnBiomedEng,33(3):337-42,2005;KatsumiAetal,JBiolChem，280(17):16546-9，2005)或者提高培养液内压力(hydrostaticfluidpressure)等方法(Miz腸etal,JCellPhysiol,193(3):319-7,2002)已用于骨和软骨的培养。但是，机械剌激影响真皮成纤维细胞的作用机制尚未阐明清楚。文献报道，机械剌激可调节成纤维细胞细胞外基质基因的表达。尽管不了解机械刺激的机制，但推断，肌肉的收縮力或重力通过细胞外基质传递至细胞骨架(cytoskeleton)，而后变为细胞内信号(Sarasa画RenedoA,etal.，ScandJMedSciSports,Aug;15(4):223-230,2005)。在本发明中，发明人试图建立一种方法，在该方法中，发明人可培养具有优良多孔性和抗张强度(tensilestrength)的胶原蛋白基质。对于组织改造技术，急需具有优良多孔性和抗张强度的胶原蛋白基质。在本发明中，发明人对胶原蛋白基质的培养使用横向脉冲负载(transverseimpulseloading),并且发现横向脉冲负载可显著提高胶原蛋白的合成和胶原蛋白基质的改造。因此，横向脉冲负载可产生具有优良多孔性和抗张强度的胶原蛋白。在一个实施方案中，本发明提供了制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，包括如下歩骤a)将哺乳动物细胞和含有一种材料的溶液混合，制备含有哺乳动物细胞的凝胶，所述材料选自下组胶原蛋白、纤维蛋白和其混合物；和b)在周期性和非连续性向胶原蛋白凝胶施加物理力量的条件下，刺激凝胶，以制备多孔性和抗张强度提高的胶原蛋白基质。为提高哺乳动物细胞的胶原蛋白产量，将物理力量施加于凝胶底部。所述物理力量是在一个或多个部位施加于胶原蛋白凝胶平面的横向脉冲。固定凝胶边缘，然后将物理力量施加于胶原蛋白凝胶底部的至少一个部位，包括中央部位。刺激强度是1.0x10-71.0x10-1N/m2，刺激频率是每分钟0.01500周期(cycle)。剌激是由连
发明内容发明简述接于凸轮轴的凸轮产生，轮轴以每分钟0.01500周期的速度旋转。b)阶段需在有弹性材料制造的容器内进行，所述弹性材料为聚乙烯、聚丙烯、乙烯-丙烯共聚物或者硅树脂。以每毫升溶液1x103~1x107个细胞的浓度来混合细胞。胶原蛋白选自下组中的至少一种i型胶原蛋白、m型胶原蛋白及iv型胶原蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供了利用上述生产方法产生的多孔性和抗张强度提高的胶原蛋白基质。本发提供了孔直径为0.1100pm、孔隙率为1090%、抗张强度为1200N/cm2的胶原蛋白基质。在第三个实施方案中，本发明提供了用于支架(scaffold)的人工皮肤或人工器官，所述支架包括根据本发明方法制备的凝胶基质，用于培养人工皮肤或人工器官。本发明的另一个方面提供了通过使用改进的胶原蛋白基质培养人工皮肤或人工器官的方法。本发明提供了用于培养人工皮肤或器官的胶原蛋白支架，其包括根据本发明的方法制备的胶原蛋白基质。在第四个实施方案中，本发明提供了美容及治疗用填充物，包含根据本发明的方法所制备的胶原蛋白基质。发明详述胶原蛋白是成纤维细胞内产生的主要的细胞外基质蛋白。胶原蛋白约占机体总蛋白质的30%，并具有坚固的三螺旋结构。胶原蛋白作为细胞内支撑物的骨架起着重要作用。主要影响细胞粘附、迁移、增殖、细胞分化及其生存。在文献中，没有发现对含有细胞的胶原蛋白凝胶或者纤维蛋白凝胶直接剌激的报道，也没有将物理力量周期性地施加于胶原蛋白凝胶或纤维蛋白凝胶的底部的研究。根据本发明的实施方案，通过施用本发明人设计的机械剌激物，以横向脉冲负载的形式将物理力量施加于凝胶的底部而作用于胶原蛋白凝胶。发明人发现，通过将物理力量周期性地施加于含有细胞的胶原蛋白凝胶，可显著提高胶原蛋白的合成和抗张强度，因此研发出了本发明。因为横向脉冲负载是从底部施加于胶原蛋白凝胶，所以在每个剌激周期中，胶原蛋白凝胶上下运动。例如，刺激由碰撞期和短暂的休止期组成。若每个刺激由两次碰撞组成，所述两次碰撞可通过旋转具有连接于凸轮轴的两个凸轮的机械剌激物实现，则在每次刺激周期中，胶原蛋白基质上下运动两次，随后开始休止期。因为横脉冲负载的特性、胶原蛋白基质可在三维方向上接受复杂的力量组合。凝胶的刺激部位可以是凝胶的任何部位，优选固定胶原蛋白凝胶边缘，使其充当固定端，然后刺激包括胶原蛋白凝胶中心部位在内的至少一处部位，从而使刺激传遍整个凝胶。另外，当胶原蛋白凝胶较大时，优选刺激至少两处或以上部位，且同时或者异时剌激均可使用。根据本发明的一个实施方案，上述周期性机械剌激可以多种方法来施加。例如，可通过以每分钟0.01500rpm更优选每分钟50100rpm的速度旋转的机械刺激物来提供刺激。如果上述刺激频度过低，对胶原蛋白基质多孔性和抗张强度几乎无效，而过高则可使胶原蛋白基质变形。上述刺激的强度为1.0xl(T7~1.0x10"N/m2，更优选1.0xl(T42.0x10—2N/m2。刺激强度低于1.0x10—7N/m2时，对多孔性和抗张强度的增加未能施加有效的恰当剌激，而高于1.0xlO"N/m2以上时，因剌激过强，有可能使胶原蛋白基质从培养容器中脱离。优选，本发明中所用的胶原蛋白包括I、III、及IV型胶原蛋白，更优选使用I型胶原蛋白。另外，纤维蛋白可混合于本发明中。本发明的上述细胞可选自下组:成纤维细胞、真皮鞘状细胞(dermalsheathcell)、间充质干细胞(mesenchymalstemcell)、血管内皮细胞(vascularendothelialcell)、骨髓内皮祖细胞(endothelialprogenitorcell,EPC)、角质形成细胞、黑素细胞、毛发细胞、来源于血液的朗格汉斯细胞(Langerhanscell)、来源于血液的内皮细胞、血细胞、巨噬细胞、淋巴球、脂肪细胞、皮脂腺细胞、软骨细胞、骨细胞、造骨细胞及来源于血液的梅克尔细胞(Merkel，scell)等。优选，细胞来自年轻人。这些细胞包括正常细胞、遗传性改变的细胞、恶性细胞。可根据本领域已知的常规方法培养从每种组织中获得细胞。本发明中，上述细胞在胶原蛋白凝胶中所含有的浓度范围为每毫升(ml)胶原蛋白溶液里含有1x1031x107个细胞，优选1x105~1x106个细胞，最优选3x1058x105个细胞。当胶原蛋白凝胶中细胞含量低于1x103个细胞时，基质蛋白质的合成不充分，而高于1><107个细胞时，容易引起胶原蛋白基质的萎縮。可依照本领域中熟知的方法制备混合的胶原蛋白溶液。可从组织包括鼠尾中提取I型胶原蛋白。为了构建包埋细胞的胶原蛋白凝胶，将培养的细胞悬浮于胶原蛋白溶液中，其通过将8体积的I型胶原蛋白溶液与1体积10%的10xDMEM溶液以及1体积10%中和缓冲液混合而制成。本发明的实施方案中，将来源于皮肤的成纤维细胞和胶原蛋白凝胶混合，并体外培养于由弹性膜做成的培养容器中。上述培养容器的材料具有弹性并可用于培养动物细胞。上述培养容器没有特定的形状，可能是圆形、长方形、盘子、管状或其它形状。培养容器由选自下组的材料制成聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯及聚丙烯共聚物、硅树脂、及其混合物，且不限于此。本发明的胶原蛋白基质培养方法是，通过施加周期性机械剌激提高胶原蛋白基质抗张强度。在本发明中，刺激方法简单，且不需要高价设备和试剂。因此，本发明的培养方法具有成本效益，且可产生具有高度多孔性和抗张强度的胶原蛋白基质。本发明的另一个实施方案涉及根据上述方法制备的多孔性和抗张强度提高的胶原蛋白基质。此类胶原蛋白基质的平均气孔直径为0.1100pm，孔隙率(porosity)为20~70%，抗张强度为5200N/cm2，更优选7100N/cm2。一般测孔隙率时，需用水使测试物饱和，然后计算孔隙体积(水体积)与测试干物体总体积之比率。但是，由于胶原蛋白基质本身的吸水特性，将孔隙率定义为孔面积与总面积的百分比，所述面积是通过二维电子显微镜照片获得。在本发明中，抗张强度是在除去胶原蛋白基质中多余的培养液后，在以水饱和的饱和状态下测定。结果显示机械刺激提高了胶原蛋白基质的抗张强为了探讨上述现象的机制，分析了几个分子的表达情况。可期望地，观察到了I型原胶原蛋白(procollagenTypeI)和纤连蛋白mRNA的水平增加，并且MMP-1的水平也增加了。MMP-1属于膜结合MMPs，其能分解I型原胶原蛋白和纤连蛋白等细胞外基质蛋白质。组织金属蛋白酶抑制剂(tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMP)TIMP-1型或TIMP-2可抑制MMP-1的活性。在本发明中，观察到I型原胶原蛋白水平增加。因此，可以说MMP-1的表达增加可重建胶原蛋白基质，MMP-1的表达增加可由TIMP-1和_2的水平增加来平衡。上述胶原蛋白基质可用于培养多孔性和抗张强度提高的人工皮肤及人工器官。在本发明的实施方案中，将表皮细胞，优选角质形成细胞(keratinocyte)培养于胶原蛋白基质上。所述胶原蛋白基质可以是真皮替代物并且为皮肤提供机械支架。优选，本发明的真皮替代物是通过利用上述周期性刺激培养而制备的胶原蛋白基质。本发明的另一实施方案提供了制备人工皮肤的方法，其包括下列步骤a)利用本发明的上述方法制备含有细胞的胶原蛋白基质；b)以2><1042><105个细胞/(^2的浓度，在胶原蛋白基质上接种和培养角质形成细胞；根据本发明中记述的胶原蛋白基质培养方法，进行步骤a)。本发明还提供了根据本发明的培养方法制备的人工皮肤。本发明的人工皮肤在形态学上非常类似人体皮肤。本发明通过剌激含有细胞的胶原蛋白和/或纤维蛋白凝胶而提供胶原蛋白基质。通过使用机械刺激，本发明提供了与人类组织相似的具有优良多孔性和抗张强度的胶原蛋白基质。下面阐述与本发明有关的代表性实施例，但下述的实施例是本发明的实施例之一，本发明并不只限于下述实施例。图1A和图1B是机械刺激物示意图。图2是显示本发明实施例1-1中，物理条件作用后，一个代表性的周期位移。图3是显示本发明实施例1-2中，对照组和刺激组基质上培养的人工皮肤。图4是表示本发明实验例1中，利用机械刺激培养的胶原蛋白凝胶的干重增加。图5是表示本发明实验例2中，利用机械刺激培养的胶原蛋白凝胶多孔性增加。图6是表示本发明实验例3中，利用机械刺激培养的胶原蛋白凝胶抗张强度增加。图7A是表示本发明实验例4中，培养于机械刺激下的胶原蛋白凝胶中，I型胶原蛋白、MMP-1及纤连蛋白的mRNA表达增加。图7B是表示本发明实验例4中，培养于机械刺激下的胶原蛋白凝胶中，I型原胶原蛋白、TIMP-1及TIMP-2蛋白质水平增加。具体实施例方式实施例1:多孔性和抗张强度提高的胶原蛋白基质的制备1-1:机械刺激物的制作如图1A和图1B所示，机械刺激物包括连接于凸轮轴的两个椭圆形凸轮，并通过接触胶皮片(rubberplate)向上给胶皮片施加力量，所述的凸轮位于胶皮片对应的位置。胶皮片位于箱体上部，具有与培养容器底部同样大小的尺寸。当凸轮轴旋转时，两个凸轮将物理力量向上施加于其上存在有培养容器的胶皮片底部的中心部位。因此，附着于培养容器的胶原蛋白凝胶作周期性运动。这是因为培养容器是固定的，并且紧紧地附着于胶皮片，特别是，培养容器底部的边缘是固定的。实施于培养容器底部的剌激周期是72rpm(0.8356秒/周期，1.2Hz)。如图2所示，物理力量可描述为术语"横向脉冲负载"。另外，为了试验施加于培养容器底部的负荷，利用MSC.NastmnTMforWindow2003(MSCSoftwareCorporation,CA，USA)软件，进行了刺激模式有限要素分析。结果培养容器底部所受的最大力量为L7x10-3N/m2，而刺激频率为每分钟60rpm。1-2:培养细胞以及含有细胞的基质人类角质形成细胞和真皮成纤维细胞是从包茎术中获得的包皮皮肤中分离的。根据Rheinward和Green的方法进行处理，如同在我们实验室利用嗜热菌蛋白酶(SigmaChemicalCo.,St.Louis，MO)所改良的。将角质形成细胞培养于角质形成细胞生长培养基中(KGM，Clonetics，SanDiego，CA)，成纤维细胞培养于补充了胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco，smodifiedEagle'smedium)中。通过在4°C1/1000冰醋酸中搅拌48小时，从大鼠尾腱中提取I型胶原蛋白。混合8体积的I型胶原蛋白和1体积的10x浓度的DMEM以及1体积中和缓冲液(0.05NNaOH,0.26mMNaHC03以及200mMHEPES)，并加入5x105个成纤维细胞，来制备含有细胞的胶原蛋白基质。取上述混合液3ml并注入30mm的聚碳酸酯过滤器(polycarbonatefilterchamber,3.0cmMillicell;Millipore,Bedford,MA)，并且，在37"凝胶化后加入培养基。然后利用实施例1-1中所述方法刺激含有细胞的胶原蛋白基质。实施例2:抗张强度增加的人工皮肤的制备为了重建SEs，接种角质形成细胞，并加入DMEM和Ham，sF12(3:l)混合物，所述混合物补充了5%FBS、0.4ug/ml氢化可的松、lpM异丙肾上腺素、5pg/ml胰岛素、10ng/ml表皮生长因子(InvitrogenCo,,Carlsbad,CA)、1ng/mlbFGF(SigmaChemicalCo"St.Louis,USA)以及25^g/ml的抗坏血酸。将SEs浸没一天，随后液态空气(air-liquid)暴露12天。培养后，将SEs固定，产生石蜡块，并用苏木素伊红(hmatoxylin-eosin)染色。实验例1:胶原蛋白基质的干重冷冻干燥后，测定样品(lcmx1cm)的干重。测量干重并计算占总湿重的百分比(图4》图4所示，刺激组干重为31.3土5.7mg(第1次26mg;第2次30.1mg;第3次37.3mg)，占干燥前重量442.8士72.2mg(第1次360.4mg;第2次495.3mg;第3次472.6mg)的7.1±0.9%，而对照未刺激组干重为28.8士4.6mg(第1次25.6mg;第2次26.4mg;第3次33.9mg)是干燥前重量559.5土114.4mg(第1次481.4mg;第2次506.2mg;第3次690.8mg)的5.1±0.2%。结果显示由于机械条件，干重百分比增加了(从5.1%±0.2%到7.1%±0.9%)0实验例2:孔隙率分析胶原蛋白基质受周期性机械剌激时，为了了解多孔性增加和结构变化情况，用电子显微镜观察了胶原蛋白基质组织横截面(图5)，并测定了基质的多孔性。要是证明其多孔性，应该测定其孔隙率(或者气孔率)。孔隙率是通常把所测对象物浸泡水里成饱和状态后，求孔隙体积(水体积)和总体积(干燥材料)之间比率。但是，由于胶原蛋白基质的吸水特性，最新将孔隙率定义为孔面积与总面积的百分比，所述面积是通过二维电子显微镜照片获得。依据上述定义，观测到受周期性机械刺激的实施例1-2的胶原蛋白基质的平均孔隙率为59.1±4.7%(第1次试验62.9%;第2次试验58.7%;第3次试验53.4%;第4次试验64.5%;第5次试验55.9%)，比对照组平均孔隙率34.3±3.0%(第1次试验29.8%;第2次试验35.6%;第3次试验37.3%;第4次试验36.1%;第5次试验32.8%)有所增加。气孔大小各种各样，但在刺激组中通常是紧凑的。如图5所示，与未受刺激的相比较，刺激组内可见有新生似的多丛生物合成纤维，且其气孔普遍较小。实验例3:抗张强度的测定用质构仪(TA-XT2iTextureAnalyser,StableMicroSystems,Godalming，UK)测定抗张强度。如图6所示，结果显示，拉长同样位移时，刺激组比对照所需力量更大。在本试验中，抗张强度是在从胶原蛋白基质中去掉多余的培养液后，在用水饱和的状态下测定的。对照组和刺激组的拉伸模数(tensilemodulus)各为12.3±3.4N/cm2(第1次试验8.2;第2次试验9.0;第3次试验15.7;第4次试验11.3;第5次试验17.1N/cm2)，和23.5士4.8N/cm2(第l次试验18.4;第2次试验17.6;第3次试验28.1;第4次试验22.5;第5次试验23.5N/cm2)。在每次实验中，刺激组拉伸模数比对照组增加了约2倍。实验例4:细胞外基质蛋白质的表达为研究周期性刺激影响胶原蛋白形成及细胞外基质蛋白质表达，从实施例1-2中所得到的胶原蛋白基质500mg和不在剌激系统培养的对照组胶原蛋白500mg分别准备之后，利用TRIzol(Cat.No.15596-026，GibcoBRL/Irwtrogen)试剂制备RNA。胶原蛋白凝胶凝固之后，胶原蛋白凝胶对照中仅分离出小量RNA，但从实施例l-2获得胶原蛋白基质中提取了约20吗RNA。将提取的RNA进行RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)，结果见图7A。具体来说，利用TRIzol试剂(Gibco,GrandIsland,NY)分离总的RNA，根据制造商说明书用Promega(Madison,WI)的反转录体系，反转录2pg的RNA。利用下列引物扩增获得的cDNA:n型原胶原蛋白正向引物5，-CTCGAGGTGGACACCACCCT-3，反向引物5，-CAGCTGGATGGCCACATCGG-3，缀MP-1正向引物5，-ATTCTACTGATATCGGGGCTTTGA-3，反向引物5，-ATGTCCTTGGGGTATCCGTGTAG-3'*纤连蛋白正向弓l物5,-AGGTTCGGGAAGAGGTTGTT-3'反向引物5，-TGGCACCGAGATATTCCTTC-3，。通过在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳并用EB(溴化乙锭)染色，使PCR产物可视化。利用如下所示的GAPDH特异性引物，对获得的cDNA也进行扩增正向引物5，-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3，反向引物5，-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3。图7A显示，与对照组相比，刺激组中I型原胶原蛋白和纤连蛋白的mRNA增加了。通过Western印迹法，分析了蛋白表达的水平。在缓冲液[62.5mMTris-HCl(pH6.8),2%SDS,5%(3-巯基乙醇，2mM苯甲磺酰氟，蛋白酶抑制齐U(CompleteTM,Roche,Mannheim,Germany),1mMNa3V04,50mMNaF以及lOmMEDTA]中裂解培养的真皮替代物。通过SDS聚酰胺凝胶电泳，分离每个泳道中的20pg蛋白，并将其点涂于硝化纤维膜上，并用存在于含有0.4%Tween20的Tris缓冲盐溶液(Tris-bufferedsaline)中的5。/。的奶粉(driedmilk)饱和。用稀度为1:1000的适当的第一抗体温浴点涂的点渍，随后用连接有辣根过氧化物酶的第二抗体温浴。用增强的化学发光法试剂盒(Chemiluminescencepluskit,AmershamInternational,LittleChalfont,U.K.)检测结合的抗体。随后使用的抗体是I型原胶原蛋白的单克隆鼠抗体(由耶鲁大学医学院的HeinzFurthmayr博士提供)、MMPl(致癌基因，IM35L,LaJolla,CA)、TIMP1(SantaCruzBiotechnology,Inc.,sc-6832,SantaCruz，CA)、TIMP2(SantaCruzBiotechnology,Inc.,sc-21735)和肌动蛋白的羊抗体(SantaCruzBiotechnology,Inc.,sc-1616)。结果发现与对照相比，物理刺激显著增加了I型原胶原蛋白的水平。而且，与对照样品相比，抑制MMP-l活性的TIMP-l和TIMP-2的水平增加了。这些发现解释了尽管刺激组中MMP-l的mRNA水平较高，但MMP-l的水平在两个组中是相似的。因此，可以说，I型原胶原蛋白产量的增加以及MMP-l对消化的调控，产生了孔隙更精细和抗张强度提高的胶原蛋白基质。尽管参考优选的实施例己对本发明作了详细描述，但本领域熟练的技术人员将意识到，在没有偏离如附加的权利要求所提及的本发明的精神和范围的情况下，可对本发明作各种修改和变换。权利要求1.制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其包括如下步骤a)将哺乳动物细胞和含有一种材料的溶液混合，制备含有哺乳动物细胞的凝胶，所述材料选自下组胶原蛋白、纤维蛋白和其混合物；和b)在向胶原蛋白凝胶周期性、非连续性地施加物理力量的条件下，刺激所述凝胶，以产生具有优良多孔性和抗张强度的胶原蛋白基质。2.根据权利要求1的制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其中所述物理力量是施加于所述凝胶的底部，以增加哺乳动物细胞产生胶原蛋白的产量。3.根据权利要求1的制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其中所述胶原蛋白是选自下组的至少一种i型胶原蛋白、m型胶原蛋白、及IV型胶原蛋白。4.根据权利要求1的制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其中所述的物理力量是在胶原蛋白凝胶的一个或多个部位施加于其平面的横向脉冲。5.根据权利要求1的制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其中所述胶原蛋白基质的气孔直径为0.1100pm，气孔率为10~90%，抗张强度为1200N/cm2。6.根据权利要求1的制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其中所述剌激的强度为1.0x1(T71.0x10"N/m2。7.根据权利要求1的制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其中所述剌激的频度为每分钟0.01500周期。8.根据权利要求1的制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其中步骤b)是在由弹性材料制造的培养容器中通过刺激含有细胞的凝胶而进行的。9.根据权利要求8的制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其中所述的弹性材料为聚乙烯、聚丙烯、乙烯-丙烯共聚物或者硅树脂。10.根据权利要求1的制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其中，凝胶边缘是固定的，然后将物理力量施加于胶原蛋白凝胶底部的至少一个部位，包括中央部位。11.根据权利要求1的制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其中，将所述剌激分别施加于胶原蛋白凝胶底部的至少两个部位。12.根据权利要求1的制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其中，所述刺激是由连接于凸轮轴的至少一个凸轮产生。13.根据权利要求12的制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其中，所述凸轮轴旋转速度为每分钟0.01500周期。14.根据权利要求1的制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其中，所述细胞是以每毫升溶液里1x103~1x107个细胞的浓度混合。15.根据权利要求1的制备含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质的方法，其中，所述细胞选自下组成纤维细胞、真皮鞘状细胞、真皮乳头细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、内皮细胞、骨髓内皮祖细胞、毛囊外根鞘细胞、角质形成细胞、黑素细胞、毛发细胞、来源于血液的朗格汉斯细胞、来源于血液的内皮细胞、血细胞、巨噬细胞、淋巴球、脂肪细胞、皮脂腺细胞、软骨细胞、骨细胞、造骨细胞及来源于血液的梅克尔细胞。16.胶原蛋白基质，其气孔直径为0.1~100pm，气孔率为10~90%，抗张强度为1200N/cm2。17.根据权利要求16的胶原蛋白基质，其中所述的胶原蛋白基质是根据权利要求1-15中任一项所述的方法制备的含有哺乳动物细胞的胶原蛋白基质。18.用于培养人工皮肤或人工器官的胶原蛋白支架，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的方法制备的胶原蛋白基质。19.美容或治疗用填充物，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的方法制备的胶原蛋白基质。全文摘要本发明涉及利用机械刺激系统来制备多孔性和抗张强度增高的胶原蛋白基质的方法。具体来说，将含有细胞的凝胶培养于施加物理力量的条件下，以使得基质周期性非连续地运动。所得胶原蛋白可用于制备人工皮肤或者人工器官。而且这种胶原蛋白基质可以用作美容和治疗性填充物。文档编号C12M3/00GK101305090SQ200680041563公开日2008年11月12日申请日期2006年11月6日优先权日2005年11月7日发明者崔惠铃,朴景赞,权善邦申请人:株式会社威尔斯金