专利名称：：真核细胞中变胞藻黄素的生物合成的制作方法真核细胞中变胞藻黄素的生物合成本发明涉及DNA载体、其在真核细胞的转化中的用途、转化方法和由此制备的转基因植物，所述DNA载体具有(a)编码在一个位点上由赋予抗性的氨基酸置换改变的八氢番茄红素去饱和酶蛋白的DNA序列和(b)在其中能克隆入任何DNA序列的多克隆位点。
背景技术：
：类胡萝卜素是在所有光合成生物中发现的色素。它们作为光合反应中心的组分且在抗光氧化损害的保护作用中起着重要作用。类胡萝卜素生物合成途径从双香叶基焦磷酸(GGDP)进行至变胞藻黄素。通过缩合两分子的香叶基-香叶基-焦磷酸(Geranyl-Gerany-Pyrophosphat)，八氩番痴红素合酶(PSY)形成了C40结构的八氢番茄红素。始于八氢番茄红素，八氢番茄红素去饱和酶(PDS)通过消除质子并构建入两个双键合成了《-胡萝卜素。该合成步骤的中间产物是六氢番茄红素。然后《-胡萝卜素再度在两步骤去饱和反应中转变成番茄红素，该反应通过中间产物链孢红素(Neurosporin)进行。为此负责的酶是《-胡萝卜素去饱和酶(ZDS)。番茄红素通过番茄红素环化酶(LCYB)转变成p-胡萝卜素。始于p-胡萝卜素，另外两种酶参与变胞藻黄素的形成。一方面，p-胡萝卜素酮酶(BKT)在4-和4'-位点各导入一个酮基。另一方面，通过类胡萝卜素羟化酶(CHY)在变胞藻黄素前体的离子环上的3-和3'-位点各附着一个羟基。通过过度表达来自噬夏孢欧文氏菌("re^p^ra)的细菌八氬番茄红素合酶可能影响或刺激转基因番茄中的类胡萝卜素生物合成，从而4吏合成的类胡萝卜素的量增加2至4倍(Fraser，Romer等人2002)。然而，在类胡萝卜素生物合成途径(图1)中起着中心关键作用的正是八氢番茄红素去饱和酶。已从蓝细菌(Chamovitz等人，1991;Martfnez-F6rez和Vioque，1992;Martfnez-F6rez等人，1994)和高等植物(Bartley等人，1991;Pecker等人，1992)克隆了编码八氩番茄红素去饱和酶的/&基因，并将所述基因在大肠杆菌co//)中成功地过度表达。漂白除草剂(Bleichherbizid)氟草敏已知为八氢番茄红素去饱和酶的可逆的、非竟争性抑制剂。已描述了蓝细菌的聚球藻属(Sj7ec/^coccus)的八氢番茄红素去饱和酶的突变形式；它们赋予了细菌对氟草敏的抗性。在各情况下，赋予抗性的突变基于单个氨基酸的置换。在聚球藻属中进行的突变研究的范围内，对于下列氨基酸置换发现产生抗性Argl95Pro、Leu320Pro、Val403Gly、Leu437Arg(Linden等人，1990;Chamovitz等人，1993)。尽管长久以来使用氟草敏和其他此类漂白除草剂控制杂草，但至今仍未分离出天然发生的抗性植物。在类胡萝卜素生物合成途径的中间产物和产物中，酮基类胡萝卜素变胞藻黄素尤其具有重要的商业价值。变胞藻黄素具有比类胡萝卜素生物合成途径中的其他中间产物更高的抗氧化剂活性。变胞藻黄素充当自由基和活性氧类的猝灭剂(Kobayashi和Sakamoto,l"9)、充当免疫应答的增强剂(Jyonouchi等人，1995)和充当抗癌剂(Tanaka等人，1994，1995)。因为其作为有效的抗氧化剂的天然作用的缘故，变胞藻食素也用作食品增补剂。其用作在鱼类养殖中具有着色剂作用的伺料添加剂。一些绿藻例如巴德威杜氏藻("W3a//e//a6ar&w7)和雨生红球藻(^e/z7<^ococci/s/^i/Wa//s)在逆境条件下具有积累类胡萝卜素的独特能力。在此，尤其是雨生红球藻适合用于变胞藻黄素的天然产生。雨生红球藻能够以高达其千重的4%的量积累变胞藻黄素。这是雨生红球藻在变胞藻黄素的商业生产中起着重要作用的原因，因为对于商业用途的活性物质生产，用于变胞藻黄素生产的化学合成途径是其中最昂贵的。对莱茵衣藥(C力/fl/zy^o迈o/73Sre//7A2ri/f//)和小球,菜(G/ore//a)的一些种类已经多次描述了绿藻的基因转化(Kindle1990;Lumbreras等人，1998;Hawkins和Nakamura，1999;Kim等人，2002)。因为其代谢的缘故，这两类藻在类胡萝卜素的大规模天然产生方面对人的吸引力不足。Teng等人(20(J3)已对雨生红球藻的基因转化进行了描述。通过微粒轰击已将在SV40启动子控制下的p-半乳糖苷酶报告基因lacZ整合入藻的基因组。借助于光学技术必须个别地检测和选择成功转化的藻细胞。用lacZ基因转化的藻细胞对有毒的或显性作用的选择剂不具有抗性。尽管在过去10年中已对变胞藻黄素的生物合成进行了详细研究(Lu等人，1995;Fraser等人，1998),但在生物技术工业规模上通过雨生红球藻生产变胞藻黄素仍然面临许多问题，因为，尤其是在变胞藻黄素生物合成过程中细胞分裂受到抑制(Boussiba和vonVonshak，1991)。本发明的任务是提供DNA载体，所述DNA载体可用于将真核细胞特别是藻类如雨生红球藻的基因组以适当方式进行基因改变，以使能够影响或增加天然类胡萝卜素和类异戊二烯的体内合成和尤其变胞藻黄素的生物合成。本发明的另一个任务是提供载体，所述载体可用于作为真核细胞特别是藻类如雨生红球藻的转化的显性选择标记和使得能够以简单的方式选择成功转化的真核细胞特别是藻类如雨生红球藻的细胞。本发明通过包含(a)编码在一个位点具有赋予抗性的氨基酸置换的八氢番茄红素去饱和酶蛋白的DNA序列和(b)可克隆入任何DNA序列的多克隆位点的载体来实现该任务。在此本发明的载体包含可用作运载工具的任何DNA分子，借助于所述分子将外源DNA导入细胞。它们包括粘粒、噬菌体、病毒、YAC、BAC、线状DNA分子和尤其是环状质粒。在本发明的范围内，已从基因组DNA文库分离了来自雨生红球藻的八氢番茄红素去饱和酶(PDS)的DNA序列并对该序列进行了测序(SEQIDNO:1)。雨生红球藻八氢番茄红素去饱和酶的相应的蛋白质序列示于SEQIDNO:2。本发明的主题包括考虑到编码蛋白质序列SEQIDN0:2的遗传密码的简并性的所有核酸序列。优选载体是其中(a)编码八氢番茄红素去饱和酶蛋白的DNA序列(p^基因)优选来源于雨生红球藻并且通过定向突变已导入赋予抗性的氨基酸置换的DM载体。特别优选的载体是编码在其氨基酸序列(SEQIDNO:3)的位点504上具有从亮氨酸至精氨酸的氨基酸置换的雨生红球藻八氢番茄红素去饱和酶蛋白的载体。根据本发明在雨生红球藻PDS蛋白的位点504上从亮氨酸至精氨酸的氨基酸置换相应于聚球藻尸(X7夕"中的Leu437Arg置换(图2)。为此通过定向突变用Arg的密码子"CGC"取代Leu的密码子"CTG"。该突变赋予突变体对氟草敏的已知最高的抗性。已介导的抗性赋予本发明的突变体对氟草敏的抗性比野生型高多至70倍。根据本发明，将0.5-50^n的氟草敏浓度用作选择物质。雨生红球藻的氨基酸序列中对于氨基酸置换优选的其他位点是精氨酸264、亮氨酸388、缬氨酸465(图3)。在聚球藻中，对于在同源位点上的氨基酸置换已知具有抗性赋予的效果。介导转化子对除草剂尤其是漂白除草剂，特别优选氟草敏的抗性的载体是优选的。在本发明的范围内，多克隆位点(MCS)，也称为多接头，理解为表示是指核酸序列中的这样的区域，即该区域具有许多不同的可利用的限制性内切酶的切割位点，同时当限制性水解发生时不对核酸序列的其他元件的功能产生不利影响。优选，DNA分子只在一个位点被在MCS中切割位点确定的限制性内切核酸酶水解。来自商购可获得的栽体和质粒的常规MCS的实例对于本领域技术人员来说是熟知的。在本发明的意义内，MCS进一步理解为是指载体内的任何限制性切割位点，所述切割位点可用于以定向或非定向的方式将任意DM序列克隆入载体序列而在该过程中没有对本发明的载体的其他功能元件产生不利影响。本发明中优选的MCS的实施方案示于SEQIDNO:4。在优选实施方案中，本发明的DNA载体具有序列SEQIDNO:5(也参见图4)。本发明优选涉及这样的DNA载体，其作为包含编码序列的在多克隆位点待克隆入的任意DNA序列。编码序列理解为意指编码完整的活性蛋白或具有生物学活性的蛋白质片段的任意DNA序列。植物来源的编码序列是特别优选的。此外包含至少一个启动子序列的编码序列是特别优选的。在此优选启动子是使在其控制之下的编码序列能够组成型转录或表达的启动子。优选启动子是P-微管蛋白启动子。选自雨生红球藻肌动蛋白基因(SEQIDN0:6)和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(SEQIDNO:7)的启动子的启动子序列是特别优选的。本发明还涉及其中除了至少一个启动子基因外还包含待表达的功能基因的编码序列的DNA载体。在此特别优选的是包含选自类胡萝卜素生物合成基因、变胞藻黄素生物合成基因和类异戊二烯生物合成基因的编码序列的DNA载体。p-胡萝卜素酮酶、类胡萝卜素羟化酶、《-胡萝卜素去饱和酶、/^氢番茄红素合酶、Leucopin-环化酶、脱氧木酮糖合酶和l-脱氧木糖-5-磷酸还原异构酶的基因序列是特别优选的(Berthold等人，2002，Hallmann和S卿er，1996，Mahmoud和Croteau,2001)。本发明还涉及本发明的载体用于转化真核细胞，特别是单细胞植物细胞的用途。特别优选使用本发明的载体进行藻类细胞特别是雨生红球藻细胞的转化。在本发明的范围内，转化理解为意指将外源DM导入生物。本发明的载体作为用于转化目的的选择标记的用途也是本发明的主题。在此特别优选的是用作显性选择标记的用途。本发明的意义内的选择标记给经转化的生物赋予了便于将该生物与相同物种的未转化的生物区分的性质。显性选择标记理解为意指介导特性的标记，依靠所述特性，可在物种内施加选择压从而使在相同物种的经转化的和未转化的生物群体中只可获得经转化的生物。通过向生长培养基中加入氟草敏，可能例如从在这些条件下不能存活的未转化的细胞中选择已用本发明载体SEQIDN0:4成功转化的雨生红球藻细胞。根据本发明使用0.5-50|am的氟草敏浓度进行转化体的选择。可在液体培养基中或通过向营养培养基板中加入除草剂进行选择。通过使用突变的PDS作为用于真核生物特别是藻类如雨生红球藻的转化的第一显性选择标记，本发明为真核生物特别是藻类如雨生红球藻的生物技术学利用提供了重要的贡献。例如，可在将编码序列插入或不插入MCS的情况下使用本发明的载体以影响或改变类胡萝卜素在转化体中的生物合成。本发明还涉及使用本发明的载体转化真核细胞的方法。此类转化方法对于本领域技术人员来说是熟知的。它们包括例如PEG、玻璃珠的使用、电穿孔和微粒轰击。根据本发明其中通过微粒轰击进行转化的方法是特别优选的。在此优选的实施方案是使用之前用本发明的载体DM包被的大小为0.4至1.7nm的钨或金颗粒在500至"00psi的压力下和真空中进行的微粒轰击。在转化后，优选在黑暗中在振荡过夜的情况下在OHA液体培养基(2.42gTris/醋酸盐pH6.8)中再生细胞。然后在选择压下将细胞涂板在具有0.7%的OHA琼脂糖的OHA板上。在等长的光照(15-25Wm+s。和黑暗间隔(在各情况下6至12小时)的光照-黑暗-交替下在3至4周后可观察到转化体。转化效率是大约1'10-4至io'io—8个细胞/]ugdm，优选rio-6个细胞/ngdna。本发明另外地包括在用本发明的DNA载体转化后的转基因植物细胞和其后代，所述转基因植物细胞和其后代的特征在于其表征了导入的DNA进入细胞核基因组的整合。在此展示单个或多个导入的DNA进入细胞核基因组的整合的转基因植物细胞和其后代是优选的。特别优选的是其中导入的基因组成型表达的转基因植物细胞和其后代。SEQIDN0:1:编码雨生红球藻八氢番茄红素去饱和酶蛋白的pds基因的核酸序列SEQIDNO:2:雨生红球藻八氢番茄红素去饱和酶的蛋白质序列SEQIDNO:3:具有Leu504Arg氨基酸置换的八氢番茄红素去饱和酶的蛋白质序列SEQIDNO:4:本发明的载体Plat-pdsMod4.1的MCS的核酸序列SEQIDNO:5:优选DNA载体Plat-pdsM0D4.1的核酸序列SEQIDNO:6:包含肌动蛋白启动子(Smal片段)的核酸序列。核酸序列包含具有内含子、外显子和标示(-)的启动子序列的编码区。SEQIDNO:7:包含rbsc启动子(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基)的核酸序列(Pstl片段)。核酸序列包含具有外显子、内含子和标示的启动子序列的编码区。图1:香叶基-香叶基焦磷酸至变胞藻黄素的类胡萝卜素生物合成途径。图2:来自聚球藻和雨生红球藻的具有已知的突变和针对氟草敏的抗性因子(RF)的八氢番茄红素去饱和酶比较。图3:来自雨生红球藻和聚球藻的PDS蛋白的氨基酸序列比对。标示了赋予针对氟草敏的抗性的氨基酸置换的优选位点。图4:载体Plat-pdsMod4.1的质粒图语；MCS(多克隆位点)、ori(复制起始区)。图5:在用Xbal和Xhol降解后，然后用八氢番茄红素去饱和酶探针检测后，基因组DNA的Southern印迹。标记(M)以千碱基(kb)表示。图6:(A)置于连续强光压迫(120iaE'nTs。下的三个WT品系(WT0、18和36小时)和转化体P1-P13的Northern印迹分析。(B)使用抗八氢番茄红素去饱和酶蛋白的抗体进行的Western印迹。条带以经折算为55kDa的高度迁移。八氢番茄红素去饱和酶mRNA(p&)，类胡萝卜素羟化酶mRNA(力7力，八氢番茄红素去饱和酶蛋白(PDS)。图7:非光化学猝灭(NPQ)的说明。NPQ-(F。ffl-Pn)/Pra。F是在饱和光脉冲后适应暗光的生物的最大荧光。F、是在以20秒的确定间隔的饱和光脉冲后的最大萸光。图8:在不加入除草剂的情况下，在连续光照(175nEm、。下酮基类胡萝卜素、变胞藻黄素在WT雨生红球藻和两个转化体(P3，P13)中的积累的描述。干重(DW)，以小时(h)表示的时间。图9:用于在核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基(rbcS2)的启动子控制下的羟化酶基因(hyd)的组成型表达的转化载体。实施例用于转化雨生红球藻的转化载体的制备从雨生红球藻的基因组DNA文库分离大小为6.1千碱基的八氢番茄红素去饱和酶的部分，然后通过限制性切割位点Xbal和Xhol将其亚克隆入pBluescriptSK载体(Stratagene)的多克隆位点(MCS)。使用引物PDS-Qmut-plu2CCAAGCAGAAGTACCGCGCCTCCATGGAGGG和PDS-Qmut-min2CCCTCCATGGAGGCGCGGTACTTCTGCTTGG通过定向突变进行从CTG至CGC的核苷酸置换；质粒称为pPDS-Q2。该核苷酸置换导致密码子504中从亮氨酸至精氨酸的氨基酸置换(图2)，并赋予突变体对氟草敏的抗性。始于质粒pPDS-Q2，用特定的引物通过PCR消除末端限制性切割位点Xbal和Xhol,并且导入两个新的EcoRV切割位点。通过这些限制性切割位点，将突变的八氢番茄红素去饱和酶基因亚克隆入pBluescriptSK载体的Nael切割位点。从而使载体的多克隆位点(SEQIDNO:4)对于其他克隆是自由的。所制备的转化平台称为Plat-pdsMod4.1(图4)。使用转化载体Plat-pdsMod4.1对雨生红球藻进行的转化将雨生红球藻细胞在标准条件(12小时光照(20)iE'm—2.s—:)和12小时黑暗的光照-黑暗-交替)下在液体培养基中培养4天直至3.5'105个细胞/ml的细胞密度(Kobayashi，Kakizono等人，199D。在16。C和4000xg下对细胞离心5分钟，然后重悬浮，在各情况下将1'108个细胞涂板在尼龙滤器上(Roche)。将滤器转移至OHM培养基板(Fabregas,Dominguez等人，2000)然后进行干燥直至进行转化。按照用Klein和其合作者的方案(Klein,Wolf等人，1987)用2ngPlat-pdsMod4.1载体DNA包被大小为0.4-1.7nm的鴒颗粒。使用购自Bio-Rad公司的基因枪PDS-1000/He在1350psi的压力下和25mmHg的真空下进行转化。或者，保持标准设置。转化后，在黑暗中轻轻振荡过夜的条件下在0HA液体培养基(2.42gTris/醋酸盐PH6.8)在尼龙滤器上再生细胞。此后，短暂离心细胞，然后将其与0.7%0HA顶层琼脂糖一起涂板在10至20块OHA板(5^iM氟草敏)上。在12小时光照(20nE'nf2's。和l2小时黑暗的光照-黑暗交替下在3至4周的生长期后观察第一转化体。转化效率是大约ri0"个细胞/ngDM。用载体Plat-pdsMod4.1转化的细l包的分子分析将阳性转化体重复接种在具有0.7|iM的氟草敏浓度的0HA板上。在这些浓度上，WT细胞的生长受到极大抑制。为了使转化体经历通过Southern、Northern和Western印迹分析进行的分子分析，将转化体培养在具有3^iM的氟草敏浓度的液体培养基中。Southern印迹分析，转化质粒在雨生红球藻的基因组中的整合的验证在液体培养基中在3^M的氟草敏浓度下在标准条件下培养4天后，通过离心分离细胞，然后从不同的转化体和几个WT对照分离基因组DNA。用限制性酶XbaI和Xhol降解获得的基因组DNA,然后在0.8%强度的琼脂糖凝胶进行分离。使用标准方法印迹DNA，然后用PDS的探针对其进行杂交(图5)。Southern印迹在所有转化体和WT中清楚地显示大约5.9kb的内源八氢番茄红素去饱和酶。在所有情况下额外整合的突变的八氢番茄红素去饱和酶在内源八氢番茄红素去饱和酶的上方迁移。根据其他生物例如真菌粗糙脉孢菌(Wewro^pora已知载体通常以串联重复的形式整合入基因组(Cogoni和Macino1997)。该现象解释了转化体P6、7、11和P13中的非常显著的条带。也用转化载体Plat-pdsMod4.1的抗氨节西林盒的探针额外地对基因组DM杂交。在这些条件下，在除了转化体P3外的所有情况下可见几条明显的条带。转化体P1-P13的Northern和Western印迹分析在液体培养基中在3jiM的氟草敏浓度下在标准条件下培养4天后，通过离心分离细胞，然后从各种转化体和多个WT对照分离RNA。为了进一步分析转化体的转录模式，在1°/。的变性琼脂糖凝胶上分离RNA样品，将其印迹，然后用八氢番茄红素去饱和酶mRM(/&)和类胡萝卜素羟化酶mRNA(A^)的探针对其进行杂交(图6A)。将羟化酶用作内标准用于能够说明转化体的压力状态。在压力条件例如由光照或盐引起的压力下诱导羟化酶，否则其在检测极限之下(Steinbrenner和Unden2001;Steinbrenner和Linden2003)。为获得蛋白质样品，同样在标准条件下培养4天后收获细胞，然后在12.5%的SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。使用特异性抗体检测八氢番茄红素去饱和酶蛋白(Grunewald，Eckert等人，2000)。已置于连续强光条件(120nE'm+s，下的WT细胞显示对于八氢番茄红素去饱和酶。")在诱导时间点(第0小时)上的P"基因的基础表达。在18小时的过程中该信号增加。在这些诱导条件下类胡萝卜素羟化酶的行为是足够的，但转录有些延迟。在标准条件下在第0小时，转化体P1、P2、P5和P6的八氢番茄红素去饱和酶mRM的表达模式与WT的基础表达相当。转化体P8、P9和P10的表达水平比第0小时的WT的基础表达水平低一些。在两个进一步的独立的Northern印迹分析中，转化体P8、PQ和P10的表达相应于第0小时的WT的基础表达。此处，转化体P3、P4、P7、Pll、P12和P13在此显示与在第0和第18小时之间的连续强光对照相比提高的转录水平；在两个进一步的独立Northern印迹分析中同样观察到该现象。在该情况下，增加不能归因于压力产生的诱导，但可归因于转化载体Plat-pdsMod4.1在雨生红球藻的基因组中的多重整合。作为压力对照的类胡萝卜素幾化酶的表达在这些标准条件下未显示增加的转录水平。在使用抗PDS的抗体的Western印迹中，蛋白质的量均匀地增加至第36-小时-值(图6B)。所有转化体的蛋白质的量稍微高于WT对照的第0小时的值。转化体P3、P5、P7、Pll和P13的蛋白质的量对比其他水平再度增加并且可与在连续强光条件下的WT的18-小时-值的蛋白质的量相当。也可在转化体P3、P7、Pll和P13的蛋白质水平上观察到八氢番茄红素去饱和酶的更高的转录水平。Plat-pdsMod4.1转化体的生理学研究Plat-pdsMod4.1转化体的非光化学猝灭(NPQ)的确定过去已对一些具有改变的类胡萝卜素生物合成的高等植物进行了较详细的研究。因此，已用来自噬夏孢欧文菌的八氢番茄红素去饱和酶基因cr〃转化烟草(Misawa，Yamano等人，1"3)。在所得的转化体中的一个转化体(称为ET4-208)中，确定到针对氟草敏的较高的抗性。稍后也检测到与未转化的对照相比，转基因cr〃植物中的改变的类胡萝卜素组成(Misawa，Masamoto等人，1994)。研究转基因植物中的类胡萝卜素组成的变化的可能性是测量叶绿素荧光。首先，这是筛选光合突变体的非常快速的方法；第二，叶黄素含量的改变反映在叶绿素荧光上(Niyogi，Bjorkman等人，l"7)。在标准条件下在不含氟草敏的0HA板上培养各种转化体3至4周。在测量之前，将板经历黑暗适应24小时。使用PAM荧光计(Walz，Germany),测量所有转化体的叶绿素荧光，然后通过下式NPQ-(F。ra-PJ/PJ十算NPQ。F是在饱和光脉沖后适应黑暗的生物的最大荧光。Pm是在以确定的间隔饱和光脉冲后的最大荧光；在我们的情况下，间隔是20秒。KateMaxwell和GilesN.Johnson撰写了关于该主题的优秀综述论文(Maxwell和Johnson2000)。所有被测量的转化体，除了P3和P13外，显示与野生型(WT)相似的荧光曲线和NPQ曲线。转化体P3和P13的NPQ在整个测量过程中比在WT的情况下高大约50%(图7)。在不加除草剂的情况下WT雨生红球藻和三种转化体中的着色的类胡萝卜素的分布比较在不加除草剂的液体培养基中在标准条件下培养转化体4天，然后通过离心分离细胞并将沉淀冷冻干燥。确定沉淀的干重，在加入曱醇情况下在研钵中捣碎细胞。使用光度计测量叶绿素，然后通过加入6。/o的KOH进行皂化。在石油醚/醚(沸点35'C-60X:)(9:lv/v)中溶解类胡萝卜素，蒸发浓缩并在100%的丙酮中吸收。然后通过HPLC柱分离样品。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表l:雨生红球藻WT和八氢番茄红素去饱和酶转化体P1、P3和P13的总的色素提取物的HPLC分析。总类胡萝卜素的类胡萝卜素的百分数分布。如可从表1容易地看到的，WT和转化体P1中的个体类胡萝卜素的百分数分布非常相似。在比较中，转化体P3和P13中类胡萝卜素的组成已发生显著的改变。在P3中，叶黄素类(Xanthophylle)增加大约6。/。而p-胡萝卜素含量与WT相比减少了相同的值。在转化体P13中，堇菜黄质含量增加大约3%。在标准条件下不能测量直接参与NPQ过程的玉米黄质。对此需要已经历强光压力的细胞的HPLC测量。然而，转化体P3和P13的大约3%的堇菜黄质含量的增加仍然允许与这些转化体的增加的NPQ直接偶联，因为在强光条件下堇菜黄质库转变成玉米黄质。雨生红球藻转化体P3、P13和WT在弱光条件下的类胡萝卜素组成已知烟草中来自噬夏孢欧文菌的pds基因的异源表达改变了叶中的类胡萝卜素组成(Misawa等人，(1994))。抗氟草敏的聚球藻突变体的分析证实了八氢番茄红素去饱和是蓝细菌中类胡萝卜素的生物合成的限速步骤(Chamovitz等人，(1993))。为证实这些结果，在弱光照条件下培养P3、P13和WT雨生红球藻转化体，然后萃取所有类胡萝卜素。与干重相比，没有一个研究的转化体显示改变的类胡萝卜素的量。随后的转化体P3、P13和WT中类胡萝卜素组成的HPLC分析显示，对于转化体P3,叶黄素堇菜黄质的量略有增加，然而叶黄质和新黄质(Luthein)的量略有减少。在连续强光照下、在不加入除草剂的情况下WT雨生红球藻和转化体P3和P13中酮基类胡萝卜素变胞藻黄素的积累的比较为进行强光实验，将雨生红球藻细胞在标准条件下培养4天。在该时期后，将光照强度从20pEn^s4增加至175nEnT2s—、和将光照/黑暗节律增加至24小时的连续光照。在诱导后的某些时间点(第0、6、12、24、48、72小时)上，收集样品并离心。依照Boussiba等人，(1992)描述的方法进行类胡萝卜素的萃取。通过该方式确定冷冻干燥的细胞的干重(TG)，再次将材料在加入海沙、30%曱醇和5°/KOH的研钵中捣碎。在7(TC下急化叶绿素10分钟后，以4000转每分离心样品5分钟，然后弃去含有叶绿素的上清液。将沉淀在100。/。DMSO(二甲基亚砜)中吸收和在70'C下加热IO分钟。重复该萃取步骤直至沉淀失去其淡红色。变胞藻黄素和其酯在492mn具有其主吸收的最大值。然而，放弃在该波长的测量，因为总类胡萝卜素(主要为I3-胡萝卜素、叶黄质和堇菜黄质)也在该波长范围内显示吸收。借助于变胞藻黄素标准(Sigma，在100%DMSO中)确定了允许在其中不再显示总类胡萝卜素的波长范围(550nm)内确定变胞藻黄素含量的折算因子。因此，只在492nm(A492)的波长处和随后在550nm(Ass。)的波长处测量变胞藻黄素标准。然后将在550nm测量吸收值乘以系数Aw/A55。=3.2，使用Davies(1976)的公式利用变胞藻黄素吸光系数(El%/1cm=2220)计算变胞藻黄素含量。在改变光照条件6小时后，仍然未被检测到变胞藻黄素(图8)。在暴露于强光8小时后，转化体P3显示了可见的红色表型，而WT和其他转化体仍保持绿色。在12小时的诱导后，WT和转化体P13中形成的变胞藻黄素的量达到1.47mg/gTG和1.32mg/gTG;相反地，转化体P3已达到的值为2.37mg/gTG。在24小时后，测量的WT和转化体P13的变胞藻黄素的量分别是3.48mg/gTG和3."mg/gTG。在该时间点上，转化体P3以6.22mg/gTG的变胞藻黄素的量相对于野生型显示大约40%的增加。在连续强光下48小时后，WT和P13转化体分别显示8.6±1.4mg/gTG和8.4±1.6mg/gTG的值。在48小时后对于转化体P3确定了与WT或P3相比增加26%的变胞藻黄素的积累(11.4±0.9mg/gTG)。在连续光照压力后72小时，WT和P13转化体分别显示10.5mg/gTG和10.lmg/gTG的量，在此转化体P3以12.lmg/gTG的值显示了高出14%的变胞藻黄素的积累。因此，在连续强光下，转化体P3与转化体P13和WT相比在其变胞藻黄素的积累方面具有很大的差异。在连续光照实验中，与WT相比P3在24小时后显示变胞藻黄素的量增加大约40%。在48小时后该差异下降至26%,在72小时后达到14%的值。结果证明雨生红球藻中的八氢番茄红素去饱和步骤在强光条件下是限速步骤，但在弱光照条件下不是限速步骤。通过使用在组成型启动子的控制之下的胡萝卜素酮酶增加变胞藻黄素生物合成载体的构建和转化通过使用转化平台Plat-pdsMod4.1制备具有肌动蛋白基因或二磷酸核酮糖羧化酶的启动子、之后是各种限制性内切核酸酶的克隆位点的转化质粒；从基因组DNA文库分离这两种启动子。这些平台还包含各自基因的3'-非翻译区，该非翻译区也充当导入的cDNA的多腺苷酸化信号。通过PCR扩增类胡萝卜素羟化酶和p-胡萝卜素酮酶的cDNA并为其提供末端限制性切割位点。这使得可能将这些cDM按读框导入转化平台。也为这两个类胡萝卜素生物合成基因的基因组DM制备所述构建体。图9显示用于在核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基启动子的控制之下的羟化酶基因的组成型表达的转化载体。在肌动蛋白启动子的控制下以不同的翻译起始克隆cDNA和羟化酶基因组序列的三个构建体和在核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子的控制下各克隆一个构建体，然后转化入雨生红球藻。通过将氟草敏浓度从5|uM减少至3^M来降低选择压。经此还应获得一方面具有对氟草敏更低抗性，另一方面其生长机会因为代谢平衡向玉米黄质或角黄素推移而降低的转化体。该平衡的推移可能意味着，例如，减少的叶黄质的形成，所述叶黄质于类嚢体膜中对天线复合物(Antennenkomplexen)的聚集起着重要作用。叶绿素的形成或生育酚的形成，也可能受到该推移的影响，因为这些物质同样从非常早期的类异戊二烯生物合成中离去。转化体的选择在转化后，将获得的集落转移至具有氟草敏的其他培养基板。此后，将各个构建体的15个转化体在非常低的选择压下转移入液体培养基。在进一步的生长期后，该生长期中没有一个转移的转化体显示角黄素或玉米黄质的明显的类胡萝卜素积累，将细胞置于强光(120Wm—2's—"下24小时。在核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子(Plat-rbcS2gHyd)和第二肌动蛋白启动子(Plat-ActPII-gHyd)(第二翻译始于一个内含子)的控制下的基因组DNA的羟化酶构建体转化的转化体与其他羟化酶构建体的转化体相比没有显示赤褐色着色的细胞。在酮酶构建体转化体的情况下，将在第二肌动蛋白启动子(Plat-ActPIIgBkt和Plat-ActPIIcBkt)(第二翻译始于内含子)控制下用cDNA和酮酶基因转化的转化体进行进一步的研究。羟化酶构建体的Southern印迹和Northern印迹分析在各情况下在15个筛选前的转化体中选择10个并进一步培养用于分子生物学研究。在已分离个体转化体的基因组DM后，将它们经历限制性内切酶降解，然后在琼脂糖凝胶上分离，进行印迹和用针对羟化酶的探针杂交。在第二肌动蛋白启动子(Plat-ActPII-gHyd)的控制之下的10个转化体中，两个转化体明确地显示基因组中存在额外的羟化酶拷贝。在核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子(Plat-rbcS2gHyd)的控制之下的10个转化体中，6个在基因组中具有额外拷贝是阳性的。为了有利于处于不利生长的转化体而在选择板上减少氟草敏浓度明显地对选择具有负效应。提取剩余转化体的RNA，然后在变性琼脂糖凝胶上进行分离，将其进行印迹和用针对羟化酶mRNA的探针进行杂交。转化体中的二个显示增加的羟化酶mRNA的转录水平。使用针对类胡萝卜素生物合成基因p-番茄红素环化酶和八氩番茄红素合酶的其他探针的对照实验在这两个转化体中也显示增加的转录水平。参考文献:1.Teng,C.,Qin,S-^Uu丄'Yu,D.,LiangC.undTseng,C.2002.Transientexpressionof/acZinbombardedunicellulargreenalga〃a抓atococa/sp/uv/a//s.Journ&lofAppliedPhycology14:.495-500.2.Boussiba,S.undVonshak，A.1991.AstaxanthinaccumulationinthegreenalgaWaematococcusp/i/Wa//s.PlantCellPhysiol.32:1077-1082.3.Fraser，P.D.,Shimada，H.undMisawa,N.1998.Enzymicconfirmationofreactionsinvolvedinroutestoastaxanthinformation,elucidatedusingacjirectsubstratew'froassay.Eur.丄Biochem.252:229-236.4.Hawkins,R丄.und'Nakamura,M.1999.Expressionofhumangrowthhormonebytheeukaryoticalga,CWore〃a.Curr.Microbiol.38:335-341.5.Jyonouchl,H.,Sun,S.undGross,M.1995.Effectofcarotenoidson/nV7'〖roimmunoglobulinproductionbyhumanperipheralbloodmononuclearcells;astaxanthin,acarotenoidwithoutvitaminAactivity,enhances/nv/froimmunoglobulinproductioninresponsetoaT-dependentstimulantand曰ntigen,Nutr.Cancer23:171-183.6.Kim,D.H.,Kim,Y.T.,Cho,丄丄，Bae,丄H,undHur，S.B.2002.StableintegrationandfunctionalexpressionoffloundergrowthhormonegeneintransformedmicroalgaC/tore//ae附psofctea.MarineBiotech.4:63-73.7.Kindle,K丄.1990.High-frequencynucleartransformationofC/7/amyctomonasre/'nharcW.Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1228-1232.8.Kobayashi,'M.undSakamato,Y.1999.-.SingtetbxygenquenchingabilityofastaxanthinestersfromthegreenalgaHa抓atococct/sp/wv/a//s.Biotech.Lett.21:265-269.9.Lu,E.,Vonshak,A.,Gubbay,R.'Hirschbarg,丄undBoussiba,S.1995.ThebiosyntheticpathwayofastaxanthininagreenalgaWaematococcusp/tiv/a/''sasinducedbyinhibitionwithdiphenylamine.PlantCellPhystol.36:1519-1524.10丄umbreras,V.,Stevens,D.R.undPurton,S.1998.EfficientforeigngeneexpressioninC/7/a/nyctomo"ss/e/nhard//'mediatedbyanendogenousintron.Plant丄14:441447.11.Tanaka,T.,Makita，H.,Ohnishl,M"Mori,H.,Satoh，K.undHara,A.1995.Ch抓opreventionofmouse-urinarybladdercarcinogenesisbythenaturallyoccurringcarotenoidsast欲anthin.Carcinogenesis15:15-19.12.Chamovitz，D.,Sandmann,G.undHirschberg,丄1993.Molecularandbiochemicalcharacterizationofherbicide-resistantmutantsof■cyanobacteriarevealsthatphytoenedesaturatlonisarate~limitingstepincarotenoidbiosynthesis.TheJournalofBiologicalChemistry,vol.268,no.23,S.17348-17353,13.Martfnez-F6rez,l.,Vioque，A.undSandmann,G.1994.MutagenesisofanaminoacidresponsibleinphytoenedesaturasefromSynecAocysf/sforbindingof.thebleachingherbicidenorflurazon.PesticideBiochemistryandPhysiology48:185-190.14.Mart〖nez-F§re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