用于将基因导入淋巴细胞或血细胞中的启动子及其应用的制作方法

专利名称：用于将基因导入淋巴细胞或血细胞中的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于将基因导入淋巴细胞或血细胞中的启动子以及其
应用
背景技术：
为了治疗以淋巴细胞为耙的各种疾病，例如人免疫缺陷病毒(HIV) 感染，亟待建立针对淋巴细胞实施基因治疗的技术。但是，迄今尚未开 发出令人满意的、向淋巴细胞导入所需基因的载体系统。
疱渗病毒(HHV)是属于疱渗病毒属的病毒的总称。人疱渗病毒6 和7 (HHV-6和HHV-7)均是属于疱渗病毒属|3疱渗病毒亚属的双链 DNA病毒，是引发幼儿急诊的病毒(Yamanishi K.等人，"Identification of human herpesvirus 6 as a casual agent for exanthem subitum" , Lancet 1988; i:1065-1067以及Tanaka K.等人，"Human hempesvirus 7: Another casual agent for roseola ( exanthem subitum )，， , J. pediatr., 1994; 125: 1-5) 。 HHV-6包括HHV-6A和HHV-6B两抹。它多在幼儿期患病， 引起以突发高热以及在退热前后发渗子为特征的病毒感染症， 一般预后 良好。由于HHV-7感染具有比HHV-6感染迟的倾向(TanakaK.等人， "Seroepidemiological study of human herpesvirus-6 and -7 in children of different ages and detection of those two viruses in throat swabs by polymerase chain reaction" , Journal of Medical Virology, 1996; 48: 88-94),故从临床经验来看，由HHV-7引起的幼儿急诊多为第二次幼 儿急诊。有报道称，血清流行病学检查发现，几乎所有儿童在2-3岁 前均表现为HHV-6和HHV-7抗体阳性，隐性感染率为20 - 40 % 。
HHV-7是1990年Frenkel等人在培养健康正常人末梢血的CD4 + T 淋巴细胞过程中发生了细胞病理效应而发现的疱渗病毒(Frankel N.等 人, "Isolation of a new herpesvirus from human CD4+T cells" , ProNAS USA, 87: 749-752， ProNAS USA, 87: 749-752, 1990)。它是从人末 梢血单核细胞中分离出来的病毒。HHV-6、 HHV-7均为嗜CD4 + T淋巴 细胞的病毒。HHV-7通过细胞表面的CD4受体进行感染，它只能在人T淋巴细胞中增殖。因此，HHV-7是可用来对人T淋巴细胞进行基因修饰 的病毒。
HHV-7的基因组为双链DNA，约145kbp。 Nicholas等人已测定出 了其全部的碱基序列，已知其基因组中至少存在101个基因(JohnN. 等人，Journal of Virology ， Sep. 1996, 5975 - 5989 )。
然而，对于这些HHV来说，目前还没有对它们的启动子活性进行 详细分析。此外，淋巴细胞对这些病毒具有特异性，这是由于这些病毒 与细胞中的受体相互作用，以及这些病毒仅能够在人T淋巴细胞中增殖 的生活周期。
此外， 一般认为这些病毒对健康的正常人几乎没有危害，特别是 HHV-7。将含有各种病毒(如腮腺炎病毒)的抗原决定簇的基因整合到 HHV-7病毒基因组中并在HHV-7中进行表达，则HHV-7可用作为疫苗。 但是，当HHV-7作为疫苗时，其在传代培养的同时基因型会发生变化， 从品质管理和品质保证的角度考虑，这是不优选的。因此，将重组病毒 作为疫苗使用时，需要稳定地提供源于单一的重组基因型的病毒。为此， 需要开发出制备具有单一基因型的HHV-7重组病毒的方法。
再有，人们研究了 T淋巴细胞抹SupTl细胞中HIV感染和亲T淋 巴细胞的人疱渗病毒(HHV-6A(U1102抹)、HHV-7(MRK, MSO株)) 之间的关系。HHV-7抹结合细胞表面的CD4受体，能在SupTl细胞中 很好地增殖，但其不能感染SupTl/HIV细胞。相反地，已经认识到 HHV-6A抹可感染经HIV持续感染的SupTl细胞(SupTl/HIV)并呈现 出明显的CPE ( Masao Yamada等人，"HIV Jizokukansen SupTl Saibo heno HHV-6 oyobi -7 Choufukukannsen no Kokoromi ( Attempt for HHV-6 and -7 Superinfection to HIV Persistent Infection Sup匿Tl Cell) ，， , Title No. 122, Titles and Abstracts of the 7th Annual Meeting of the Japanese Society for AIDS Research, 1993, Tokyo)。
理想的HIV疫苗能够产生针对所有类型HIV的优良而持久的保护 作用。另一方面，传统的灭活HIV疫苗有优势也有缺陷，下文将进行部 分说明。 一种制备重组疫苗的方法采用常规技术。然而，由于其难以维 持免疫原性(immunogemcity )(免疫原性4氐)，需要4吏用佐剂进4亍大 剂量的抗原负载和频繁地接种。安全性是最值得关注的。含有棵露的或 重组的亚单位的亚单位疫苗是安全的。然而，由于使用亚单位并且免疫原性低，该疫苗需要用佐剂进行大剂量的抗原负载以及频繁地接种。而 且，安全性是最重要的问题。此外，含有棵露的或重组的亚单位的亚单 位疫苗可能是安全的，但是由于这些亚单位的选择性差以及免疫原性低 而受到限制，因此，需要开发用于处理免疫应答细胞的有用疫苗，如 HIV疫苗等等。Yamanishi K等人, "Identification of human herpesvirus 6 as a casual agent for 做6"謂."，Lancet 1988; i:
pp.1065-1067Tanaka-Taya K等人， "Seroepidemiological study of human herpesvirus-6 and -7 in children of different ages and detection of those two viruses in throat swabs by polymerase chain reaction" , Journal of Medical Virology. 1996; 48: pp.88-94 Frankel N等人，"Isolation of a new herpesvirus from human CD4+T cells." , ProNAS USA 87: 749-752, ProNAS USA 87: 749-752, 1990John N.等人,Journal of Virology, Sep. 1996, pp. 5975-5989 Masao Yamada等人，"HIV Jizokukansen SupTl Saibo heno HHV-6 oyobi -7 Choufukukannsen no Kokoromi ( Attempt for HHV-6 and -7 Superinfection to HIV Persistent Infection Sup-Tl Cell) ，， , Title No. 122， Titles and Abstracts of the 7th Annual Meeting of the Japanese Society for AIDS Research, 1993, Tokyo

发明内容
发明要解决的技术问题
本发明的目的在于提供一种启动子，其在免疫系统细胞或血细胞 中，如在淋巴细胞中选择性地有效诱导基因表达。 解决技术问题的手段
本发明发现HHV6的MIE启动子、HHV67的MIE启动子以及HHV7的U95启动子令人惊奇地在免疫应答细胞如T淋巴细胞或血细胞系细胞 中诱导特异性表达，已经解决了上述问题。
DNA疫苗是一种诱人的新技术，在其开发过程中，有效表达的启动 子是关键的。迄今，人巨细胞病毒(HCMV)立即早期(IE)启动子被 广泛地用于DNA疫苗。这是由于一般认为总体上HCMV IE启动子在各 种细胞中具备有效活性。然而，据才艮道，HCMVIE启动子在淋巴细胞系 细胞中的表达效率低，并且出现由曱基化等原因而引起的灭活现象。而 且，还存在与多种限制相关的问题，这阻碍HHVIE启动子在DNA疫苗 中的应用。
已知HCMV能够感染有限数量的细胞，其能够感染成纤维细胞和 血液内皮细胞等。另一方面，HHV-6感染婴儿，并引起幼儿急诊或者幼 儿玫瑰渗(roseola infantum ),并且已知在人淋巴细胞特别是T细胞中， HHV-6能够很好地增殖。本发明人已经在本发明中阐明了 HHV-6的主 要立即早期基因(MIE)与HCMV—样，具有强大的启动子活性，HHV-6 属于人疱渗病毒属P疱渗病毒亚属。本发明人还阐明MIE基因启动子可 用于DNA疫苗。HHV-7也是定向CD4+T淋巴细胞的病毒，并且它的 启动子可用于开发DNA疫苗，例如该疫苗用于阻止或治疗与CD4+T淋 巴细胞相关的疾病。本发明人在本发明中还阐明HHV 7 MIE启动子和 HHV7U95启动子的效用，因此也阐明了这些启动子可纟皮用于制备DNA 疫苗。
因此，本发明提供了如下内容 (1 ) HHV6B的MIE启动子。
(2) 如1项的启动子，其至少包含SEQIDNO: l所示的序列中的 8个w比邻的核苦酸。
(3) 如1项的启动子，其至少包含SEQIDNO: l中所示的序列中 的R3区或其功能性变体。
(4) 如1项的启动子，其至少包含距离SEQIDNO: 1的转录起始 点-574到-427的序列(SEQIDNO: 13)。
(5) 如l项的启动子，其至少包含距离SEQIDNO: 1的转录起 始点-1051到-427的序列(SEQIDNO: 14)。
(6) 如l项的启动子，其包含NF-kB的基序和AP-1的基序。
(7) 如l项的启动子，其包含SEQIDNO: l中所示的序列。(8) 如1项的启动子，其中所述启动子包含(a)具有SEQIDNO: 1中所示的碱基序列或者与之对应的碱基序列或其序列片段的多核苷 酸；(b)SEQIDNO: 1中所示的碱基序列或者与之对应的碱基序列的 等位基因变体或其序列片段的多核苷酸；(c)与(a)或(b)的任何 一种的多核苷酸杂交并且具有其一种生物活性的多核苷酸；或者(d) 由(a) - (c)中的任何一种的石咸基序列或者具有至少70%同一性的互 补序列组成并且具有其一种生物活性的多核苷酸。
(9) 如l项的启动子，其长度至少为IO个毗邻的核苷酸
(10) 如8项的启动子，其中所述生物活性是启动子活性。 (11 ) 一种包含如1项的启动子的核酸构建体。
(12) 如11项的核酸构建体，其包含编码外源基因的序列，其与 该启动子不相关但是被可操作地连接到启动子序列上。
(13) 如12项的核酸构建体，其中所述外源基因编码RNAi分子、 药物、将被删除的隐性基因或者选择性标记。
(14) 如13项的核酸构建体，其中选择性标记允许在培养基中选 择其中导入了该核酸构建体的宿主。
(15) 如13项的核酸构建体，其中选择性标记允许从—见觉上选择 其中导入了该核酸构建体的宿主。
(16) 如13项的核酸构建体，其中选择性标记包含次黄噤呤鸟。票 呤磷酸核糖基转移酶(hprt)或者一种选自由绿色荧光蛋白(GFP)、 兰绿色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光蛋白(dsRed) 组成的组的荧光标记。
(17) 如13项的核酸构建体，其中选择性标记对其中导入了核酸 构建体的宿主基本上不具有毒性。
(18 )如13项的核酸构建体，其中将被删除的隐性基因选自由ADA 基因、PNP基因、yc链基因、TAP基因、MHCII基因、X-连接WASP、 CD40配体、PI3K样基因和DNA解旋酶组成的组。
(19) 如13项的核酸构建体，其中药物选自由细j包因子、趋化因 子、生长因子、蛋白激素和肽激素(如干扰素(IFN) -ou IFN-y、白介 素[IL]-2、 IL-12、粒细胞集落刺激因子[G-CSF]、粒细胞巨噬细胞集落刺 激因子[GM-CSF])组成的组。
(20) 如12项的核酸构建体，其中所述启动子在血细胞系细胞，特别是T细胞中诱导外源基因的特异性表达。
(21) —种包含如11项的核酸构建体的表达载体。
(22) —种包含如11项的核酸构建体的细胞。
(23) 如22项的细胞，其中所述细胞对于所述启动子序列来说是 异源的。
(24) —种包含如11项的核酸构建体的组织。
(25) —种包含如11项的核酸构建体的器官。
(26) —种包含如11项的核酸构建体的生物体。
(27) —种药物组合物，其包含如1项的启动子和编码一种抗原的序列。
(28) 如27项的药物组合物，其是DNA疫苗。
(29) —种用于治疗其中期望进行淋巴细胞特异性治疗的疾病、异 常或症状的药物组合物，其包含如1项的启动子以及用于所述治疗的核 酸序列。
(30) 如29项的药物组合物，其中用于所述治疗的核酸序列包含 选自由编码细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白激素、肽激素、核酶 和 R藍 ( HIV-1 gp41 :<formula>formula see original document page 18</formula>
(SEQ ID NO: 35))的那些序列组成的组的序列。
(31) 用于以淋巴细胞特异性方式地表达一种蛋白质的方法，包括
步骤
A) 制备一种核酸构建体，其中如1项的启动子^f皮可操作地连接到 编码蛋白质的核酸序列上；和
B) 将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。
(32) 用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的试剂盒，包含 A) —种核酸构建体，其中如1项的启动子,皮可操作地连接到编码
蛋白质的核酸序列上；和B)用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。
(33) 用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的试剂盒，包
含
A) 如1项的启动子；和
B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。
(34) 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋 白的疾病、异常或症状的方法，包括步骤
A) 制备其中如1项的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体；和
B) 将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。
(35 )用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋 白的疾病、异常或症状的试剂盒，包含
A) 其中如1项的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的核酸 构建体；和
B) 用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。
(36) 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋 白的疾病、异常或症状的试剂盒，包含
A)如1项的启动子；和
B )用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。
(37) —种制备蛋白质的方法，包括步骤
A) 制备其中如1项的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体；和
B) 将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。
(38) 用于制备蛋白质的试剂盒，包含
A)其中如1项的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的核酸 构建体；和B)用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。(39) 用于制备蛋白质的试剂盒，包含A) 如1项的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。(40) 如1项的启动子的用途，用于制造一种用于治疗或预防一种 需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白的疾病、异常或症状的药物组 合物。(41 ) HHV7的MIE启动子。(42) 如41项的启动子，其至少包含SEQIDNO: 2中所示的序列 中的8个毗邻的核苷酸。(43) 如41项的启动子，其至少包含SEQIDNO: 2中所示的序列 中的R2区或其功能性变体。(44) 如41项的启动子，其至少包含SEQIDNO: 2的+22到-233 的序列。(45) 如41项的启动子，其至少包含SEQIDNO: 2的+22到-388 的序列。(46) 如41项的启动子，其包含存在于R2区中的NF-kB的基序。(47) 如41项的启动子，其包含SEQIDNO: 15中所示的序列。(48) 如41项的启动子，其中所述启动子包含(a)具有SEQIDNO: 2中所示的碱基序列或者与之对应的碱基序 列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQIDNO: 2中所示的碱基序列或 者与之对应的碱基序列的等位基因变体或其序列片段的多核苷酸；(c ) 与(a)或(b)中的任何一种的多核苷酸杂交并且具有其一种生物活性 的多核苷酸；或者(d)由(a) - (c)中的任何一种的碱基序列或者 具有至少70%同一性的互补序列组成并且具有其一种生物活性的多核 苷酸。(49) 如41项的启动子，其长度至少为IO个毗邻的核苷酸。(50) 如48项的启动子，其中所述生物活性是启动子活性。(51) —种包含如41项的启动子的核酸构建体。(52) 如51项的核酸构建体，其包含编码外源基因的序列，其与该启动子不相关但是被可操作地连接到启动子序列上。(53) 如52项的核酸构建体，其中所述外源基因编码RNAi分子、 药物、将被删除的隐性基因或者选择性标记。(54) 如53项的核酸构建体，其中选择性标记允许在培养基中选 择其中导入了该核酸构建体的宿主。(55) 如53项的核酸构建体，其中选择性标记允许从—见觉上选择 其中导入了该核酸构建体的宿主。(56) 如53项的核酸构建体，其中选择性标记包含次黄噤呤鸟噪 呤磷酸核糖基转移酶(hprt)或者一种选自由绿色荧光蛋白(GFP)、 兰绿色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光蛋白(dsRed) 組成的组的荧光标^己。(57) 如53项的核酸构建体，其中选择性标记对其中导入了核酸 构建体的宿主基本上不具有毒性。(58 )如53项的核酸构建体，其中将被删除的隐性基因选自由ADA 基因、PNP基因、yc链基因、TAP基因、MHCII基因、X-连接WASP、 CD40配体、PI3K样基因和DNA解旋酶组成的组。(59) 如53项的核酸构建体，其中药物选自由细胞因子、趋化因 子、生长因子、蛋白激素和肽激素(如干扰素(IFN) -a、 IFN-y、白介 素[IL]-2、 IL-12、粒细胞集落刺激因子[G-CSF]、粒细胞巨噬细胞集落刺 激因子[GM-CSF])组成的组。(60) 如52项的核酸构建体，其中所述启动子在血细胞系细胞， 特别是T细胞中诱导外源基因的特异性表达。(61) —种包含如51项的核酸构建体的表达载体。(62) —种包含如51项的核酸构建体的细胞。(63) 如62项的细胞，其中所迷细月包对于所述启动子序列来i兌是 异源的。(64) —种包含如51项的核酸构建体的组织。(65) —种包含如51项的核酸构建体的器官。(66) —种包含如51项的核酸构建体的生物体。(67) —种药物组合物，其包含如41项的启动子和编码一种抗原 的序列。(68) 如67项的药物组合物，其是DNA疫苗。(69) —种用于治疗其中期望进行淋巴细胞特异性治疗的疾病、异常或症状的药物组合物，其包含如41项的启动子以及用于所述治疗的核酸序列。(70) 如69项的药物组合物，其中用于所述治疗的核酸序列包含 选自由编码细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白激素、肽激素、核酶 和 RNAi ( HIV-1 gp41 :TT ( SEQ ID NO: 33 ) /HIV-1 tat :TT ( SEQ ID NO: 34 ) /HTLV-1 tax :(SEQ ID NO:35))的那些序列组成的组的序列。(71) 用于以淋巴细胞特异性方式地表达一种蛋白质的方法，包括步骤A) 制备一种核酸构建体，其中如41项的启动子纟皮可操作地连接到 编码蛋白质的核酸序列上；和B) 将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。(72 )用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的试剂盒，包含A) —种核酸构建体，其中如41项的启动子被可操作地连接到编码 蛋白质的核酸序列上；和B) 用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。(73)用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的试剂盒，包含A) 々。41项的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。(74 )用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋 白的疾病、异常或症状的方法，包括步骤A) 制备其中如41项的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体；和B) 将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸序列表达的条件下。(75 )用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白的疾病、异常或症状的试剂盒，包含A) 其中如41项的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的核酸 构建体；和B) 用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。(76) 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋 白的疾病、异常或症状的试剂盒，包含A) 如41项的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。(77) —种制备蛋白质的方法，包括步骤A )制备其中如41项的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体；和B)将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。(78) 用于制备蛋白质的试剂盒，包含A)其中如41项的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的核酸 构建体；和B )用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。(79) 用于制备蛋白质的试剂盒，包含 A)如41项的启动子；和B )用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。(80) 如41项的启动子的用途，用于制造一种用于治疗或预防一 种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白的疾病、异常或症状的药物 组合物。(81 ) HHV7的U95启动子。(82)如81项的启动子，其至少包含SEQIDNO: 12中所示的序 列中的8个毗邻的核普酸。(83 )如81项的启动子，其至少包含SEQIDNO: 12所示的序列 中的R2区或其功能性变体。(84) 如81项的启动子，其至少包含SEQIDNO: 12的+ 16到-233的序列。(85) 如81项的启动子，其至少包含SEQIDNO: 12的+ 16到-379的序列。(86) 如81项的启动子，其包含存在于R2区中的NF-kB的基序。(87) 如81项的启动子，其包含SEQIDNO: 16中所示的序列。(88) 如81项的启动子，其中所述启动子包含(a)具有SEQID NO: 12中所示的碱基序列或者与之对应的碱基序列或其序列片段的多 核苷酸；(b)SEQIDNO: 12中所示的石咸基序列或者与之对应的石咸基 序列的等位基因变体或其序列片段的多核苷酸；(c)与(a) 或(b) 中的任何一种的多核苷酸杂交并且具有其一种生物活性的多核苷酸；或 者(d)由(a) - (c)中的任何一种的碱基序列或者具有至少70%同 一性的互补序列组成并且具有其一种生物活性的多核苷酸。(89) 如81项的启动子，其长度至少为IO个毗邻的核苷酸。(90) 如88项的启动子，其中所述生物活性是启动子活性。(91) 一种包含如81项的启动子的核酸构建体。(92) 如91项的核酸构建体，其包含编码外源基因的序列，其与 该启动子不相关但是被可操作地连接到启动子序列上。(93) 如92项的核酸构建体，其中所述外源基因编码RNAi分子、 药物、将被删除的隐性基因或者选择性标记。(94) 如93项的核酸构建体，其中选择性标记允许在培养基中选择其中导入了该核酸构建体的宿主。(95) 如93项的核酸构建体，其中选"^性标记允许/人碎见觉上选择 其中导入了该核酸构建体的宿主。(96) 如93项的核酸构建体，其中选择性标记包含次黄。票呤鸟。票 呤磷酸核糖基转移酶(hprt)或者一种选自由绿色荧光蛋白(GFP)、 兰绿色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光蛋白(dsRed) 组成的组的荧光标记(97) 如93项的核酸构建体，其中选择性标记对其中导入了核酸 构建体的宿主基本上不具有毒性。(98 )如93项的核酸构建体，其中将被删除的隐性基因选自由ADA 基因、PNP基因、yc链基因、TAP基因、固CII基因、X-连接WASP、 CD40配体、PI3K样基因和DNA解旋酶组成的组。(99) 如93项的核酸构建体，其中药物选自由细胞因子、趋化因 子、生长因子、蛋白激素和肽激素(如干扰素(IFN) -a、 IFN-y、白介 素[IL]-2、 IL-12、粒细胞集落刺激因子[G-CSF]、粒细胞巨噬细胞集落刺 激因子[GM-CSF])组成的组。(100) 如92项的核酸构建体，其中所述启动子在血细月包系细月包， 特别是T细胞中诱导外源基因特异性表达。(101 ) —种包含如91项的核酸构建体的表达载体。(102) —种包含如91项的核酸构建体的细月包。(103) 如102项的细l包，其中所述细i包对于所述启动子序列来il 是异源的。(104) —种包含如91项的核酸构建体的组织。(105) —种包含如91项的核酸构建体的器官。(106) —种包含如91项的核酸构建体的生物体。(107) —种药物组合物，其包含如81项的启动子和编码一种抗原 的序列。(108) 如107项的药物组合物，其是DNA疫苗。(109) —种用于治疗其中期望进行淋巴细胞特异性治疗的疾病、 异常或症状的药物组合物，其包含如81项的启动子以及用于所述治疗 的核酸序列。(110) 如109项的药物组合物，其中用于所述治疗的核酸序列包 含选自由编码细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白激素、肽激素、解 旋酶和 RNAi ( HIV-1 gp41 :TT ( SEQ ID NO: 33 ) /HIV-1 tat :TT ( SEQ ID NO: 34) /HTLV國1 tax :(SEQIDNO:35))的那些序列组成的组的序列。(111) 用于以淋巴细胞特异性方式地表达一种蛋白质的方法，包括步骤A) 制备一种核酸构建体，其中如81项的启动子^^皮可操作地连接到 编码蛋白质的核酸序列上；和B) 将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。(112) 用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的试剂盒，包含A) —种核酸构建体，其中如81项的启动子被可操作地连接到编码 蛋白质的核酸序列上；和B) 用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。(113) 用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的试剂盒，包含A) 如81项的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。(114) 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种 蛋白的疾病、异常或症状的方法，包括步骤A) 制备其中如81项的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体；和B) 将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。(115) 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种 蛋白的疾病、异常或症状的试剂盒，包含A) 如81项的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的核酸构建 体^ 和B) 用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。(116) 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种 蛋白的疾病、异常或症状的试剂盒，包含A) 如81项的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的核酸构建体的工具。(117) —种制备蛋白质的方法，包括步骤A )制备其中如81项的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的核酸构建体；和B)将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。(118) 用于制备蛋白质的试剂盒，包含A) 其中如81项的启动子#:连接到编码蛋白质的核酸序列上的核酸 构建体；和B) 用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。(119) 用于制备蛋白质的试剂盒，包含A) 如81项的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。(120) 如81项的启动子的用途，用于制造一种用于治疗或预防一 种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白的疾病、异常或症状的药物 组合物。在下文中，提供本发明的优选实施方案。应当理解，考虑到本领域 熟知和常规使用的技术，本领域技术人员基于本发明的说明，显然能够 实施这些技术方案，本发明所达到的功能和效果也是容易理解的。本发明的技术效果 本发明提供启动子，该启动子在免疫系统细胞如淋巴细胞中选择性 地诱导蛋白质表达。本发明的启动子可以用于提供方法和药物，有效地 预防或治疗免疫疾病，如先天性免疫缺陷综合症等。本发明还提供用于 有效地实施基因治疗的技术。附图简介[

图1]图1描述了在黏着细胞中启动子活性的比较。X轴排列多种 启动子，并且Vero细胞、HEL纟田月包、L929细胞、293细胞和373细 胞中的启动子活性采用对数计数方式用Log (RLU) /p-gal表示。[图2]图2描述了在淋巴细胞中启动子活性的比较。X轴排列多种 启动子，并且THP-1细胞、S叩T1细胞和U937细胞中的启动子活性采 用对数计数方式用Log (RLU) /p-gal表示。[图3]图3描述了在用TPA刺激细胞(Vero细胞)时HHV-6 MIE 区的启动子活性。在X轴上排列多种启动子，并且以对数方式用Log (RLU) /p-gal显示有或无TPA时的启动子活性。[图4]图4描述了当用TPO刺激细胞时HHV-6 MIE区(L929细胞) 的启动子活性。在X轴上排列多种启动子，并且以对数方式用Log(RLU) /卩-gal表示当有或无TPA时针对相应的启动子的启动子活性。[图5]图5描述了 HHV6B的启动子区中的各种缺失突变体的图解。 上一组显示启动子区以及该启动子区中的各种基序。[图6]图6描述了启动子活性的测定系统。[图7]图7用HHV6B中的启动子区的各种缺失突变体的图解描述 启动子活性(相对的焚光素酶活性)。[图8]图8描述与HHV7的启动子区相关的立即早期(IE)基因及 其启动子的图解。左列/人上到下显示7MIE启动子(-493 ) 、 7MIE启动 子(-388 )和7MIE启动子 (-233 ),以及右列/人上到下显示7U95启 动子(-484) 、 7U95启动子(-379)和7U95启动子(-304)。[图9]图9描述HHV7的IE启动子在淋巴细胞系中的活性。左上 图显示Jurkat细胞，右上图显示Molt-3细胞，左下图显示SupTl细胞， 以及右下图显示SAS-413细i包。各张图表/人左到右分别显示CMVP、 6MIEP、 6U95P、 7MIE (-493 ) 、 7U95和P (-484 )。[图10]图10描述R2缺失对启动子活性的影响。左上图显示Jurkat 细胞，右上图显示Molt-3细胞，左下图显示SupTl细胞，以及右下图 显示SAS-413细胞。各张图表从左到右显示7MIE启动子(-493 )、7MIE 启动子(-388 ) 、 7MIE启动子(-233 ) 、 7U95启动子(-484 ) 、 7U95 启动子(-379)和7U95启动子(-304)。[图11]图ll描述在外周血单核细胞(PBMC)中的启动子活性。 在左上图、右上图和下图中分别显示细胞系1、细胞系2和细胞系3。序列表简介 SEQIDNO: 1是HHV6B MIE启动子的序列。SEQ ID NO: 2是HHV7 MIE启动子的序列。
SEQ ID NO: 3是HHV6A M正启动子的序列。
SEQ ID NO: 4是HHV6B R3区的序列。
SEQ ID NO: 5是实施例1中所用的20u的序列。
SEQ ID NO: 6是实施例1中所用的9u的序列。
SEQIDNO: 7是实施例1中所用的MIE的序列。
SEQ ID NO: 8是实施例1中所用的U95的序列。
SEQIDNO: 9是实施例1中所用的CMV的序列。
SEQIDNO: 10是实施例1中所用的MIE/3K的序列。
SEQ ID NO: 11是实施例1中所用的U95/3K的序列。
SEQIDNO: 12是HHV7U95启动子
SEQ ID NO: 13是距离HHV6B MIE的转录起始点-574到-427的序列。
SEQ ID NO: 14是距离HHV6B MIE的转录起始点-1051到-427的序列。
SEQ ID NO: 15是距离HHV7 MIE的转录起始点+22到-493的序列。
SEQ ID NO: 16是距离朋V7 M正的转录起始点+16到-484的序列。
SEQIDNO: 17
SEQIDNO: 18
SEQIDNO: 19
SEQIDNO: 20
SE(^IDNO: 21
SEQIDNO: 22
SEQIDNO: 23
SEQIDNO: 24
SEQIDNO: 25
SEQIDNO: 26
SEQIDNO: 27
SEQIDNO: 28
SEQIDNO: 29
29
是实施例1中所用的9u-d2-7的序列=
是实施例1中所用的9u-dl-4的序列
是实施例1中所用的9u曙dl-5的序列
是实施例1中所用的9u-dl-7的序列o
是实施例1中所用的9u隱d3-7的序列<=
是实施例1中所用的9u-d5的序列。
是实施例1中所用的9u-d6的序列。
是实施例1中所用的9u-d7的序列。
是实施例1中所用的9u-d8的序列。
是实施例2中所用的7MIEP (-493 )的序列。
是实施例2中所用的7MIEP (-388 )的序列。
是实施例2中所用的7MIEP (-233 )的序列。
是实施例2中所用的7U95P (-484 )的序列。SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEG ID NO:
30是实施例2中所用的7U95P (-379)的序列 31是实施例2中所用的7U95P (-304 )的序列 32是实施例2中所用的pGL3 Basic的序列。 33是HIV-1 gp41的RNAi的一个例子。 34是HIV-1 tat的RNAi的一个例子。 35是HIV-1 tax的RNAi的一个例子。
实施本发明的最佳方式 以下，对本发明进行说明。在整个说明书中，除非另外明确地说明， 单数表达形式(例如英语中的"一个"，"一种"，"该，，以及其语言 中的冠词、形容词)应当理解为也包含其复数形式的概念范畴。除非另 外指出，本文所使用的术语应具有本领域通常所指的含义。因而，除非 另外定义，本文中所使用的全部专业术语和科技用语，应理解为具有本 发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义。当发生矛盾时， 首先依照本说明书(包括定义)。 (术语的定义)
下文描述本文所用术语的定义。
本文所用的术语"HHV"是指人疱渗病毒，有1型、2型、3型、4 型、5型、6型、7型和8型等类型。
除非另外指出，如本文所用，术语"疱渗病毒"包括所有的HHV-6A、 HHV-6B和HHV-7，包括它们的野生型和重组型。除非另外指出，本文 中所用的术语"HHV-6 (人疱渗病毒6)，，包括HHV-6A和HHV-6B, 以及它们的野生型和重组型。如细胞巨化病毒HHV-5， HHV6属于卩亚 属，HHV6B是诱发幼儿急诊的病毒，一^:认为，大部分日本人会在2 周岁时感染HHV6B。本文所用的术语"HHV-7 (人疱渗病毒7)，，是 指属于该型的任何疱渗病毒。HHV7也一皮认为是诱发幼儿急诊的病毒， 但是与HHV6B相比，其发生的概率较低，并且被感染的患者的年龄较 大。与HHV6—样，HHV7属于卩亚属，并且它#皮认为是感染CD4+细 胞，从而引起吉贝特玫瑰糠渗(pityriasis rosea Gibert)发生，而且一般 认为，大部分日本人会在2周岁时感染HHV7。
如本文所用，涉及疱渗病毒的术语"野生抹，，是指未经人工修饰， 从自然界中分离的疱渗病毒抹。野生林的例子包括但不限于Jl林。如本文所用，涉及HHV-6A的术语"野生株"是指未经人工修饰， 从自然界中分离的HHV-6A抹。野生林的例子包括但不限于U1102株。
如本文所用的术语"突变抹，，是指由于诱变、多次传代培养等而发 生突变的疱渗病毒株。疱渗病毒株的诱发突变既可以是随机突变，也可 以是位点特异性突变。
如本文所用，涉及HHV-6B的术语"野生抹"是指未经人工修饰， 从自然界中分离的HHV-6B抹。野生林的例子包括但不限于HST株。
本文所用的术语"蛋白质"、"多肽"、"寡肽"和"肽"具有相 同的含义，均指具有任意长度的氨基酸聚合物。
本文所用的术语"多核苷酸"、"寡核苷酸"和"核酸"具有相同 的含义，指具有任意长度的核苷酸聚合物。除非另外指出，特定的核酸 序列还隐含明确说明的序列，以及其经保守》f饰的突变体(例如简并密 码子取代)及其互补序列。特别地，简并密码子取代可以通过制备一个 或多个(或全部)所选择密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧次黄噤呤 核苷残基取代的序列而完成(Batzer等人,Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991 ) ; Ohtsuka等人，J. Biol. Chem. 260: 2605 -2608 ( 1985 ); Rossolini等人，Mol. Cell. Probes 8: 91 -98 ( 1994))。
本文所用的术语"基因"是指确定一种遗传性状的元件。基因通常 在染色体上以一定的顺序排列。把确定蛋白质一级结构的基因称为结构 基因。调节结构基因表达的基因称为调控基因。本文所用的"基因"是 指"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核酸"、和/或"蛋白质""多肽" "寡肽"和"肽"。如本文所用的，基因的"开放阅读框"或"ORF" 是指将基因的碱基序列以每3个碱基为一组进行分割时所得的三种读框 中的一个，其具有起始密码子以及由终止密码子出现而确定的一定长 度，并且可能实际上编码一种蛋白质。疱渗病毒基因组的全序列已经得 到鉴定，其中至少鉴定了 101个基因，已知各基因分别具有开放阅读框 (ORF)。
本文所用的术语"RNAi"是RNA干扰的缩写，是指将引起RNAi 的试剂例如双链RNA (也称作为dsRNA)导入细胞中，特异性地降解 与之同源的mRNA,从而抑制基因产物的合成的现象以及利用这种现象 的技术。如本文所用的，RNAi具有与引起RNAi的试剂相同的含义。
本文所用的术语"引起RNAi的试剂"是指能够引起RNAi的任何试剂。如本文所用，"试剂引起基因RNAi"是指用试剂引起与基因有 关的RNAi,并且成功地达到RNAi的效果(例如抑制基因的表达等)。 这种引起RNAi的试剂的例子包括但不限于与目标基因的核酸序列具有 至少约7 0 %同源性的序列或者在严谨条件下与之杂交的序列以及含有 至少长10个核苦酸的双链部分的RNA或它们的变体。在此，该试剂优 选为含有3，突出端的DNA,更加优选地该3，突出端长度为2个或更多 个核苦酸(例如，长度为2-4个核苦酸)。
虽然不期望受任何理论的约束，引起RNAi的机理被认为如下。当 将引起RNAi的分子，例如dsRNA导入细胞，在RNA相对较长的情况 下(例如40个或更多个碱基对)，在存在ATP时，具有解旋酶结构域 的RNA酶III样的核酸酶(所谓的切酶)从3'端以约20个碱基对的间 隔切割该分子。本文所用的术语"siRNA"是短的干扰RNA的缩写，是 指具有10个或更多个碱基对的短双链RNA,通过人工化学合成或生物 合成，由生物体合成或者在生物体内降解40个或更多个碱基对的双链 RNA来制备。SiRNA通常具有包含5，-磷酸盐和3，-OH的结构，其中3， 末端突出长度约2个碱基。 一种特定蛋白结合到siRNA上，形成RISC (RNA诱导的沉默复合物)。该复合物识别并结合具有与siRNA相同 序列的mRNA,并由于RNA酶III样酶促活性，在siRNA的中间切割 mRNA。优选的是，siRNA的序列与作为把点将被切割的mRNA的序列 之间是100%匹配的。然而，在远离siRNA中间的位点上发生的石咸基突 变不能完全排除RNAi的切割活性，保留部分活性，而siRNA中间发生 的碱基突变影响4艮大，并且RNAi切割mRNA的活性相当低。利用这种 特征，仅具有突变的mRNA被特异性地降解。特别地，合成中间有突变 的siRNA,并导入到细胞中。因此，在本发明中，将siRNA本身以及能 够制备siRNA的试剂(例如，代表性的约40个或更多个碱基对的dsRNA ) 被用作能够引起RNAi的试剂。
此外，虽然不期望受任何理论的约束，除了上述方式，siRNA的反 义链结合mRNA,而siRNA作为RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP )的 引物，从而合成dsRNA。该dsRNA再次作为切酶的底物，生成新的 siRNA。可以预期这种反应4皮增强。因此，在本发明中，siRNA本身以 及能够制备siRNA的试剂是有用的。事实上，在昆虫等中，如35dsRNA 分子基本上或完全地降解1,000个或更多个拷贝的细胞内mRNA,因此，应当理解，siRNA本身以及能够制备siRNA的试剂是有用的。
在本发明中，可以使用长度约20个碱基的(例如，代表性的约21 -23个碱基)或者约少于20个碱基的双链RNA,称作为siRNA。在细 胞中siRNA的表达能够抑制siRNA所把向的病源性基因的表达。因此， siRNA可用于疾病的治疗、预防、预后等
本发明的siRNA可以是任何形式的，只要其能够引起RNAi。 在另一个实施方案中，能够引起RNAi的试剂具有一个短的发夹结 构，在3'末端有个粘性部分(shRNA;短发夹RNA)。本文所用的术语 "shRNA"是一个约20个或更多个碱基对的分子，其中单链RNA特别 地含有一个回文碱基序列，在那里形成双链结构(即，发夹结构)。可 以人工合成shRNA。可替代地，以相反方向连接DNA序列的有义链和 反义链，并在体外用该DNA作为模板，用T7RNA聚合酶合成RNA， 制备shRNA。虽然不期望受任何理论的约束，应当理解，在将shRNA 导入细胞后，shRNA在细胞中被降解成约20个碱基的长度(例如，代 表性为21个、22个、23个i咸基)，用siRNA引起RNAi,产生本发明 的处理效果。应当理解，这种效果在广泛的生物体中实现，例如，昆虫、 植物、动物(包括哺乳动物)等。因此，当与siRNA在一起时，shRNA 引出RNAi,并因此可一皮用作本发明的有效成分。ShRNA优选具有一个 3'突出端。双链部分的长度不是特别地受到限制，但是优选为约10个或 更多个核普酸，更优选约20个或更多个核苦酸。在此，3'突出端优选为 DNA， DNA的长度更优选为至少2个核苦酸，甚至更加优选地，DNA 的长度为2-4个核苷酸。
本发明所用的引起RNAi的试剂是人工合成的(化学合成或生物化 学合成)或天然存在的。对于本发明的效果来说，这两者之间基本上没 有区别。化学合成的试剂优选是用液相层析等纯化的。
可以在体外制备在本发明中所用的能够引起RNAi的试剂。在该合 成系统中，用T7 RNA聚合酶和T7启动子，从模板DNA上合成反义 RNA和有义RNA。这些RNA被退火，然后被导入细胞中。在这种情况 下，通过上述机理引起RNAi,从而达到本发明的技术效果。在此，例 如采用碌酸钓方法，将RNA导入细胞中。
按照本发明的引起RNAi的试剂的另 一个例子是与mRNA杂交的单 链核酸或其所有核酸类似物。这种试剂可用于本发明的方法和组合物中。
本文中所用的术语"相应的"氨基酸或核酸是指在给定的多肽或多 核苷酸分子中的氨基酸或核苷酸，其具有或被期望具有与作为用于比较 的参照多肽或多核苷酸中预先确定的氨基酸或核苦酸相似的功能。例 如，在遍在蛋白的情况下，是指以相似方式对催化活性起作用并且在序
列中的类似位置上存在的氨基酸(例如，c-末端上的甘氨酸)，其对赖 氨酸起作用。例如，在为核酸序列的情形下，该术语是指对其所编码的 特定部分起类似作用的相似部分。
本文所用的术语"相应的"基因(例如，多肽或多核苦酸分子)是 指特定物种中的基因，其具有或被期望具有与作为用于比较的对照的物 种中的预先确定的基因相似的功能。有大量具有这种功能的基因，该术 语是指具有相同进化起源的基因。因此，相应于特定基因的基因是给定
基因的直向同源物。因此，在其他生物体中(如7型疱渗病毒)，能够 找到相应于那些如6B型疱渗病毒和肺瘤的抗原等的基因。这种相应的 基因可通过本领域熟知的技术来鉴定。因此，例如使用对照基因的序列 (例如小鼠细胞周期蛋白基因等)作为比较(query)序列，通过检索生 物体(如6B型疱渗病毒)的序列数据库，可以找到特定生物体中的相 应基因。可替代地，通过试验筛选文库来找出相同的基因。
本文所用的术语"被分离的，，是指在正常环境下的天然伴随的物质 至少被降低，或者优选基本上或完全被除去。因此，术语"分离的细胞" 是指基本上不含有天然环境下的其他伴随物质(例如，其他细胞、蛋白 质、核酸等)的细胞。术语"被分离的"涉及核酸或多肽时是指，如通 过DNA重组技术制备时，核酸或多肽基本上不含有细胞物质或培养液；
本文所用的术语"被纯化的"生物制剂(例如，核酸、蛋白质等) 是指其中至少一部分天然伴随的物质#:除去的制剂。因此，-陂纯化的生 物制剂的纯度通常高于该生物物质在正常状态下的纯度(即被浓缩)。
如本文所用，术语"被纯化的"和"被分离的"是指相同类型的生 物制剂优选以至少70%重量存在，更优选以至少85%重量存在，甚至 更优选以至少95%重量存在，最优选以至少98%重量存在。
如本文所用的，涉及序列(例如，核酸序列、氨基酸序列等)的术 语"同源性"是指两个或两个以上的基因序列之间的同一性程度。因此，两个序列的同源性越高，则其序列的同一性或相似性越高。两种基因是
严格条二^的;交方法进行判定。将两个基因序列直接进行:匕较时,如
果所述基因的DNA序列典型地具有至少50%的同一性，优选具有至少 70%的同一性，更优选具有至少80%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或 99%同一性时，认为这些基因具有同源性。
如在此所用的，"多核苷酸在严谨条件下杂交"是指本领域通常使 用和熟知的条件。使用选自本发明的多核苷酸，通过菌落杂交、噬菌斑 杂交、DNA印记杂交来获得这种多核苷酸。特别地，在65。C下，在存 在0.7- l.OMNaCl时，用固定了来源于菌落或噬菌斑的DNA的滤器实 施杂交。接着，在65。C下，用0.1 - 2倍浓度的SSC (柠檬酸钠)溶液 (1倍浓度SSC溶液由150 mM氯4^钠和15 mM 一宁檬酸钠组成)洗涤滤 器。通过这种方法鉴定的多核苷酸被称作为"在严谨条件下杂交的多核 脊卧殳"。可以4姿照々口 Molecular Cloning 2nd ed.， Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press ( 1995 ) 等中描述的方法来实施杂交。在此，在严谨条件下杂交的序列优选排除 仅含A或T的序列。"能够杂交的多核苷酸"是指在上述杂交条件下能 够与其他多核苷酸杂交的多核普酸。特别地，能够杂交的多核苷酸至少 包括与编码具有本文特别公开的氨基酸序列的多肽的DNA的碱基序列 具有至少60%同源性的多核苷酸，优选是具有至少80%同源性的多核 苦酸，以及更优选是具有至少95%同源性的多核普酸。
氨基酸序列和碱基序列的相似性、同 一性和同源性在此用默认参数 下的FASTA比较。可替代地，例如，使用NCBI的BLAST 2.2.9 ( 2004 年5月12日公开)进行同一性检索。如在此所用，同一性大小通常是 指采用上述BLAST在默认参数下进行比对而获得的数值。如果改变参 数能够获得更大的数值，那么本文中将最大值作为同一性的数值。当要 对多个区域进行同 一性的评价时，那么本文中将最大值作为同 一性的数 值。
本文所用的术语"搜索"是指利用特定的核酸序列或者使用其他方 法，找出其他具有特定的电子的或生物学的功能和/或特性的核酸碱基序 列。电子搜索的例子包括但是不限于BLAST( Altschul等人，J. Mol. Biol.215: 403-410 ( 1990 ) ) 、 FASTA ( Pearson & Lipman， Proc. Natl. Acad. Sd., USA 85: 2444-2448 ( 1988) )、 Smith和Waterman的方法(Smith 和Waterman, J. Mol. Biol. 147: 195-197 ( 1981 ))以及Needleman和 Wunsch的方法(Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453( 1970 ))
等。生物学搜索的例子包括但是不限于在进行严谨杂交条件下，PCR和 原位杂交等时，基因组DNA附着到尼龙膜等上的大型阵列，或者基因 组DNA附着到玻璃平板上的微阵列。如在此所用，本发明所用的启动 子包含通过这种电子搜索或生物学搜索的那些序列的启动子是期望的。
本文所用的术语基因产物例如基因、多核苷酸、多肽等的"表达"， 是指基因等受预先确定的行为的影响，在体内变成另一种形式。优选地， 术语"表达"是指基因、多核苷酸等发生转录并翻译成多肽。在本发明 的一个实施方案中，基因被转录成mRNA。更优选地，这些多肽发生翻 译后的加工l奮饰。
如在此所用的，氨基酸可以通过一般已知的三字符形式表示，也可 以以IUPAC-IUB生物化学命名委员会所推荐的单字符形式表示。核苷 酸也用通常所接受的公知的单字符缩写形式表示。
字符代码如下
氨基酸
三字符单字符参考
AlaA丙氨酸
CysC半胱氨酸
AspD天冬氨酸
GluE谷氨酸
PheF苯丙氨酸
GlyG甘氨酸
HisH组氨酸
lieI异亮氨酸
LysK赖氨酸
Leu亮氨酸
MetM曱硫氨酸
AsnN天冬酰胺
ProP脯氨酸Gin Q 谷氨酰胺
Arg R 精氨酸
Ser S 丝氨酸
Thr T 苏氨酸
Val V 缬氨酸
Trp W 色氨酸
Tyr Y 酪氨酸
Asx 天冬氨酸或天冬酰胺
Glx 谷氨酸或谷氨酰胺
Xaa 未知的或其他的氨基酸
碱基(核苷酸)
缩写 参考
a 腺噤呤
g 鸟嘌呤
c 胞嘧啶
t 胸腺嘧咬
u 尿嘧咬
r 鸟噤呤或腺噤呤
y 胸^^嘧口定/尿嘧"定或力包嘧p定
m 腺噤呤或胞嘧啶氨基基团
k 鸟噤呤或胸腺嘧啶尿嘧啶酮基团
s 鸟噪呤或力包嘧咬
w 腺。票呤或胸腺嘧啶/尿嘧咬
b 鸟噪呤或胞嘧，定或胸腺嘧咬/尿嘧p定
d !^噤呤或鸟。票呤或胸腺嘧咬/尿嘧p定
h 腺噤呤或胞嘧啶或胸腺嘧咬/尿嘧p定
v 腺噤呤或鸟噤呤或力包嘧咬
n 力泉噪呤或鸟噪p令或J包嘧t定或胸腺嘧"定/尿嘧，定，未知的 或其他的碱基
如本文所用，术语多肽或多核苷酸的"片段"是指相对于全长的多 核苷酸或多肽(其长度为n),序列长度为1到n - 1的多肽或多核苷酸。根据目的不同，片段的长度可以适当地变化，例如在为多肽的情形下，
片段长度的下限包括3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、 15个、20个、25个、30个、40个、50个或更多个氨基酸。用这里没 有列举的整数表示的长度(例如，11个等)作为下限也是适宜的。当指 多核苷酸时，片段长度的下限包括5个、6个、7个、8个、9个、10个、 15个、20个、25个、30个、40个、50个、75个、100个、200个、300 个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个或更多 个核苷酸。用这里没有具体列举的整数表示的长度(例如，ll个等)作 为下限也是适宜的。
本发明中所用的多肽在其氨基酸序列中具有至少一个(例如1个或 多个或者更多个)氨基酸取代、添加和/或缺失，只要其具有与野生型多 肽基本上相同的功能。
特定氨基酸被具有同样疏水性指数的其它氨基酸替代，生成的蛋白 质具有与起始蛋白质类似生物学功能(例如具有等价的酶活性的蛋白
质)，这在本领域是众所周知的。在这种氨基酸替代中，优选疏水性指 数在士2以内，进一步优选在士l以内，更优选在±0.5以内。在本领域中 一般理解，在对蛋白质进行修饰时会考虑亲水性问题。如US4,554,101 中公开的，氨基酸残基被赋予如下的亲水性指数精氨酸(+3.0);赖 氨酸(+3.0 );天冬氨酸(+3.0±1 );谷氨酸(+3.0±1 );丝氨酸(+0.3 ); 天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4); 脯氨酸(-0.5±1 );丙氨酸(-0.5 );组氨酸(-0.5 );半胱氨酸(-1.0 ); 曱硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8); 酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);和色氨酸(-3.4)。可以理解的是 某种氨基酸可以被具有相同亲水性指数的其它氨基酸替代而提供生物 学等价体。在这种氨基酸替代中，亲水性指数优选在土2以内，更优选在 ±1以内，进一步优选在士0.5以内。亲水性指数也可以用于本发明的氨基 酸序列的修饰中。如US4,554,101中公开，氨基酸残基被赋予如下的亲 水性指数精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1 ); 谷氨酸(+3.0±1 );丝氨酸(+0.3 );天冬酰胺(+0.2 );谷氨酰胺(+0.2 ); 甘氨酸(0 );苏氨酸(-0.4 );脯氨酸(-0.5±1 );丙氨酸(-0.5 );组 氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5); 亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);和色氨酸(-3.4)。可以理解的是某种氨基酸可以被具有相同亲水性指 数的其它氨基酸替代而提供生物学等价体。在这种氨基酸替代中，亲水
性指数优选在土2以内，更优选在土l以内，进一步优选在士0.5以内。
术语"保守性替代，，用于此是指一种氨基酸替代，其中被替代的氨 基酸和替代后的氨基酸具有类似的亲水性指数和/或疏水性指数。例如， 保守性替代是亲水性指数或疏水性指数在士2之内的氨基酸之间进行的 替代，优选在土l以内，更优选在土0.5以内。保守性替代的例子包括但是 不限于在各个如下残基对之间进行的替代精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和 天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸，亮氨酸和 异亮氨酸，这都是本领域技术人员熟知的。
如本文所用，术语"变体"是指部分地区别于起始物质的一种物质， 例如多肽或多核普酸等。这种变体的例子包括替代变体、添加变体、缺 失变体、截短变体、等位基因变体等。这种变体的例子包括但是不限于， 具有一个或几个替代、添加和/或缺失的核苦或多肽，或者具有至少一个 替代、添加和/或缺失的核苷或多肽。术语"等位基因(allele)"用于 此是指与相应的基因位于同一基因座上但相互之间存在差异的基因变 体。因此，术语"等位基因变异体，，用于此是指与特定基因具有等位基 因关系的变体。这种等位基因变体通常具有与相应的等位基因相同或高 度相似的序列，并且通常具有几乎相同的生物学活性，极少具有不同的 生物学活性。术语"物种同源物"或"物种同系物"用于此是指具有与 特定物种中的某种基因在氨基酸水平或核苷酸水平上同源的物质(优选 至少60%同源，更优选至少80%,至少85%,至少90%,至少95%的同 源性)。从本说明书的描述中，可以清楚地知晓获得这种物种同源物的 方法。术语"直向同源物"(也称作直向同源基因)是指存在于来自共 同祖先(经过物种分化)的不同物种中的基因。例如，以具有多种基因 结构的血红蛋白基因家族为例，人和小鼠的a -血红蛋白基因是直向同 源物，而人a-血红蛋白基因和人(3-血红蛋白基因是种内同源物(由于 基因复制所产生的基因)。直向同源物对于分子系统树的推定是有用的。 通常，不同物种中的直向同源物与起始物种具有类似的功能。因此，本 发明的直向同源物在本发明中也是有用的。
如本文所用，术语"功能性变体"是指保留了生物学活性的变体(特 别是启动子活性)，标准物的序列产生该活性。如在此所用，术语"保守的(或保守修饰的)变体"适用于氨基酸 序列和核酸序列。对于特定的核酸序列，经保守修饰所得的变体是可以 编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸。由于遗传密码子的简 并性，许多功能相同的核酸编码任何特定的蛋白质。例如，密码子GCA，
GCC， GCG和GCU都编码丙氨酸。因而在所有通过所述密码子表示丙 氨酸的位置，该密码子可替换成任何所述的相应密码子，而不改变所编 码的多肽。这种核酸变化是保守性变异的一种，即"沉默改变，，。对于 一种核酸来说，可以通过如测定启动子活性来确定一种保守性替代。
为了制备功能相同的多肽，除了氨基酸替代外，可以进行氨基酸添 加、缺失或修饰。氨基酸替代是指用不同的氨基酸替换起始肽的至少一 个氨基酸，例如，不同的氨基酸替换1 - 10个氨基酸，优选1-5个氨 基酸，更优选1-3个氨基酸。氨基酸添加是指将至少一个氨基酸添加 到起始肽链上，例如将1 - 10个氨基酸，优选1-5个氨基酸以及更优 选1-3个氨基酸添加到起始肽链上。氨酸缺失是指缺失至少一个氨基 酸，例如缺失1 _ 10个氨基酸，优选1 - 5个氨基酸，更优选1 - 3个氨 基酸。氨基酸修饰包括但是不限于，酰胺化、羧化、硫酸化(sulfation)、 卣化、平截、脂质化、烷基化、糖基化、磷酸化、羟基化、酰基化(例 如乙酰化)等。被取代或所添加的氨基酸是天然存在或非天然存在的氨 基酸，或者氨基酸类似物。优选是天然存在的氨基酸。
表达多肽的核酸例子用于此是指能够表达本发明多肽的蛋白质实 例的核酸。这种核酸包括如上所述的部分序列缺失或被其他碱基替代的 核酸，或者插入其他核酸序列的核酸，只要该核酸所表达的多肽基本上 具有与天然存在的多肽相同的活性。可替代地，将其他核酸连接到核酸 的5，端和/或3，端上。核酸分子包括在严谨条件下能够与编码多肽的基 因杂交的核酸，并且编码的多肽与所述基因编码的多肽基本上具有相同 的功能。这种基因是本领域知晓的并且可被用于本发明中。
通过熟知的PCR方法，即化学合成方法，能够获得上述核酸。该方 法可以与如位点特异性诱变、杂交等组合起来。
如本文所用，术语对多肽或多核苷酸进行的"替代、添加或缺失" 是指相对于起始的多肽或多核苷酸，发生氨基酸或其替代物或者核苷或 其替代物的替代、添加或删除。这可以通过本领域熟知的方法实现，包 括位点特异性诱变方法等。多肽或多核苷酸具有任意数量(>0 )的替代、添加或缺失。该数量最大可以达到具有该数量替代、添加或缺失的变体 能够保持特定功能(例如，激素和细胞因子的信息传导功能等)。例如， 该数量可以是1个或数个，优选在全长序列的20%或10%以内，或者不
超过100个，不超过50个，不超过25个等。 (启动子)
如本文所用，术语"启动子(或启动子序列)"是指决定基因转录 起始点的碱基序列，是直接调控转录频率的DNA区域。RNA聚合酶结 合到启动子上，启动转录。因此，如在此所用，具有基因的启动子功能 的部分是"启动子部分"。可以用DNA分析软件预测基因组碱基序列 中的蛋白质编码区来推导出启动子区。推导得出的启动子区是变化的， 通常位于结构基因的上游，但是不仅限于在结构基因的上游，也可能位 于结构基因的下游。
如本文所用，术语"MIE启动子"是主要立即早期启动子，它是一 种基因的启动子，该基因的转录是在病毒感染后被来自宿主或病毒粒子 的转录因子立即启动的。用放线菌酮处理的^皮感染细胞，提取RNA,使 用该RNA通过RT-PCR鉴定MIE基因。
本文所用的术语"U95启动子"是指立即早期基因U95的启动子。 U95也是一种立即早期基因，其转录也是在病毒感染后纟皮来自宿主或病 毒粒子的转录因子立即启动的。
如本文所用的，鉴定启动子的方法如下对位于结构基因附近的一 些序列进行筛选(例如使用实施例中描述的表达盒)，并对具有启动基 因表达活性的序列进行作图。如此，可以筌定具有显著启动子活性的序 列。通常，这些序列位于结构基因的上游，但是不限于此。
如本文所用，术语"HHV6BMIE启动子"或"HHV6B的MIE启动 子"是指SEQIDNO: 1中的任何具有启动子活性的序列。优选地，启 动子在距离SEQIDNO: 1中的转录起始点-814到0的位置。这种序列 包括4旦是不限于SEQ ID NO: 1或与之相应的序列。在HHV6B基因的 表达控制中，启动子优选位于上游的-574到-427区域，优选在-1051到 -427区域，其碱基序列包括SEQ ID NO: 15、 16等中所示的序列。其 中，本文已经阐明，NF-kB和AP-1基序(距离转录起始点-603至-594 对应于NF-k B基序，而-488到-478和-249到-239对应于AP-1基序)是来自碱基序列替代试验的基序。因此，优选地，本发明的HHV6BMIE启 动子包括(a)具有SEQIDNO: l所示的石咸基序列的，或者与之对应 的碱基序列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQ ID NO: 1所示的石咸 基序列的，或者与之对应的碱基序列的等位基因变体或其序列片段的多 核苷酸；(c)与(a)或(b)中的任何一种的多核苦酸杂交并且具有 其一种生物活性的多核普酸；或者(d)由(a) - (c)中的任何一种 的碱基序列或者具有至少70%同一性的互补序列组成并且具有其一种 生物活性的多核苷酸。
如本文所用，术语"HHV7 MIE启动子"或"HHV7的MIE启动子" 是指SEQ ID NO: 2中的任何具有启动子活性的序列。优选地，启动子 在距离SEQ ID NO: 2中的转录起始点-493到+22的位置。这种序列包 括但是不限于SEQIDNO: 2或与之相应的序列。在HHV7基因的表达 控制中，启动子优选位于上游的-427区域，优选在-493区域，其碱基序 列包括SEQ ID NO: 2等中所示的序列。其中，本文已经阐明，NF-k B (距 离转录起始点-464到-478和-359到-350对应于NF-k B基序)是来自碱 基序列替代试验的基序。因此，优选地，本发明的HHV7 MIE启动子 包括(a)具有SEQIDNO: 2中所示的碱基序列或者与之对应的碱基 序列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQ ID NO: 2中所示的碱基序 列或者与之对应的碱基序列的等位基因变体或其序列片段的多核苦酸； (c)与(a)或(b)中的任何一种的多核苷酸杂交并且具有其一种生 物活性的多核苦酸；或者(d)由(a) - (c)中的任何一种的碱基序 列或者具有至少70%同一性的互补序列组成并且具有其一种生物活性 的多核苷酸。
如本文所用，术语"HHV7U95启动子"或"HHV7的U95启动子" 是指SEQ ID NO: 12中的任何具有启动子活性的序列。优选地，启动子 在距离SEQ ID NO: 12中的转录起始点-484到+ 16的位置。在HHV7 基因的表达控制中，启动子优选位于上游的-379区域，优选在-484区域， 其碱基序列包括SEQIDNO: 2等中所示的序列。其中，本文已经阐明， NF-kB (距离转录起始点-478到-469和-373到-364对应于NF-kb基序) 是来自碱基序列替代试^验的基序。因此，优选地，本发明的HHV7U95 启动子包"fe: (a)具有SEQIDNO: 12所示的石咸基序列或者与之对应 的碱基序列或其序列片段的多核苦酸；(b) SEQIDNO: 12所示的碱基序列或者与之对应的碱基序列的等位基因变体或其序列片段的多核
苷酸；(c)与(a)或(b)中的任何一种的多核苦酸杂交并且具有其 一种生物活性的多核苦酸；或者(d)由(a) - (c)中的任何一种的 碱基序列或者具有至少70 %同 一性的互补序列组成并且具有其一种生 物活性的多核苦酸。
如本文所用，本发明的启动子"组成型"表达基因是指在生物生长 的任意阶段，在生物的所有组织中，均以大致一定而不改变的量表达的 性质。特别地，在与本说明书实施例同样的条件下，利用RNA印迹分 冲斤时，例如在任意时间点(例如两个或两个以上的时间点，例如第5天 和第15天)在同一或相应部位均可以7见察到几乎相同的表达量时，则 在本发明意义上，表达是组成型表达。 一般认为组成型表达的启动子对 正常生长环境下维持生物体的恒定性起作用。这些特性可以通过下述方 式确定，由生物的4壬意部位提取RNA,利用RNA印迹分坤斤表达量。
"增强子"可以用于提高目的基因的表达效率。作为增强子，优选 包含CaMV35S启动子内上游序列的增强子区域。增强子，可以使用多 个，也可以使用l个，还可以不使用。在启动子中增强启动子活性的区 域也可以称作为增强子。
如本文所用，"^:可操作地连接"或"可操作地连接"指将目的序 列的表达(起作用)置于某些转录翻译调节序列(例如启动子，增强子 等)或翻译调节序列的控制之下。为了将启动子可操作地连接到基因上， 启动子通常位于该基因的上游，但启动子无需紧邻该基因。
(核酸构建体)
本文所用的术语"核酸构建体"或"基因表达盒"可以互换使用， 是指包含编码基因的核酸(例如，DNA, RNA)的核酸序列，包含可操 作地连接了启动子基因(启动子控制该核酸的表达)、启动子和可选择 地可操作地连接了异源基因(即在读框内)的核酸序列。可以预期，本 发明包括这些表达盒或构建体选择性地与其他调控元件组合的用途。优 选地，表达盒或核酸构建体适合于纟皮特定的限制性酶消化并且可以纟皮回 收。
当本文提及基因时，术语"重组的载体"是指将感兴趣的多核苷酸 序列导入目的细胞的载体。这种载体能够在宿主(例如，原核生物细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物个体和植物个体等)中自 我复制，或者可以被整合到染色体中，并且在适合本发明的多核酸转录
的位置包含启动子。在本申请中，可以使用BAC载体。BAC载体是一 种以大肠杆菌的F质粒为基础而制备的质粒，其能够在细菌如大肠杆菌 等中增殖和稳定地维持约300kb或更长的DNA片段。BAC载体至少包 含BAC载体复制所需的区域。这种复制所需的区域包括，如F质粒的 复制起点oriS或其变体。
如本文所用，"选择性标记"是指起筛选含有核酸构建体或载体的 宿主细胞的作用的基因。选择性标记包括，但不限于荧光标记、发光 标记和药物选择标记。"荧光标记"包括但是不限于编码荧光蛋白的基 因，如绿色荧光蛋白(GFP)、蓝绿荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白 (YFP)和红色荧光蛋白(dsRFP)。"发光基因"包括但不限于，编 码如荧光素的荧光蛋白的基因。"药物选择性标记"包括但不限于次 黄噤呤鸟噤呤磷酸核糖基转移酶(hprt) 、 二氢叶酸还原酶基因、谷氨 酰胺合酶基因、天冬氨酸转氨酶、金属硫蛋白(MT )、腺苷脱氨酶(ADA )、 腺苷脱氨酶(AMPD1, 2 )、黄噤呤鸟。票呤-畴酸核糖基转移酶、UMP 合酶、P-糖蛋白、天冬酰胺合酶以及鸟氨酸脱羧酶。 一种药物与药物 筛选标记包括编码蛋白质的组合例如二氬叶酸还原酶基因(DHFR) 和氨甲蝶呤(MTX)的组合；谷氨酰胺合酶(GS)基因与曱硫氨酸磺 基坊(Msx)的组合；天冬氨酸转氨酶(AST)基因与N-磷酸乙酰-L -天冬氨酸(PALA)的组合；MT基因和镉(Cd2+)的组合；腺苷脱氨 酶(ADA)基因和腺苷、亚硝基羟基丙氨酸、或2'-脱氧柯福霉素的组 合；腺普脱氨酶(AMPDl, 2)基因和腺噤呤、重氮乙酰丝氨酸、或助 间型霉素的组合；黄噤呤鸟噤呤磷酸核糖转移酶基因和霉纷酸的组合； UMP合酶基因和6 -氮尿苷或吡唑呋喃菌素的组合；P -糖蛋白(P - gp, MDR)基因和多种药物的组合；天冬酰胺合酶(AS)基因和(3-天冬氨 酰异羟肟酸或合欢氨酸的组合；以及鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因和-a -二氟甲基-鸟氨酸(DFMO)的组合。
如本文所用，术语"表达载体"是指包含结构基因和用于调控结构 基因表达的启动子的核酸序列，在某些情况下还包含各种调节元件，使 得它们可以在宿主细胞中进行操作。调节元件优选包含终止子、耐药性 基因(例如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因等)之类的选择性标记以及增强子等。生物体(例如动物)的表达载体的类型和所使用的调节 元件的种类根据所用的宿主细胞而变化，这是本领域技术人员已知的。
如本文所用的，术语"重组载体"是指可以将感兴趣的多核苷酸序 列导入目的细胞的载体。这种载体在宿主(原核生物细胞、酵母、动物 细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物个体和植物个体等)细胞中能够自我 复制或者整合到染色体中，并且在适合本发明的多核酸转录的位置包含 启动子。
如本文所用的，术语"终止子"是指位于基因中编码蛋白质的区域
的下游的序列，其与DNA转录为mRNA时的转录终止以及polyA序列 的添加相关。已知终止子增加mRNA的稳定性，并影响基因的表达量。 终止子包括但不限于包括AATAAA的序列。
如本文所用的，术语"外源基因"是指在天然情形下不存在于特定 生物体中的基因。这种外源基因可以是通过修饰天然存在于特定生物体 中的基因而获得的基因，或者天然存在于特定生物体之外的另 一种生物 体中的基因(例如AD基因)，或者人工合成的基因，或者它们的复合 物，如融合物。包含这种外源基因的生物体能够表达实际上不被表达的 基因产物。例如，将被删除的隐性基因(例如，AD基因、PNP基因、y c链基因、TAP基因、MHC II基因、X-连接的WASP、 CD40配体、PI3K 样基因、DNA解旋酶)可被用作一种外源基因。
如本文所用的，外源基因是一种细胞因子的基因。如本文所用的， 术语"细胞因子"以本领域中最宽广的意思定义，是由一种细胞生成的 具有生理活性的物质，作用于相同或不同的细胞。细胞因子通常是一种 蛋白质或多肽，对免疫反应、内分泌系统的调控、神经系统的调控、抗 胂瘤活性、抗病毒活性、细胞增殖的调控、细胞分化的调控等具有控制 作用。如本文所用的，细胞因子以蛋白质或核酸的形式存在，在真正起 作用时，细胞因子通常呈蛋白质形式。如本文所用，术语"生长因子" 是指能够启动或控制细胞生长的物质。在细胞培养或组织培养时，将生 长因子添加到培养基中，替代血清大分子物质的作用。已经发现，许多 生长因子作为细胞分化状态而不是细胞生长的调控因子。细胞因子通常 包括白介素、趋化因子、如集落刺激因子的造血因子、肿瘤坏死因子、 干扰素。生长因子通常包括源自血小板的生长因子(PDGF)、表皮生 长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等，它们具有生长活性。
在本发明中，用那些与上述具有天然形式的外源基因具有同 一 性的 基因作为将被表达的外源基因。具有这种同源性的外源基因包括但是不 限于例如，当用Blast的默认参数与用于比较的参照外源基因进行比 较时，核苷酸具有同 一性或相似性至少约30%、至少约35%、至少约40%、 至少约30%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、 至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、 至少约90%、至少约95%、至少约99%的序列，或者多肽具有同一性 或相似性至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约30%、至少约 45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、 至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至 少约99%的氨基酸序列。
如本文所用的，术语如基因、多核苷酸、多肽等的基因产物的"表 达"是指基因等在体内受到预先确定的活动的作用而改变为另一种形 式。优选地，术语"表达"是指基因、多核香酸等被转录和翻译成多肽。 在本发明的一个实施方案中，基因被转录为mRNA。更优选地，这些多 肽发生翻译后的加工修饰。
因此，如本文所用的，基因、多核苷酸、多肽等的"表达下降，，是 指当本发明的 一种制剂受到 一定作用时，使得与该物质未受到 一定作用 时相比，表达量显著下降。优选地，表达量降低包括多肽表达水平下降。 如本文所用的，基因、多核苷酸、多肽等的"表达增加，，是指当本发明 的一种制剂受到一定作用(或者与基因表达相关的物质进入细胞，例如， 将被表达的基因或者用于调控基因表达的物质)时，使得与该物质未受 到一定作用时相比，表达量显著增加。优选地，表达量增加包括多肽表 达水平升高。如本文所用的，术语"诱导"基因的"表达"是指用一种
物质作用于细胞使得基因的表达水平升高。因此，诱导表达包括当观察 到基因的表达水平从未表达的观察水平升高到明显的表达水平时。
如本文所用的，术语基因的"特异性表达"是指不同于其他部位或 时期的特定部位或时期中以不同的水平(优选为较高水平)表达。特异 性表达是指在某些部位(特定部位)表达或者也指在另 一个部位上表达。 优选地，特异性表达是指仅在某些部位表达。
导入重组载体的方法也可以用上述将DNA导入细月包的方法来实现，包括如转染、转导、转化等，例如磷酸^法、脂质体法、DEAE葡
聚糖法、电穿孔法、粒子枪法(基因枪)等，脂质转染法、原生质球法、醋酸锂法[J. Bacteriol,， 153, 163 ( 1983 )]、以及[Proc, Natl. Acad. Sd, USA, 75， 1929 ( 1978 )
中描述的方法等。
本文所用的用于除去基因组或基因座的Cre酶的过渡表达、染色体 的DNA作图等是本领域技术人员熟知的，在Saibo Kogaku Bessatsu Jikken Purotokooru siriizu ( Cell Engineering ， Special Edition , Experimental Protocol Series ) , Ken'ichi Matsubara， Hiroshi Yoshikawa, Shujunsha编辑(Tokyo )的一部分,"FISH jikken purotokooru hito/genomu kaiseki kara senshokutai/idenshi shindan made ( FISH Experimental Protocol : from human/genomic analysis to chromosomal./genetic diagnosis)，，等中有描述。
如本文所用的，基因表达(例如，mRNA表达、多肽表达)可以用 合适的方法"检测"或"量化"，包括mRNA测定和免疫学测定。分子 生物学测定方法的例子包括RNA印记方法、点印记方法、PCR方法等。 免疫学测定方法的例子包括ELISA法、RIA法、荧光抗体法、蛋白质印 记法、免疫组织染色法等，其中使用微量滴定平板。量化方法的例子包 括ELISA法、RIA法等。采用使用阵列(例如，DNA阵列、蛋白质阵 歹'J )的基因分并斤方法。在Saibo-Kogaku [Cell Engineering], special issue, "DNA Microarray and Up-to-date PCR Method" , Shujun-sha编4辱，，于 DNA阵列进行了广泛的综述。Natgenet. 2002 Dec; 32 Suppl: 526-32对 蛋白质阵列进行了详细描述。基因表达分析方法的例子包括，但是不限 于除了上述方法外的RT-PCR法、RACE法、SSCP法、免疫沉淀法、双 杂交系统、体外翻译法等。其他分析方法^:描述在例如，"Genome Analysis Experimental Method" , Yusuke Nakamura，s Lab-Manual, Yusuke Nakamura编辑，Yodo-sha ( 2002 )等中。所有上述出版物在此一皮引入作 为参考。
如本文所用的，术语"表达水平(或量)"是指在一个细胞中表达 的多肽或mRNA的量。术语"表达水平"包括多肽表达的蛋白质水平，
如，ELISA法、RIA法、荧光抗体法、蛋白质印记法、免疫组织染色法等，也包括多肽表达的mRNA水平，其通过合适的方法评价，包括分子 生物学测定法(例如，RNA印记法、点印记法、PCR法等)。术语"表 达水平的变化"是指多肽表达的蛋白质水平或mRNA水平的升高或降 低，通过适当方法评价，包括上述的免疫测定法或分子生物学测定法。
如本文所用的，除非另外指出，术语"转化"、"转导"和"转染"互换 使用，是指将核酸导入宿主细胞中。作为一种转化方法，任何将DNA 导入宿主细胞的方法都是可用的，包括各种已知方法，例如电穿孔方法、 粒子枪法(基因枪)、磷酸钓法等。
如本文所用的，术语"转化体"是指通过转化生产的生物体的整体 或者部分，如细胞。转化体的例子包括原核生物细胞、酵母、动物细胞、 植物细胞、昆虫细胞等。根据对象的不同，转化体是指转化细胞、转化 组织、转化宿主等。如本文所用的，包括所有转化形式，但是在具体上 下文中特指某种特定的形式。
原核生物细胞的例子包括，大肠杆菌属、沙雷氏菌属(Sermtm)、 芽月包杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、；唪状斥干菌属 (Corynebacterium )、 樣i #干菌属 (Microbacterium )、 々￡单月包菌属 (Pseudomonas)等的原核细胞，例如大肠杆菌XL1 - Blue,大肠杆菌XL2 -Blue,大肠杆菌DH1，大肠杆菌MC1000,大肠杆菌KY3276,大肠杆 菌W1485，大肠杆菌JM109,大肠杆菌HBIOI,大肠杆菌No.49,大肠杆 菌W3110,大肠杆菌NY49,大肠杆菌BL21(DE3 )，大肠杆菌BL21 ( DE3 ) pLysS,大肠杆菌HMS174 ( DE3 ),大肠杆菌HMS174 ( DE3 ) pLysS, 无花果沙、雷氏菌(Serratia ficaria),居7良妙、雷氏菌(Serratia fonticola), 液沙雷氏菌 (Serratia liquefaciens ), 粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens )，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ),解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens), 产氛短杆菌(Brevibacterium ammmoniagenes), Brevibacterium immariophilum ATCC14068,解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum ) ATCC14066 , 谷氨酸才奉斗干菌 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032,谷氨酸棒杆菌ATCC14067,谷氨酸棒杆菌 ATCC13869,嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870,嗜氨孩i杆菌(Microbacterium ammomaphilum )ATCC15354, 假单胞菌某种(Pseudomonas sp. ) D-0110,等等。
动物细胞的例子包括脐带血单核细胞、外周血单核细胞、Sup-Tl细胞，等等。
术语"动物"以其最广的含义用于本文中，是指脊推动物和无脊推 动物(例如节肢动物)。动物的例子包括但不限于哺乳动物纲、鸟纲、 爬4亍纲、两栖纲、鱼纲、昆虫纲、蠕虫纲等的任何动物。
如本文所用的，所谓生物体的"组织"是基本上具有相同功能的细 胞的集合。因此，组织可以是器官的一部分。器官通常具有功能相同的 细胞，并且同时存在功能略微不同的细胞。因此，如本文所用的，组织 具有各种类型的细胞，只要这些细胞共同具有一定特性。
如本文所用，术语"器官"是指具有一种独立的形态，其中一种或 一种以上的组织配合行使特定功能的结构体。对于植物，器官的例子包 括但不限于愈伤组织、根、茎、植干、叶、花、种子、胚芽、胚、果实 等。对于动物，器官的例子包括但不局限于胃、肝脏、肠、胰腺、肺、 气管、鼻、心脏、动脉、静脉、淋巴结(淋巴系统)、胸腺、卵巢、目艮、 耳、舌、皮肤等等。
如本文所用的，术语"转基因的"是指将特定基因整合到某生物体 (例如，植物或动物(小鼠等))中或整合了这类基因的生物体。
当本发明的生物体是动物时，转基因生物体可以利用微注射法(微 量注射法)、病毒载体法、胚胎干细胞(ES)法、精子载体法、染色体
片段导入法(体细胞转染法(transsomic method))、附加体法等来制 备。这些转基因动物的制备技术在本领域中是已知的。
如本文所用的，术语"筛选"是指使用特定操作/评价方法，从大量候 选者中选择具有感兴趣特性的物质、宿主细胞、病毒等。应当理解，本 发明包括通过筛选获得的具有期望活性的病毒。
如本文所用的，术语"芯片"或"微芯片"可以互换使用，是指具 有多种功能的、构成系统的一部分的微型集成电路。芯片的例子包括但 不限于DNA芯片、蛋白质芯片等。
本发明的疱渗病毒启动子用作一种药物组合物的成分，该药物用于 处理、防止和/或治疗淋巴细胞系的或血细胞系的、免疫的和感染的疾病。
如本文所用，与药物相关的术语"有效量"是指使得所述药物具有 实现目的药效的含量。如本文所用的，对应于最小浓度的有效量将称为 最小有效量。这种最小有效量是本领域所公知的。通常，药物的最小有 效量由本领域的4支术人员确定，或可由本领;或的4支术人员适宜i也确定。要确定有效量除了实际施用以外，还可以使用动物才莫型来确定。在本发 明中在确定此种有效量时是有用的。
如本文所用，术语"药学上可接受的载体"是指用于制造医药或农 药(如动物药)时所使用的物质，并且该物质对有效成分不产生不良影
响。这种药学上可接受的载体的例子包括但不限于抗氧化剂、防腐剂、
着色剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填料、填充剂、緩 冲液、呈递载体、赋形剂、和/或农业的或药学的佐剂。
基于通过本发明方法所获得的信息(例如与疾病相关的信息)，考 虑使用目的、对象疾病(种类，严重程度等)、患者的年龄、体重、性 别、既往病史、施用部位的形态或种类等，本领域的技术人员可以容易 地确定本发明的处置方法中所使用的药剂的种类和用量。鉴于使用目 的、对象疾病(种类、严重程度等)、患者的年龄、体重、性别、既往 病史和治疗过程等，本行业从业人员可以^[艮容易决定对受试者(患者) 施用本发明的监测方法的频率。作为监测疾病状态的频率包括每日一次 到数月一次(例如一周一次到l个月一次)。优选地，基于治疗进程， 每周一次到每月 一次地进行监测。
如本文所用的，术语"指导说明书"针对实施本发明方法的医生、 患者等所作的对本发明方法的描述。该指导说明书指明了施用本发明的
药剂的时间，例如在放射性治疗之前或之后(例如24小时之内等)。所 述的说明书按照实施本发明的国家监"^管理部门(例如，日本的厚生劳 动省、美国的食品药品局(FDA)等)所规定的样式编写，并标明已得 到所述监督管理部门的认可。该指导说明书即所谓的包装说明书，通常 以纸为介质提供，yf旦也并不局限于此，也可以通过例如电子々某体(例如 通过互联网提供的主页或电子邮件)的形式提供。
必要时，在本发明的治疗中，可以使用两种或两种以上的药剂。在 使用两种以上的药剂时，这些药剂具有类似性质或类似的来源，也可以 具有不同性质或不同的来源。可以通过本发明的方法获得有关使用两种 以上药剂的方法中药物抗性水平的相关信息。
本发明中所用的培养方法在如 "Doubutsu Baiyosaibo Manual (Animal Culture Cell Manual) , Seno等人编,Kyoritsu shuppan, 1993 中有描述并得到其支持，所述文献在此全文引入作为参考。(制备多肽的方法)
通过如下方法制备本发明的多肽，包括以标准的培养方式，培养来 自具有重组载体的微生物或动物细胞的转化体，该重组载体中插入了编
码本发明多肽的DNA,生产并沉淀本发明的多肽，从本发明的培养物中
回收本发明的多肽。
来实施。用于培养以原核生物细胞如大肠杆菌等或者真核细胞如酵母作 为宿主而获得的转化体的培养液包括那些包括碳源、氮源、无机盐等能 够被本发明的生物体吸收的物质的培养液，这些培养液能够有效地培养 转化体，它们可以是天然的或合成的。
可以使用能够被微生物吸收的碳源，包括如葡萄糖、果糖、蔗糖、 食糖或含有糖的蜂蜜、淀粉、淀粉水解产物、有机酸如醋酸和丙酸、醇 如乙醇和丙醇等。
例如，可以使用如下的氮源氨，无机酸或有机酸的各种铵盐，例 如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵，其他含氮物质等，肽，肉提取物， 酵母提取物，玉米浸泡液，酪蛋白水解产物，大豆粉，大豆粉水解产物， 各种发酵的细菌体，以及它们的消化产物等。
例如，可以使用如下的无机盐磷酸氬钾，磷酸二氳钾，磷酸镁， 硫酸镁，氯化钠，磷酸铁，硫酸锰，硫酸铜，碳酸钓等。在有氧条件下 进行培养，例如摇床或者强通风搅动培养。
培养温度优选在15 ~ 40。C之间。培养时间通常从5小时到7天之间， 但是不受此限制。培养过程中的pH值保持在3.0-9.0。通过添加无机 酸或有机酸或者碱性溶液、尿素、碳酸钓氨水等来调节pH值。在培养 过程中，按需要添加抗生素，如氨节青霉素或四环素等。
当对用含有诱导型启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，可
选择地往培养液中添加诱导剂。例如，当对用含有lac启动子的表达载 体转化的微生物进行培养时，往培养液中添加异丙基-P-D-硫代半乳糖吡 喃糖苷等。当对用含有trp启动子的表达载体转化的微生物进行培养时， 往培养液中添加吲哚丙烯酸等。使用发酵罐，大规;漢地培养导入基因的 细胞或器官。本文使用通常使用的培养液，例如Murashige和Skoog (MS) 液、White氏培养液或者那些添加了茁长素、细胞因子或植物激素等的 培养液。例如，当使用动物细胞时，用于培养本发明的细胞的培养基包括，
例如通常使用的那些培养基，例如RMPI1640培养基[The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)] 、 Eagle氏MEM培养基 [Science,122,501(1952)]、 DMEM培养基[Virology,8,396(1959)]、 199培养 基[Proceedings of the Society for the Biological Medicine,73,l(1950)]或者
添加了胎儿牛血清等的培养基。
通常在如pH6-8、 25 -40°C、 5 % C〇2的条件下培养1 - 7天。在 培养过程中，可选择地往培养基中添加抗生素，如卡纳霉素、青霉素、 链霉素等。
使用本领域熟知和通常使用的分离或纯化酶的常规方法，从用编码 多肽核酸序列转化的转化体培养物中分离或纯化本发明的多肽。例如， 本发明的多肽被分泌到用于生产多肽的转化体外部对该培养物进行离 心等操作，获得可溶的部分。通过溶剂提取，用硫酸铵等进行盐析/脱盐， 用有机溶剂进行沉淀，使用树脂(例如二乙基氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、 DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical Corporation)等)进行阴离子交换 层析，使用树脂(例如S-琼脂糖FF (Pharmacia)等)进行阳离子交换层 析，用树脂(如丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等)进行疏水性层析，用分子 筛进行凝胶过滤，亲合层析，层析聚焦，电泳(例如等电子聚焦电泳等) 等方法，从可溶部分中获得被纯化的样本。
当本发明的多肽被表达并在细胞内形成不溶的实体时，收集细胞， 研磨成粉末并离心。使用常用方法，从生成的沉淀中收集本发明的多肽。 用多肽变性剂溶解不溶的多肽。当多肽变性剂的浓度太低而不能使多肽 变性时，将得到的溶液进行稀释，或者用无变性剂的溶液或稀溶液进行 透析。使本发明的多肽形成正常的三维结构，通过上述的分离和纯化方 法获得被纯化的样本。
用常用的蛋白质纯化方法(J.Evan.Sadler等人Methods m Enzymology,83，458)进行纯化。可替代地，本发明的多肽与其他蛋白质 融合，生成一种融合蛋白，用与该融合蛋白具有亲合性的物质，通过亲 合层4斤来纯4^融合蛋白(Akio Yamakawa, Experimental Medicine, 13, 469-474 (1995))。例如，按照Lowe等人，Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227-8231 (1989) Genes Develop.，4,1288(19卯))中描述的方法,生成本发 明的多肽与蛋白质A的融合蛋白，接着用免疫球蛋白G进行亲合层析来纯化。
制备本发明的多肽与FLAG肽的融合蛋白，接着用FLAG抗体进行 亲合层析来进行纯化(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227(1989),Genes Develop.,4,1288(1990))。
用结合多肽的抗体进行亲合层析来纯化本发明的多肽。按照已知方 法(J. Biomolecular NMR,6,129-134 ; Sdence,242,1162-1164 ; J. Biochem.,110,166-168(1991)),用体外转录/翻译系统来制备本发明的多 肽。
根据多肽的氨基酸信息，通过化学合成方法来制备本发明的多肽， 例如Fmoc法(氟基曱氧基羰基法)、tBoc法(t-丁氧基羰基法)等。使用肽 合成法,化学合成该肽(可由Advanced ChemTech, Applied Biosystems, Pharmacia Biotech, Protein Technology Instrument, Synthecell國Vega, PerSeptive, Shimadzu等公司合成)。
被纯化的本发明的多肽的结构可通过蛋白质化学工业中常用的方 法来确定(参见,例如Hisashi Hirano. "Protein Structure Analysis for Gene Cloning", Tokyo Kagaku Dojin出版,1993)。 t姿照已知的测定方法来测量 本发明的多肽的生理学活性。
(制备多肽变体的方法)
通过本申请之前熟知的定点i秀变方法，对本发明的多肽的氨基酸进 行缺失、替代或添力口 。按照Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1 ~ 38,John Wiley & Sons( 1987-1997)、 Nucleic Acids Research, 10,6487(1982) 、
Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982),Gene,34，315(1985) 、 Nucleic Acids Research,13,4431(1985), Proc.Natl.Acad.Sci USA,82,488(1985)、 Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,5662(1984) 、 Science,224,1431(1984) 、 PCT WO85/00817(1985)、Nature，316,601(1985)等中描述的方法，制备缺失、 替代或添加了 一个或多个氨基酸的那些多肽。
(基因治疗)
在某些具体实施方式
中，施用包含编码抗体或其功能性衍生物的序列的核酸来进行基因治疗、处理、抑制或阻止与本发明中所用多肽的异 常表达和/或活性相关的疾病或异常。基因治疗是指通过施用在受试者中 已经被表达或者能够被表达的核酸而进行的治疗。在本发明的具体实施 方式中，核酸生成其所编码的蛋白质，而该蛋白质产生一种治疗效果。
任何本领域可获得的用于基因治疗的方法被用于本发明中。下文将 描述示例性的方法。
参见如下关于基因治疗的综述文章Goldspiel等人，Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson,Ann.Rev.Biochem. 62:191-217(1993);以及May, TIBTECH 11(5):155-215(1993)。通常所知 的用于基因治疗的DNA重组法一皮描述在Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1993);以及 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990)中。
(治疗活性或预防活性的证实)
在应用于人之前，优选在体外，然后在体内检测本发明的化合物或 药物组合物的期望治疗活性或者预防活性。用于证实化合物或药物组合 物的治疗或预防效用的体外分析包括化合物对细胞系或患者组织样本 的作用。使用本领域技术人员知晓的方法(包括但是不限于细胞溶解分 析)，确定化合物或组合物对细胞系和/或组织样本的作用。按照本发明，
分析，在该分析中，患者组织样本在培养基中培养，暴露于一种化合物 中或者给予一种化合物，并观察该化合物对组织样本的作用。
(治疗性的/预防性的给药和组合物)
本发明提供一种治疗、阻止和预防方法，通过给受试者施用有效量 的一种成分或药物组合物，其中包含本发明的启动子。在一个优选方面， 包含启动子的成分基本上是纯化的(例如，包括其作用被降低或者基本 上不含引起不期望的副作用的物质)。受试者优选是动物，包括但是不 限于牛、猪、马、鸡、猫、狗等，并且优选灵长类，最优选是人。当将本发明的核酸分子或多肽用作药剂时，该药剂进一步包含药学 上可接受到载体。任何本领域已知的药学上可接受到载体可被用于本发 明的药剂中。
药学上可接受的载体或合适的制剂物质包括但是不限于，抗氧化 剂、防腐剂、着色剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填料、 填充剂、緩冲液、运载工具、和/或药学佐剂。通常，本发明的药剂以包 含多肽或多核苷酸或其变体或片段，或其变体或衍生物，或者能够调节 这些物质的任何一种的试剂，以及至少一种生理学上可接受到载体、赋 形剂或稀释剂的形式给药。例如，合适当载体是注射溶液、生理溶液或 者人工脑积水液，其中可添加通常用于胃肠外呈递组合物中的其他物 质。
本发明所用的可接受到载体、赋形剂或稳定剂优选对接受者没有毒 性，优选这里所用的剂量和浓度下是惰性的，优选包括磷酸、柠檬酸或
者其他有机酸；抗坏血酸，a-生育酚；小分子量的多肽；蛋白质(例如 血清白蛋白、白明胶或者免疫球蛋白)；亲水性聚合物(例如，聚乙烯 吡咯烷酮)；氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖 氨酸)；单糖、二糖，以及其他碳水化合物(葡萄糖、甘露糖或者糊精)； 螯合剂(例如，EDTA);糖醇(例如甘露醇或山梨糖醇)；成盐抗衡离 子(例如钠)；和/或非离子型表面活性剂(例如Tween,聚丙二醇或聚 乙二醇(PEG))。
合适载体的例子包括中性緩冲盐水溶液或者与血清白蛋白混合的 盐水溶液。优选地，该产品用合适赋形剂(如蔗糖)配制成冻干品。按 需要还包括其他的标准载体、稀释剂和赋形剂。其他示例性组合物包含 pH 7.0-8.5的Tris緩冲液，或者pH 4.0-5.5的醋酸緩冲液，其中还包括 山梨糖醇或者其合适的替代品。
本发明的药剂通过口服或者胃肠外给药。可替代地，本发明的药剂 通过静脉内或皮下给药。当全身给药时，用于本发明中的药剂可以是无 热原的药学上可接受的水溶液。在制备这些药学上可接受的组合物时， 对于pH、渗透压、稳定性等方面的调节是本领域内的技术。给药的方 式可以是口服、胃肠外施用(例如，静脉内、肌肉内、皮下、皮内、应 用到粘膜、直肠内、阴道内、局部应用于作用部位，应用于皮肤等)。 以任何制剂形式指示这种给药方式。这种制剂形式包括液体制剂、注射剂、稳定的制备物等等。
将具有期望纯度的糖链组合物与可选择的生理学上可接受的载体、
赋形剂或稳定剂混合(Japanese Pharmacopeia ver. 14,或其增刊或者最新 版本； Remington's Pharmaceutical Sciences,第十八版,A. R. Gennaro 编辑，Mack Publishing Company, 1990;等等)，将本发明的药剂制备成冻 干块或者水溶液形式，便于保存。
基于通过本发明方法所获得的信息(例如与疾病相关的信息)，考 虑使用目的、对象疾病(种类，严重程度等)、患者的年龄、体重、性 别、既往病史、施用部位的形态或种类等，本领域的技术人员可以容易 地确定本发明的处置方法中所使用的药剂的种类和用量。鉴于使用目 的、对象疾病(种类，严重程度等)、患者的年龄、体重、性别、既往 病史和治疗过程等，本行业从业人员可以很容易决定对受试者(患者) 施用本发明的监测方法的频率。作为监测疾病状态的频率包括每日 一次 到数月一次(例如一周一次到l个月一次)。优选地，基于治疗进程， 每周一次到每月 一次地进行监测。
(免疫治疗)
如本文所用的，术语"疫苗"是指一种组合物(例如悬浮液或者溶 液)，其包含一种通常具有感染性的制剂或者感染性制剂的一部分，能 够产生这种制剂或其部分的物质(如基因序列)，以引发有效的免疫反 应。含有抗原部分的疫苗可以是一种微生物(例如病毒或者细菌等)， 从这种微生物中纯化得到的天然产物、合成产物或遗传工程化的蛋白 质、肽、多糖或者类似产物以及包含编码这种蛋白质的核酸序列的核酸 分子。疫苗通过导致中和抗体的生成来发挥作用。
如本文所用的，术语'"基因疫苗"是指一种组合物(例如悬浮液或 溶液等)，其包含一种物质(通常为核酸分子)，其在被施用的受试者 中表达，并且该表达产物具有疫苗作用。典型的遗传疫苗是核酸分子(例 如，载体、质粒、棵DNA等)，其包含编码具有抗原性的基因产物的 核酸序列。
如本文所用的，本发明的疫苗的作用可用任何本领域已知的方法来 证实。这种方法包括^f旦是不限于如CTL前体细胞频率分冲斤法、ELISPOT 法、四聚物法、实时PCR法等。作为对CTL前体细力包频率分析法的示例性说明，在存在IL-2时培养外周淋巴细胞或者抗原性肽与淋巴细胞， 进行限制性稀释，将IL-2和伺养细胞进行共培养，用疫苗或其候选物刺 激包含子代的孔，用ELISA检测是否生成IFN-Y。按照Poisson分析法， 用作为阳性的孔计算前体细胞的频率，以评价该疫苗效用。如本文所用 的，阳性细胞的数目是抗原特异性CTL的数目，该数目越大，该疫苗的 效用越高。
本发明可用作一种癌症疫苗。在这种情形下，包含作为外源基因的 癌症纟元原。
如本文所用的，术语"癌症抗原，，是指一种在正常细胞的癌化过程 中被重新表达的抗原分子。这种癌症抗原包括但是不限于例如
(1) 肿瘤病毒来源的抗原(例如,T抗原等，来自DNA型肿瘤病毒，如 腺病毒、多瘤病毒、SV40等)。在人或小鼠的RNA型胂瘤病毒中，病 毒来源的衣壳蛋白在细胞表面表达；
(2) 肿瘤特异性移植抗原(TSTA);该抗原是指当癌症细胞由于产生特 异性免疫反应而被排斥时，相同细胞系的癌症细胞的目标抗原。遗传突 变导致在癌症细胞中生成变异蛋白质，使得其在癌症细胞表面上表达， 与其他细胞内正常蛋白质一样，主要组织相容性(MHC)抗原基因复合 物分子作为肽片段；
(3) 与肿瘤相关的抗原(TAA):虽然该抗原对于癌症细胞来说并非必 然特异性的，但是其在癌化过程中特异性表达。例如，其对应于肝癌中 的a-胎蛋白、肠癌中的癌胚抗原(CEA)等。这些蛋白质最初仅存在于正 常胎儿中，而不存在于成人组织中。然而，这些蛋白质在癌化过程中会 再表达，也一皮称作为癌胚(oncofetal)抗原。
如本文所用，可以使用任何形式的癌症抗原，特别地，优选使用与 癌症相关的抗原。这是因为其在与MHC相关的癌症细胞的表面表达。
如本文所用，术语"佐剂"是指与免疫原混合而被施用时增加或改 变免疫反应的物质。佐剂分为矿物质、细菌、植物、合成的或者宿主的 产物。
如本文所用，术语"病原体"是指一种能够使得宿主开始患病或者 出现异常的生物体或试剂。
如本文所用，术语"预防"和"阻止"是指对一种疾病或异常进行 的处理，使得该疾病或异常在其真正发作之前不被引发。如本文所用，术语"治疗"和"处置"是指一种处置，但进行该处 置时，能够防止一种疾病或异常的恶化，优选地，至少保持该状态，更 优选地，緩和疾病或异常，更优选地消除该疾病或异常。
在应用于人之前，优选在体外，然后在体内检测本发明的疫苗是否 具有期望的治疗或预防活性。例如，体外分析本发明的疫苗的治疗效用 或预防效用的方法包括检测疫苗对细胞系或者患者组织样本的作用。疫 苗对细胞系和/或组织样本的作用可用本领域技术人员知晓的方法(例
如，免疫分析如ELISA)来确定。体内检测方法包括但是不限于如检 测是否生成中和抗体的方法。
如本文所用。术语"患者"或"受试者"是指本发明的处置或组合 物所应用的生物体。优选地，患者是人。
本发明给受试者施用有效量的本发明的基因疫苗，提供处置、抑制 和预防方法。在一个优选方面，该化合物基本上是纯的(例如，基本上 不含有限制其效用或者产生不期望的副作用的物质)。
如本文所用，术语"施用"是指单独地或者与其他治疗剂组合，将本 发明的多肽、多核苷酸等或者含有它们的药物组合物掺入到生物体的细 胞、组织或机体中。组合施用是伴随进行(例如，化合物)，分开但是 同时或者一起地施用；或者顺序地施用。这包括组合试剂作为一种治疗 混合物共同施用的方式，也包括组合试剂分别但是同时地施用的程序 (例如通过不同的或相同的粘膜进入同一个体)。"组合"施用还包括 分别施用化合物或试剂之一，首先给予第一种，接着给予第二种。
可通过任何方式施用本发明的疫苗，而优选是使用无针头的注射
如本文所用:,、术语"无针头的注射器"是^旨一种医疗装置，其通 过气压或者弹性元件的弹性移动活塞，将药液转移到皮肤中，从而将药 物成分施用到皮下或者优选施用到细胞的皮下部位。
特别；也，例如，ShimajefM(由Shimadzu 乂>司力口工)、Medi-Jector VisionTM(由Elitemedica加工)、PenJetTM(由PenJet加工),它们都可以购买 得到。基因枪(粒子枪)是指一种医学装置和实验装置，其利用氦的气 压等，使高密度粒子如包被了 DNA的金或钨加速，将基因导入体内。 基因枪的优点包括有效地往细胞内导入低含量的DNA,由不同的操作人 员能够获得稳定结果。分别地，例如，美国Bio-Rad的Helios基因枪可以购买得到。 如本文所用，术语"指导说明书"是针对实施给药的医生、患者等 而对本发明的方法的描述。该指导说明书指明了施用本发明的药剂的时 间，例如在放射性治疗之前或之后(例如24小时之内等)。所述的说明 书按照实施本发明的国家监督管理部门(例如，日本的厚生劳动省、美 国的食品药品局(FDA)等)所规定的样式编写，并标明已得到所述监 督管理部门的认可。该指导说明书即所谓的包装说明书，通常以纸为介 质提供，但也并不局限于此，也可以通过例如电子媒体(例如通过互联 网提供的主页或电子邮件)的形式提供。
借助用商业上购买得到的分析或装置检测抗体生成的结果，可判断
何时可终止用本发明的方法进;f亍的处置或阻止。
本发明还提供一种药物包装或试剂盒，其包含装有一种或多种本发 明的药物组合物的容器。将按照监控药物产品或生物产品的生产、使用 和销售的政府部门所确定形式的告示任意地粘贴到该容器上，表示得到 有关政府机关对于施用于人的制造、使用或销售予以认可。
(本文所用的常规技术)
除非另外指出，本文所用的技术都在本发明的技术领域内。这些技 术通常^皮用于糖链科学、应用流体学、微型加工、有机化学、生物化学、 遗传工程学、分子生物学、微生物学、遗传学领域以及它们的相关领域。 这些技术在下文引证的文件和本文提及的其他文件中被充分地描述。
樣i型加工在如Campbell, S.A. (1996), The Science and Engineering of Microelectronic Fabrication, Oxford University Press; Zaut, P.V. (1996》 Micromicroarray Fabrication: a Practical Guide to Semiconductor Processing, Semiconductor Services; Madou, M.J. (1997)， Fundamentals of Microfabrication, CRC1 5 Press; Rai-Choudhury, P. (1997), Handbook of Microlithography, Micromachining & Microfabrication: Microlithography等中已经有描述，这些文献中的相关部分在此被引入作 为参考。
本文所用的分子生物学技术、生物化学技术和微生物学技术是本领 域熟知和通常使用的，在如Maniatis, T.等人(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and its 3rd Ed. (2001); Ausubel,F.M.等人eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., NY, 10158 (2000); Innis, M.A. (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Innis, M.A.等人(1995), PCR Strategies, Academic Press; Sninsky, J丄等人(1999), PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press; Gait, M.J. (1985), Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M.J. (1990), Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F. (1991), Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approac， IRL Press; Adams, R丄.等人(1992), The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z.等人(1994)， Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G.M.等人(1996), Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate Techniques, Academic Press; Method in Enzymology 230, 242， 247, Academic Press, 1994; Special issue, Jikken Igaku (Experimental Medicine) "Idenshi Donyu & Hatsugenkaiseki Jikkenho (Experimental Method for Gene introduction & Expression Analysis)", Yodo-sha, 1997等中有描述。这些出版物的相关部 分(或可能是全部)在此被引入作为参考。
(优选具体实施方式
的描述)
下文将通过具体实施方式
来描述本发明。下文描述的具体实施方式
仅用于说明目的。因此，本发明的保护范围不限于具体实施方式
，而是 限于附随的权利要求书。本领域技术人员将清楚认识到，在不背离本发 明的保护范围时，可参照本说明书进行各种变化和改进。
一个方面，本发明提供HHV (包括HHV6A和HHV6B,特别是 HHV6B)和HHV7的MIE启动子，和/或HHV7的U95启动子。特别 地，已经发现，与HCMV的IE启动子相比，HHV6B的MIE启动子、 HHV7的MIE启动子以及HHV7的U95启动子对淋巴细胞的选择性令 人惊奇地增强。特别地，在黏着细胞(293细胞、Vero细胞等)中仅表 现出HCMVIE启动子活性的百分之一，而在淋巴细胞例如SupTl、U937 等中，表达效率增加了数倍。如此高水平的选择性或特异性说明该启动 子可被用于开发一种药物，该药物作为DNA疫苗，用于基因治疗，特别是针对淋巴细胞的治疗。而且在体内表达系统中，即使在使用活性强
大的CMV启动子的情况下，由于甲基化酶的作用，启动子的活性:故降
量。在遗传疾病中，通常使用逆转录病毒对癌症进行基因治疗，然而，
作为一种启动子，LTR的活性并非如此有效，将本发明的启动子导入将 被表达的基因的上游，可以在血细胞系细胞中实现有效表达。本发明还 可以用于靶向血细胞疾病如白血病等的基因治疗。此外，RNAi被用作 去除基因表达的方法，而本发明的启动子被用作发夹型RNA表达载体 的启动子，能够更为有效地抑制血细胞系细胞中的表达。用流式细胞仪， 从天然外周血中纯化得到巨噬细胞或树突细胞等等，用所构建的质粒转 染这些细胞，所述质粒在本发明的启动子控制下表达癌症特异性抗原或 者肺瘤坏死因子(TNF)等，在被证实能够表达癌症抗原后，将这些细 胞重新导入到起始的机体中，由于胂瘤抗原特异性CTL通过I-HLA型 产生的有效作用，来对癌症进行基因治疗。
在一个具体实施方式
中，本发明的启动子长度为至少8个毗邻的核
苷酸。优选地，本发明的启动子至少包括SEQIDNO: l中所示的序列 的R3区或其功能性变体。本发明的启动子至少包含距离SEQIDNO: 1 的转录起始点-574到-427的序列；更优选地，至少包含距离SEQ ID NO: 1的转录起始点-1051到-427的序列。这是因为可以预期这些区域包括具 有增强子活性的区域。
在一个具体实施方式
中，本发明的启动子包括NF-kB的基序和AP-1
的基序。
在一个优选的具体实施方式
中，本发明的启动子包括SEQIDNO: 1中所示的序列，更优选地基本上由SEQIDNO: 1中所示的序列组成。
在一个具体实施方式
中，本发明的启动子包括(a)具有SEQID NO: 1中所示的碱基序列或者与之对应的碱基序列或其序列片段的多核 普酸；(b)SEQIDNO: l所示的碱基序列的，或者与之对应的碱基序 列的等位基因变体或其序列片段的多核苷酸；(c)与(a)或(b)中 的任何一种的多核苷酸杂交并且具有其一种生物活性的多核苷酸；或者 (d)由(a) - (c)中的任何一种的碱基序列或者具有至少70%同一 性的互补序列组成并且具有其一种生物活性的多核苷酸。如本文所用， 生物活性是启动子活性和/或增强子活性，但是不限于此。启动子活性和增强子活性可以用本领域熟知的方法来测定，本文中描述了这种方法， 并在实施例中列举。
在一个优选的具体实施方式
中，在上述(a) - (d)中所述的替代、 添加和缺失的数量限于，例如，优选地50个或更少个、40个或更少个、 30个或更少个、20个或更少个、15个或更少个、IO个或更少个、9个 或更少个、8个或更少个、7个或更少个、6个或更少个、5个或更少个、 4个或更少个、3个或更少个、或者2个或更少个。替^f戈、添加和缺失 的数量优选较小，但是只要能够保持生物活性也可以较大(优选地，其 活性与HHV6BMIE启动子的活性相似或者基本上相同)。
在一个具体实施方式
中，与上述(a) _ (d)中所述的多核苷酸的 任何一种或其互补序列的同一性至少约80%,更优选至少约90%,甚至 更优选至少约98%,最优选至少约99%。
在一个优选的具体实施方式
中，本发明的核酸分子的长度至少为8 个毗邻的核苷酸。根据使用本发明的目的，本发明的核酸分子的合适长 度可能是变化的。更优选地，本发明的核酸分子的长度至少为10个毗 邻的核普酸，甚至更优选为至少15个毗邻的核苦酸，而更优选为至少 20个毗邻的核苷酸。核苷酸长度的下限在上面特别指定的数量之间(例 如，9个、11个、12个、13个、14个、16个等)或者大于上面特别指 定的数量(例如，21个、22个、...30个等)。本发明多肽的长度的上 限不受限制，只要其可被用于特定目的(例如启动子)。严谨性可以 是高的、中度的或低的，并且可根据情况适当地确定严谨性水平。
在不同的具体实施方式
中，本发明的启动子的长度为至少8毗邻的 核苷酸。优选地，本发明的启动子至少包4舌SEQIDNO: 2中所示序列 中的R2区或其功能性变体。更优选地，本发明的启动子至少包括距离 SEQ ID NO: 2的转录起始位点-388到+22的序列；更优选地，至少包 括距离SEQIDNO: 2的转录起始位点-493到+22的序列。这是因为可 以预期这些区域包括具有增强子活性的区域。
在一个实施方式中，本发明的启动子包括NF-kB基序(SEQ ID NO: 2中的-464到-478以及-359到-350 )。
在一个优选的实施方式中，本发明的启动子包4舌，SEQ ID NO: 2 中所示的序列，更优选地，基本上由SEQIDNO: 2中所示序列组成。
在一个实施方式中，本发明的启动子包括(a)具有SEQ ID NO:2中所示的碱基序列或者与之对应的碱基序列或其序列片段的多核苦
酸；(b) SEQ ID NO: 2中所示的碱基序列或者与之对应的碱基序列 的等位基因变体或其序列片段的多核苷酸；(c)与(a)或(b)中的 任何一种的多核苷酸杂交并且具有其一种生物活性的多核苷酸；或者 (d)由(a) - (c)中的任何一种的碱基序列或者具有至少70%同一 性的互补序列组成并且具有其一种生物活性的多核苷酸。如本文所用 的，生物活性是启动子活性和/或增强子活性，但是不限于此。启动子活 性和增强子活性可以用本领域熟知的方法来测定，本文中描述了这种方 法，并在实施例中列举。
在一个优选的实施方式中，在上迷(a) - (d)中所述的替代、添 加和缺失的数量限于，例如，优选地50个或更少个、40个或更少个、 30个或更少个、20个或更少个、15个或更少个、IO个或更少个、9个 或更少个、8个或更少个、7个或更少个、6个或更少个、5个或更少个、 4个或更少个、3个或更少个、或者2个或更少个。替代、添加和缺失 的数量优选较小，但是只要能够保持生物活性也可以较大(优选地，其
在一个优选的实施方式中，与上述(a) - (d)中所迷的多核苦酸 的任何一种或其互补序列的同一性至少约80%,更优选至少约90%,甚 至更优选至少约98%，最优选至少约99%。
在一个优选的实施方式中，本发明的核酸分子的长度至少为8个毗 邻的核普酸。根据使用本发明的目的，本发明的核酸分子的合适长度可 能是变化的。更优选地，本发明的核酸分子的长度至少为10个毗邻的 核苷酸，甚至更优选为至少15个毗邻的核苷酸，而更优选为至少20个 毗邻的核苷酸。核普酸长度的下限在上面特别指定的数量之间(例如， 9个、11个、12个、13个、14个、16个等)或者大于上面特别指定的 数量(例如，21个、22个、...30个等)。本发明多肽的长度的上限不 受限制，只要其可被用于特定目的(例如启动子)。严谨度可以是高 的、中度的或低的，并且可根据具体情况适当地确定严谨度水平。
在另一个实施方式中，本发明的启动子的长度为至少8毗邻的核苷 酸。优选地，本发明的启动子至少包括SEQ ID NO: 12所示序列中的 R2区域或其功能性变体。更优选地，本发明的启动子至少包括距离SEQ ID NO: 12的转录起始位点-3798到+ 16的序列；更优选地，至少包括距离SEQIDNO: 2的转录起始位点-484到+ 16的序列。这是因为可以预 期这些区域包括具有增强子活性的区域。
在一个实施方式中，本发明的启动子包括NF-kB的基序(SEQ ID NO: 12中的-478到-469以及-373到-364 )。
在一个优选的实施方式中，本发明的启动子包括，SEQIDNO: 12 中所示的序列，更优选地，基本上由SEQIDNO: 12中所示序列组成。
在一个实施方式中，本发明的启动子包括(a )具有SEQ ID NO: 12中所示的碱基序列或者与之对应的碱基序列或其序列片段的多核苷 酸；(b)SEQIDNO: 12中所示的碱基序列或者与之对应的磁羞序列 的等位基因变体或其序列片段的多核苷酸；(c)与(a)或(b)中的 任何一种的多核苷酸杂交并且具有其一种生物活性的多核普酸；或者 (d)由(a) - (c)中的任何一种的碱基序列或者具有至少70%同一 性的互补序列组成并且具有其一种生物活性的多核苦酸。如本文所用 的，生物活性是启动子活性和/或增强子活性，但是不限于此。启动子活 性和增强子活性可以用本领域熟知的方法来测定，本文中描述了这种方 法，并在实施例中列举。
在一个优选的具体实施方式
中，在上述(a) - (d)中所述的替代、 添加和缺失的数量限于，例如，优选地50个或更少个、40个或更少个、 30个或更少个、20个或更少个、15个或更少个、IO个或更少个、9个 或更少个、8个或更少个、7个或更少个、6个或更少个、5个或更少个、 4个或更少个、3个或更少个、或者2个或更少个。替代、添加和缺失 的数量优选较小，但是只要能够保持生物活性也可以较大(优选地，其 活性与HHV7U95启动子的活性相似或者基本上相同)。
在一个优选的实施方式中，与上述(a) - (d)中所述的多核苷酸 的任何一种或其互补序列的同一性至少约80%,更优选至少约90%,甚 至更优选至少约98%,最优选至少约99%。
在一个优选的具体实施方式
中，本发明的核酸分子的长度至少为8 个毗邻的核苷酸。根据使用本发明的目的，本发明的核酸分子的合适长 度可能是变化的。更优选地，本发明的核酸分子的长度至少为10个毗 邻的核苦酸，甚至更优选为至少15个毗邻的核苦酸，而更优选为至少 20个毗邻的核苷酸。核苦酸长度的下限在上面特别指定的数量之间(例 如，9个、11个、12个、13个、14个、16个等)或者大于上面特别指定的数量(例如，21个、22个、...30个等)。本发明多肽的长度的上 限不受限制，只要其可被用于特定目的(例如启动子)。严谨度可以 是高的、中度的或低的，并且可根据具体情况适当地确定严谨度水平。
在另一个方面，本发明提供包括本发明的启动子(HHV6的MIE启 动子、HHV7的MIE启动子、HHV7的U95启动子等)的核酸构建体。 这种核酸构建体具有在淋巴细胞中特异诱导表达的性能，其有效性高， 与人巨细胞病毒(HCMV)正启动子相比，具有出乎意料的高特异性。
因此，在一个具体实施方式
中，本发明的核酸构建体包括编码外源 基因的序列，该序列与本发明的启动子具有不同来源，并且与本发明的 序列可操作地连接。
这种外源基因包括，但是不限于例如，编码RNAi分子、药物抗性、 将被删除的隐性基因、选择性标记等的那些基因。
优选地，用于本发明中的选择性标记是能够在培养基中选择导入了 该核酸构建体的宿主的那些标记，并且例如这些选择性标记是能够从视 觉上选择导入了该核酸构建体的宿主的那些标记，例如次黄噪呤鸟。票呤 磷酸核糖基转移酶(hprt)或者一种选自由绿色荧光蛋白(GFP)、兰 绿色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光蛋白(dsRed) 组成的组的焚光标i己。
优选地，本发明的核酸构建体中所包括的选择性标记有利地是对其 中按照本发明导入了核酸构建体的宿主基本上不具有毒性的那些标记。 这是因为当本发明用于治疗或预防目的时，优选不产生副作用。
本发明的核酸构建体中包括的选择性标记包括例如，将被删除的隐 性基因。如本文所用的，将被删除的隐性基因是指被删除时会造成患病 状况的任何隐性基因，包括但是不限于，例如ADA基因(与严重的联 合免疫缺陷(SCID )相关)、PNP基因(严重的联合免疫缺陷(SCID ))、 Yc链基因(与严重的联合免疫缺陷(SCID )相关)、TAP基因(与MHC I缺陷相关)、MHCII基因(与MHCII缺陷相关)、X-连接的WASP (与Wiskott-Aldrich综合征相关)、CD40配体(与X-连接高IgM综合 征相关)、PI3K-样基因(与肉芽瘤毛细血管扩张相关)和DNA解旋酶 (与Bloom氏综合征相关)等。
在一个优选的具体实施方式
中，本发明核酸构建体所包括的药物是 蛋白质试剂，例如细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白激素和肽激素，如固-a、 IFN卞IL画2、 IL-12、 G-CSF、 GM-CSF等。
在一个具体实施方式
中，在本发明的核酸构建体中，启动子在血细 胞系细胞，特别是T细胞中诱导外源基因的特异性表达。
在另一个方面，本发明提供一种包含本发明的核酸构建体的表达载 体。这种表达载体可以以可操作的连接方式包括表达所需的元件，这些 元件不存在于本发明的核酸构建体中，例如，终止子、增强子序列，允 许在宿主中进行表达。
在另一个优选的具体实施方式
中，选择性标记是无限增殖基因(例 如bcl-2)。可替代地，根据条件不同，选择性标记是次黄噤呤鸟嘌呤磷 酸核糖基转移酶(hprt)、编码毒性产物的基因、毒性基因产物与自杀 性底物的组合(例如，单纯疱渗病毒胸苦激酶(HSV-TK)与无环鸟苦 的组合)。
另一个方面，本发明提供包含本发明的核酸构建体的细胞。当这种 细胞为淋巴细胞时，能够促进编码蛋白质的外源基因的表达。
优选地，当本发明的细胞与本发明的启动子序列是异源的时是有利 的。即使该细胞为异源的也能够实现启动子活性，这是令人惊奇的效果 之一。将核酸导入本发明所用的细胞中的方法在本领域是熟知的，这在 上文中已有详细描述。可替代地，通过从包含细胞的样本中筛选包含核 酸分子的细胞来鉴定这种细胞。包含本发明的核酸分子的细胞优选处于
由于处在未分化的状态下，因此导入这种核酸分子的细胞能够以可调控 的方式表达。可替代地，用这种细胞来大量制备本发明的核酸。这种制 备方法在本领域是熟知的，并在本文描述的文献中有记载。
另一个方面，本发明提供包含本发明的核酸构建体的组织。这种核 酸序列优选被可操作地连接到控制序列上。这种器官是动物组织或者其 他生物体如植物的组织。可替代地，用这种组织大量地制备本发明的核 酸分子。这种制备方法在本领域是熟知的，并在本文描述的参考文献中 有记载。
另一个方面，本发明提供包含本发明的核酸构建体的器官。这种核 酸序列优选被可操作地连接到控制序列上。这种器官是动物组织或者其 他生物体如植物的组织。可替代地，用这种器官大量地制备本发明的核 酸分子。这种制备方法在本领域是熟知的，并在本文描述的参考文献中有记载。
另一个方面，本发明提供包含本发明的核酸构建体的生物体。用这 种生物体大量地制备本发明的核酸分子。这种制备方法在本领域是熟知 的，并在本文描述的参考文献中有记载。
另一个方面，本发明提供包含本发明的启动子的药物组合物。如本 文所用的，所用的抗原是被期望能够在宿主中引发免疫反应的任何蛋白 质。这种抗原包括但是不限于，例如，癌症抗原等。因此，本发明的药 物组合物优选是DNA疫苗。
另 一个方面，本发明提供治疗其中期望进行淋巴细胞特异性治疗的 疾病、异常或症状的药物组合物，其包括本发明的启动子以及用于所述 处理的核酸序列。如本文所用的，药物组合物的靶点合适地是期望进行 淋巴细胞特异性治疗的任何疾病、异常或症状，例如是获得性免疫缺陷
综合征。获得性免疫缺陷综合征包括，严重的联合免疫缺陷(SCID)、 MHCI缺陷、MHCII缺陷、威斯科特-奥尔德里奇综合征、X-连接的高 IgM综合征、肉芽瘤毛细血管扩张、Bloom氏综合征等。尽管不期望 受任何理论的约束，获得性免疫缺陷综合征是由隐性基因(在此也被称 作为要被删除的隐性基因)的某些缺陷引起的。因此，有可能实施体细 胞基因治疗，其中将要被删除的基因导入到从患者获得的骨髓细胞中， 然后将这些细胞重新导入到患者中。在这方面，本发明的HHV6B MIE 启动子可能被用于提高将分化为T细胞巨噬细胞等的细胞中的基因表达 效率。例如，可能用逆转录病毒等来导入这种基因构建体。
在一个优选的实施方式中，用于所述治疗的核酸序列包括选自由编 码细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白激素、肽激素、核酶和siRNA ( HIV-1 gp41 :
TT ( SEQ ID NO : 33 ) /HIV画1 tat :
TT ( SEQ ID NO: 34 ) /HTLV-1 tax :
(SEQ ID NO: 35))的那些序列组成的组的序列。
另一个方面，本发明提供以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的 方法，包括步骤A)制备一种核酸构建体，其中本发明的启动子被可操作地连接到编码蛋白质的核酸序列上；和B)将该核酸构建体^L置在
其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸序列表达的条件下。
另一个方面，本发明提供用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白
质的试剂盒，包含A) —种核酸构建体，其中本发明的启动子被可操 作地连接到编码蛋白质的核酸序列上；和B)用于将该核酸构建体放置 在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸序列表达的条件下的工具。
另一个方面，本发明还提供用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋 白质的试剂盒，包含A)本发明的启动子；和B)用于制备其中所述 启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的核酸构建体的工具。
另 一个方面，本发明还提供用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特 异性方式表达一种蛋白的疾病、异常或症状的方法，包括步骤A)制 备其中根据本发明启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的核酸 构建体；和B)将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质 的核酸序列表达的条件下。
另 一个方面，本发明还提供用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特 异性方式表达一种蛋白的疾病、异常或症状的试剂盒，包含A)其中 根据本发明的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的核酸构建体； 和B)用于在该启动子诱导编码蛋白质的核酸序列表达的条件下放置核 酸构建体的工具。
另 一个方面，本发明还提供用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特 异性方式表达一种蛋白的疾病、异常或症状的试剂盒，包含A)本发 明的启动子；和B)用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核 酸序列上的核酸构建体的工具。
另一个方面，本发明还提供一种制备蛋白质的方法，包括步骤:A) 制备其中根据本发明的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的核 酸构建体；和B)在该启动子诱导编码蛋白质的核酸序列表达的条件下 放置该核酸构建体。
另一个方面，本发明还提供用于制备蛋白质的试剂盒，包含A) 本发明的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的核酸构建体；和B ) 用于将核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸序列 表达的条件下的工具。
另一个方面，本发明还提供用于制备蛋白质的试剂盒，包含A)本发明的启动子；和B)用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质 的核酸序列上的核酸构建体的工具。另一个方面，本发明还提供本发明的启动子的用途，用于制造一种 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白的疾病、 异常或症状的药物组合物。本文引用的所有科技文献、专利、公开的专利申请以及出版物在此 引入作为参考，如同其在本文中完全列出一样。至此已经描述了本发明的优选具体实施方式
，其用于更好地理解本 发明。下面将通过实施例来描述本发明。下文描述的实施例仅用于说明 目的，因此，本发明的保护范围仅受附随权利要求书的限制。实施例对如下实施例中所用的动物的处理遵照O s ak a大学的身见定。(实施例1:搜索HHV6B启动子以及开发DNA疫苗) 对于HHV-6立即早期蛋白质的启动子(9U、 20U、 MIE、 U95、 MIE/3K、 U95/3K，在大小上存在差别)来说，将它们的活性与巨细胞 病毒(CMV)启动子的活性进行比较。在方法方面，将各个启动子区插 入到pGL3-Basic载体(Promega)的焚光素酶的上游，然后用其转染各 个细胞，并用荧光素酶活性作为参考来比较启动子的活性。下文将对材 沣十和方法进4iS羊细4苗述。 (材料与方法) (概略)克隆HHV-6B的MIE基因的启动子区(约1.2kbp),将其连接到日 本脑炎病毒北京-1抹cDNA下游的外膜糖蛋白，来构建体质粒 p9u/JEVenv。所用的绿色荧光蛋白质表达质粒pEGFP-Nl可购买得到(从 Clontech获得)。用质粒(pcDNA3.1/JEVenv)作为参照，其中JEVenv ,皮连接到 pcDNA3.1Zeo+载体的HCMV-IE启动子的下游。所用的绿色荧光蛋白质 表达质粒pEGFP-Nl可购买得到(从BD Biosciences获得)。此外，本 文所用的荧光素酶表达质粒是已经构建的质粒(pGL3-Basic;从Promega获得)。将这些质粒导入到如下细胞中293细胞(来自人肾脏)、Vero细胞(来自猿猴肾脏)、SupTl细胞(来自人T淋巴细胞)、U937细胞 (来自人单核细胞)等(这些细胞可从美国典型培养物保藏中心 (ATCC) 、 RIKEN细胞库、基因库等获得)。使用抗JEV的多克隆抗 体，通过间接焚光抗体法，对细胞提取物进行蛋白质印迹分析，分析外 膜糖蛋白在细胞中的表达情况。将HHV-6MIE的启动子区插入到焚光素酶载体pGL3-Basic (Promega)的萤火虫焚光素酶基因的上游而形成p9u,通过绿豆核酸外 切酶/人MIE启动子的上游除去石威基，用p9u制备截断的突变体。通过脂质转染法，用这些截断的突变体和海鳃荧光素酶表达质粒转 染Vero细胞，进行转染效率修正(phRL-SV40)。转染24小时后收集 细胞，加入细胞溶解液。接着，测定溶解产物中萤火虫焚光素酶和海鳃 荧光素酶的发光水平。为了修正转染效率，用萤火虫荧光素酶的发光水 平除以海鳃荧光素酶的发光水平。 1 ) 细胞用如下8种细胞系测定启动子活性。 (1 ) Vero细胞(来自猿猴肾脏) (2 ) HEL细胞(来自人胚胎成纤维细胞) (3 ) L929细胞(来自鼠科成纤维细胞) (4) 293细胞(来自人肾脏) (5 ) U373细胞(来自人神经胶质瘤) (6 ) THP-1纟田胞(来自人单核细胞) (7 ) SupTl纟田胞(来自人T细胞) (8 ) U937纟田胞(来自人单核细胞)(这些细胞可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)购买)。 2) 用于测定启动子活性的质粒为了测定启动子的活性，使用具有萤火虫荧光素酶基因的 pGL3-Basic (Promega)。该质粒不具有来自真核生物细力包的启动子序列 或增强子序列，将各种碱基序列导入到荧光素酶基因的上游，测定萸光 素酶的表达量，以测定所插入序列的启动子活性。3 )插入到pGL3-Basic中的启动子序列如下文所述，为了进行测定，使用HHV-6M正的启动子区、HHV-6 的U95基因的启动子区和HHV-6的立即早期基因启动子区以及HCMVMIE的启动子区域，它们存在于可购买得到的表达载体中。HHV-6的启动子区在进行PCR扩增并插入到pGL3-Basic中后被使用。 ，(1 ) 20u [其中插入HHV-6M正的启动子区(139381 — 140624: 1243bp) ] (SEQIDNO: 5)(2) 9u [其中插入HHV-6MIE的启动子区(139381 — 140427: 1046bp) ] (SEQIDNO: 6)(3) MIE[其中插入HHV-6MIE的启动子区(139457— 140211: 754bp ) ] ( SEQ ID NO: 7 )(4 )U95[其中插入HHV-6 U95基因的启动子区(141823 — 142578: 756bp) ] ( SEQIDNO: 8)(5) CMV[其中插入从购买得到的表达载体(pcDNA3.1)中切出 的HCMV MIE启动子750bp] ( SEQ ID NO: 9 )(6) MIE/3K [其中插入HHV-6M正的启动子区(139443 — 142578: 3136bp) ] (SEQIDNO: 10)(7) U95/3K [其中插入HHV-6MIE的启动子区(139443 — 142578: 3136bp) ] (SEQ ID NO: 11),用未插入碱基序列的pGL3-Basic作为 对照。此外，制备多种缺失变体。这些示意图在图5中给出。作为变体， 如图5制备如下产物。U)9u: 画1051到+ 1 (SEQIDNO: 5)(2 ) 9u-d2-7(3) 9u-dl-4(4) 9u-dl-5 (5 ) 9u-dl匿7 (6 ) 9u-d3-7 (7 ) 9u-d5 (8 ) 9u画d6 (9 ) 9u-d7 (10) 9u-d8:-814到+ 1 (SEQIDNO -574到+ 1 (SEQIDNO -427到+ 1 (SEQIDNO -350到+ 1 (SEQIDNO -276到+ 1 (SEQIDNO -240到+ 1 (SEQIDNO:17)18)19)20)21) 22)-212 to+1 (SEQ ID NO: 23) -116到+ l (SEQ ID NO: 24) -77到+ 1 (SEQ ID NO: 25)4)用质粒转染细胞采用脂质转染方法，用S叩erFect ( QIAGEN )进行转染。 为了修正转染效率，同时将(3-半乳糖苷酶表达质粒(pCH110:Pharmacia )导入到细胞中，并测定P-半乳糖苦酶活性。pCHl 10在SV40 早期启动子控制下表达P-半乳糖苷酶。
将pGL3构建体(8^1)和pCH110 (0.2^1)混合在一起，并往其中 加入Superfect试剂(8jal)来进行转染。
5) 测量荧光素酶活性
用荧光素酶分析系统(Promega)分析荧光素酶活性。 对pGL3构建体和pCH110进行共转染，48小时后收集细胞。用PBS 洗涤两次后，将细胞溶解在150 juL细月包溶解液中。往细月包溶解液上清 液(20 juL)中加入100juL荧光素酶底物溶液，30秒后，用照度计测 量发光度。
6) 测量卩-半乳糖苷酶活性
用p-gal报道系统(Clontech)测量|3-半乳糖苷酶活性。以与在荧光 素酶活性测量中相似的方式制备细胞溶解液，并往20juL细胞溶解液中 添加100 pL发光底物溶液，l小时后，用照度计测量发光度。
7) 在用TPA激活细胞的条件下测量启动子活性
用质粒转染Vero细胞和L929细胞，在24小时后，在TPA( 25ng/ml) 存在和不存在的条件下再培养24小时。此后，收集细胞，测量荧光素 酶活性和卩-半乳糖苷酶活性。 (结果)
1 ) HHV-6MIE区的启动子活性
HHV-6 MIE区的启动子活性以及HCMV MIE的启动子活性在上皮 黏着细l包和淋巴细胞中具有不同表现。
(1 )在黏着细胞中的启动子活性的比较(图1 )
在黏着细胞中，HHV-6MIE的启动子序列的活性^氐于HCMV,具有 一些启动子活性。U95启动子和HHV-6立即早期基因的启动子的活性很 低。另一方面，在黏着细胞中，HCMVMIE启动子的活性比HHV-6M正 启动子的活性约高10 ~ 50倍。特别地，在HEL细胞和U373细胞，HCMV 能够繁殖的细胞中，它显示了强有力的活性。
至于HHV-6 MIE区的启动子活性，那些长0.7kb - 1.2 kb的启动子 区域的活性基本上相同，但是一般认为3kb序列的活性有所下降。 (2)在淋巴细胞中的启动子活性的比较(图2)
HHV-6能够在淋巴细胞中繁殖，在淋巴细胞中，HHV-6 M正区的启动子活性比HCMV约高10倍。特别地，HHV-6 MIE区在THP-1和 U937中具有强有力的活性，这些细l包属于单核的巨噬细月包系。HCMV MIE启动子在淋巴细胞中不具有如此强大的活性。
当启动子区长0.7kb 1.2kb时，HHV-6 M正区的启动子活性升高， 然而，当长度为3kb时，其启动子活性降低。
2) 当采用具有TPA的细胞激发时，HHV-6 M正区的启动子活性 (图3和4 )
采用12-0-十四酰佛波醇13-醋酸盐(TPA)激活Vero细胞，来测量 HHV-6 MIE的启动子活性，所有的启动子活性升高，并且显示出与 HCMVMIE启动子基本上相同的活性(图3)。
然而，在L929细胞中，用TPA激活细胞也没有7见察到启动子活性 升高(图4)。 一般认为这是由于不同类型细胞对TPA的反应存在差别。
在Vero细胞中， 一般认为TPA通过诱导产生大量不同的转录活化 因子，从而提高HHV-6 MIE启动子活性。也就是说，HHV-6MIE启动 子的最大活性与HCMV MIE启动子一样。因此，已经证明了本发明的 启动子的特异性和选择性。
如此，在本发明中，在黏着细胞如Vero细胞、HEL细胞、L929细 胞、293细胞、U373细胞中，CMV启动子的活性比HHV-6高IO倍(图 1)。然而，在来自人淋巴细胞的细胞，例如THP-1细胞、SupTl细胞、 U938细胞中，HHV-6启动子的活性是CMV启动子活性的数倍，并且 还发现，启动子越短活性越大。
已经证明了 HHV-6的启动子是有前景的，并且根据这些结果，可 以理解，这些启动子可被用于DNA疫苗中(腮腺炎疫苗)，并且极具 前景。
用HCMV IE启动子作为对照，在荧光素酶表达系统中比较研究本 发明人克隆的HHV-6BMIE启动子的活性。结果，在黏着细胞如293细 胞、Vero细胞等中，HHV-6MIE启动子的活性约为HCMHE启动子活性 的十分之一。然而，在淋巴细胞例如SupTl和U937等中，HHV-6MIE 启动子的表达效率高数倍。采用将JEV cDNA连接到本发明启动子下游 的p9u/JEVenv，来分析JEV的外膜糖蛋白的表达，在转染48小时后在 任何黏着细胞或者平滑的淋巴细胞中未检测到JEV蛋白质的表达。
另一方面，在使用HCMV的IE启动子的pCDNA3.1/JEVenv中，证实了存在JEV蛋白质的表达。
而且在JEV感染的Vero细胞中，其作为阳性对照，很容易地检测 到外膜糖蛋白。为了分析其中原因，用GFP蛋白质表达质粒来验证转染 效率。结果，其在S叩T1细胞中的导入效率低至0.1%或更低，然而， 293细胞和Vero细胞分别具有45 %和20 %的较高的导入效率。在淋巴 细胞中，所克隆的HHV-6 MIE启动子的表达活性比HCMV MIE启动子 高数倍。然而，被表达的基因转化为JEV的外膜糖蛋白时，不能检测到 其活性。
有意思的是，在淋巴细胞中，本发明克隆的HHV-6 MIE启动子的 表达活性比HCMV-IE启动子高数倍。然而，当将被表达的基因从报道 基因转化为JEV的外膜糖蛋白时，未检测到活性，这是不可预期的。因 此，其中原因可能是所表达的JEV蛋白质以反馈的方式起作用，从而以 相反的方式抑制该启动子活性，或者可能是所表达的抗原在这些细胞中 不稳定。
本实施例4皮总结如下
1) 在淋巴细胞中，特別是在单核细胞/巨噬细胞中，HHV-6MIE启 动子活性比HCMVMIE启动子约高10倍。
2) 在上皮黏着细胞，HHV6M正启动子活性约为HCMVMIE启动 子活性的十分之一。
3) 在诱导产生大量不同的转录因子的情况下，HHV-6M正启动子 具有与HCMVMIE启动子相同的活性。
如上所述，在本实施例中，那些在HHV-6B的主要立即早期(MIE) 基因上游插入约12kbp (6MIEP)和在pGL3Basic载体(Promega)的 荧光素酶基因插入约700 bp U95基因(6U95)的构建体被使用。与常 规启动子比较，为了研究这些正启动子应用于DNA疫苗中的可能性， 使用血细胞系细胞，与人细胞巨化病毒(HCMV) IE增强子-启动子 (CMVP)进行活性比较。在本实施例中，证明了人疱瘆病毒6B (HHV-6B)所编码的立即早期(IE)启动子在血细胞系细胞中具有极 高度的活性。
4) 此外，如图7中所描述的，研究了各个片段的活性，并且至少 起始位点上游的-572到-427,特别是-1051到-427具有启动子活性，并 优选具有增强子活性。-417到+ 1部分对于启动子活性来说似乎是必需的，而增强子活性对于保证特异性似乎是必需的。发挥增强子活性的部 分包括NF-KB和AP-1基序。因此，具有这些基序是重要的，以在淋巴 细胞中体现出特异性。
(实施例2:HHV-7的MIE启动子和U95启动子) 接着，实施涉及来自HHV-7的启动子的实验。
对HHV-7的两种立即早期启动子(7MIEP、7U95P)的活性与细月包 巨化病毒(CMV)启动子以及HHV-6IE启动子(9U和U95)的活性进 行比4交。比较方法如下将各个启动子区插入到pGL3-Basic载体 (Promega)的焚光素酶基因的上游，用该载体转染各个细胞，以焚光 素酶活性作为参照，比较启动子的活性。为了研究各个启动子上游的 R2区的作用，制备了多种缺失变体以测量启动子活性。 (概述)
作为一种报道质粒，将分别来自HHV-7的M正和u95基因的约500 bp片段(7MIEP和7U95P )插入到pGL3Basic载体(Promega)的荧光 素酶基因的上游，用于本实施例中。
用脂质转染法，将报道质粒导入到T细胞系(Jurkat、Molt-3、 SupT-l)、骨髓细胞系(SAS-413)中，用电穿孔法将净艮道质粒导入到 外周血单核细胞(PBMC)中，来测量焚光素酶活性。结果，与HCMV MIE启动子相比，在T细J包系中，HHV-7M正启动子和HHV-7U95启 动子的活性比HCMVMIE启动子高数倍，而在SAS-413细胞中，HCMV M正启动子的活性高十倍以上。在对三批PBMC实施导入的实验中， HHV-7MIE启动子和HHV-7U95启动子的活性较低。与HHV-6 IE启 动子(9U和U95)相比，HHV-7的两种启动子在^f壬^T细i包种类中的活 性都较低。此外，在使用HHV7MIE启动子和HHV7U95启动子的缺失 变体的实验中，尽管在不同细胞类型之间存在差别，R2对这两种启动 子起主要的增强子活性。在本实施例中，已经证明，人疱渗病毒7 (HHV-7)所编码的立即早期(IE)启动子在血细胞系细胞中具有极高 度活性。
下文将详细描述材库牛与方法。 (材料与方法)
1 ) 细胞
如下五种细^^用于测定启动子活性。(1 ) Jurkat细胞(来自人T细胞) (2 ) Molt-3细胞(来自人T细胞)(3) S叩T1细胞(来自人T细胞)(4) SAS-413细胞(来自人骨髓细胞)(5) 外周血单核细胞(PBMC) 2)用于测定启动子活性的质粒用具有萤火虫荧光素酶基因的pGL3 Basic (Promega)测量启动子 活性。3 )插入pGL3 Basic中的启动子序列通过PCR扩增约500bp的HHV-7的MIE基因的启动子区(7MIEP ) 和HHV-7的U95基因的启动子区(U95P),并制备它们的缺失变体。 图8对这些启动子进行示意性说明。(1 ) 7M正P (-493 )[插入了距离HHV-7 MIE基因的转录起始位 点上游493pb到下游22bp] ( SEQ ID NO: 26 )(2) 7MIEP (-388 )[插入了距离HHV-7 MIE基因转录起始位点上 游388pb到下游22bp] (SEQIDNO: 27)(3) 7MIEP (-233 )[插入了距离HHV-7 MIE基因转录起始位点上 游233pb到下游22bp] (SEQIDNO: 28)(4) 7U95P (-484)[插入了距离HHV-7 U95基因转录起始位点上 游484pb到下游16bp] (SEQIDNO: 29)(5) 7U95P (-379)[插入了距离HHV-7 U95基因转录起始位点上 游379pb到下游16bp] (SEQIDNO: 30)(6) 7U95P (-304)[插入了距离HHV-7 U95基因转录起始位点上 游304pb到下游16bp] (SEQIDNO: 31)用无启动子序列的pGL3 Basic作为对照。 4)用质粒转染细胞用Lipofectamine 2000 (Invitrogen ) , 7于Jurkat细月包、Molt-3细月包、 SupTl细月包和SAS-413细l包进4亍脂质转染，用Nucleofector ( amaxa) 对PBMC进4亍电穿孔。为了修正转染效率，同时将海鳃焚光素酶表达质粒(pRL-TK, Promega)导入细胞中，并测定海鳃荧光素酶活性。pRL-TK在单纯疱渗 病毒胸苷激酶(TK)启动子的控制下表达海鳃荧光素酶。pGL3报道子(1.2昭)和pRL-TK ( 50 ng )混合在一起，往其中加 入2^1 Lipofectamine 2000来实施转染。 5)测量荧光素酶活性
为了测量荧光素酶活性，使用双荧光素酶报道分析系统(Promega )。 转染16小时后，收集细胞，并溶解在细胞溶解液(lOO)il)中。往 5|il细月包溶解液上清液中加入萤火虫焚光素酶底物溶液(25^1),随后 立即用照度计测量发光度。接着，在测量后往样本中加入海鳃荧光素酶 底物溶液(25iul)，随后立即用照度计测量发光度。 (结果)
1 ) HHV-7 MIE启动子区的活性
使用四种细胞系的实验结果表明，当与CMV启动子的活性比较时， 7MIEP (-493 )在Molt-3细胞和SuptTl细胞中具有约高6~7倍的活 性，在Jurkat细胞中具有类似活性，在SAS-413细月包中只有约1/11的活 性。而且当与HHV-6 IE启动子(9U和U95)比丰交时，7MIEP (-493 ) 在所有类型细胞中的活性都较低(图9)。
4吏用三批PBMC的实'验结果表明，7MIEP (-493 )的活性与CMV 启动子和9U的活性相似或者略低，与HHV-6 U95的活性类似或略高(图 10)。
2) HHV-7U95启动子区的活性
使用四种细胞系的实验结果表明，当与CMV启动子的活性比较时， 7U95P (-484)的活性在Jurkat细胞中约高2.5倍，在Molt-3细胞中约 高4倍，在SupT细胞中约高20倍，而在SAS-413细胞中约为1/8。而 且当与HHV-6 IE启动子(9U和U95 )比较时，U95P (-484 )在SupTl 中的活性略高于U95,但是约为9U活性的1/2, U95P (-484)在其他细 胞中的活性较低(图9)。
在使用三批PBMC的实验中，7U95P (-494)的活性仅约为其他启 动子活性的1/2 ~ 1/4 (图10)。
3) R2区对启动子活性的影响
将7MIEP和7U95P的各个缺失突变体导入4种细月包系的实-险结果 已经说明，删除R2是否会降低启动子活性取决于细胞的类型。特别地， 在Jurkat细胞中，删除R2区对7M正P的活性没有影响，但是在其他细 胞系中，删除R2区会使7MIEP的活性降低约1/5 ~ 1/2。而且在SAS-413细胞中，删除R2对7U95P的活性没有影响，但是在其他细胞系中，删 除R2区会使7U95P的活性降低约1/7 ~ 1/2 (图11 )。 (总结) 将本实施例总结如下
1 ) 7MIEP (-493 )和7U95P (-494 ) 在T细胞系中通常具有高于 CMV启动子的活性，但是在骨髓细胞系SAS-413细胞中的活性较低。 在PBMC中，7M正PO (-493 )的活性与CMV启动子基本上相同，而 7U95P (-494 )的活性4氐于CMV启动子。
2) 与HHV-6 IE启动子相比，HHV-6的两种IE启动子(9U和U95 ) 在所有类型细胞中的活性高于7MIEP (-493 )和7U95 (-494)。
3) 已经证明，在大量细胞中，R2区对7MIEP和7U95P起增强子 的作用。与R2区结合的转录因子还未被确定，但是鉴于HHV-6的R3 区結合NF-kB,其起到U95启动子的增强子的作用等事实，以重复方式 存在于R2区中的NF-kB结合基序极有可能导致R2区具有增强子活性
(图8)。
(实施例3:特定缺失系统的构建)
用IE启动子和RNAi法，破坏血细胞系细胞中的基因表达。由于IE 启动子能够在血细胞系细胞中大量表达，这对于分析来说是十分有利的。
1 )细胞的准备(在为巨噬细胞的情形下)
获取健康人的外周血，并用菲可/泛影葡胺，通过密度梯度离心来进 行分离和纯化。在添加了 M-CSF (研发系统，100U/ml)的AIM V血清 培养基(Life Technologies )中培养PBMC。每3天换液1次，第6天或 第7天的巨噬细胞用于实^r。
2 ) 制备siRNA表达逆转录病毒载体
为了表达发夹型RNA,制备包含"有义链靶序列"、"环序列"、 "反义链靶序列"和"终止子序列"的合成寡-DNA。这种有义链靶序 列、环序列、反义链耙序列和终止子序列用本领域熟知的方法来制备。 本领域技术人员能够容易地理解，当真正使用这些序列时，能够根据实 际情形采用适当的序列。
将上述DNA插入到质粒载体中，其中寡-DNA连接到IE序列、gag、 pol和env的下游，gag、 pol和env是逆4i录病毒复制所必需的，还包招「能够利用限制性酶序列的NeoK基因等。将所制备的质粒载体(10pl)添 加到100^1感受态细胞中，进行转染，铺到LBAmp平板上后，在37。C 下培养16小时。在37"C下，通过转化获得的克隆在LBApm液体培养 基中培养16小时，用常规方法从培养液中提取和纯化质粒。
将表达gag、po1和env的逆转录病毒包装细胞铺到直径10 cm圆盘 上，添加转染试剂来转染质粒(IO吗)。24-48小时后，将细胞限制性 稀释到含有G418的培养基(500昭/ml)中并传代。
每3 4天，对G418培养基进行换液，总共培养约2周。收集克隆， 当在6孔平板上生长到汇合水平时，将培养基换成无G418的培养基， 24小时后收集上清液。将细胞存储。
对包含在上清液中的逆转录病毒载体进行限制性稀释，感染 NIH/3T3细胞，计数生长的克隆来计算感染的效价。
3)使用逆转录病毒载体的基因导入实验
用逆转录病毒载体来感染血细胞系细胞，例如1)中制备的巨噬细 胞。洗涤后立即进行铺板，在平板上形成0.5 2.5x 1(^细胞/cm2。感染 后24小时，将培养基换成含有G418的培养基，每3 ~4天换液一次。 约2周后，获得导入基因的细胞。用该细胞来验证期望被敲除的基因的 表达水平。
实施这些实^r,实际上证明了在导入基因后，用本发明的启动子能 够破坏外源基因在淋巴细胞中的特异性表达。 (实施例4:特异性表达)
替代实施例3的RNAi,导入期望被表达的编码基因的核酸分子(例 如，细胞因子例如TGFp)
通过实施与实施例3相似的实验，结果证明，在导入基因后，本发
如上所述，通过优选的具体实施方式
对本发明进行阐述。然而，应 当理解，本发明的保护范围仅由附随的权利要求书来解释。还应当理解， 本文引用的专利、专利申请和文献应当结合进来作为参考，如同其在本 文中完全列出。对于本领域技术人员来说，在不背离本发明的保护范围 和精神的情况下，各种其他改进是显然的，也是容易实施的。因此，附 随的权利要求书的保护范围不限于说明书的描述，权利要求书应被宽泛 地解释。[工业实用性]
本发明提供在免疫反应细胞例如T淋巴细胞中选择性地诱导蛋白 质表达到启动子。本发明的启动子在用于有效阻止或处理免疫疾病如 获得性免疫缺陷综合征等的方法和药物中是有用的。本发明在用于有效 实施基因治疗的方法中也是有用的。
权利要求
1.HHV6B的MIE启动子。
2. 按照权利要求1的启动子，其至少包含SEQIDNO: 1中所示的 序列中的8个毗邻的核苦酸。
3. 按照权利要求l的启动子，其至少包含SEQIDNO: 1中所示的 序列中的R3区或其功能性变体。
4. 4姿照权利要求1的启动子，其至少包含距离SEQIDNO: 1的转 录起始点-574到-427的序列(SEQIDNO: 13)。
5. 按照权利要求1的启动子，其至少包含距离SEQIDNO: 1的转 录起始点陽1051到-427的序列(SEQIDNO: 14)。
6. 按照权利要求1的启动子，其包含NF-kB的基序和AP-1的基序。
7. 按照权利要求1的启动子，其包含SEQIDNO: 1中所示的序列。
8. 按照权利要求l的启动子，其中所述启动子包含(a)具有SEQ ID NO: 1中所示的碱基序列或者与之对应的碱基序列或其序列片段的 多核苷酸；(b)SEQIDNO: 1中所示的碱基序列或者与之对应的碱基 序列的等位基因变体或其序列片段的多核苷酸；(c)与(a)或(b) 中的任何一种的多核苷酸杂交并且具有其一种生物活性的多核苷酸；或 者(d)由(a) - (c)中的任何一种的碱基序列或者具有至少70%同 一性的互补序列组成并且具有其一种生物活性的多核香酸。
9. 按照权利要求l的启动子，其长度至少为IO个毗邻的核苷酸。
10. 按照权利要求8的启动子，其中所述的生物活性是启动子活性。
11. 一种包含按照权利要求1的启动子的核酸构建体。
12. 按照权利要求11的核酸构建体，其包含编码外源基因的序列， 其最初与该启动子不相关但是现在,皮可操作地连接到启动子序列上。
13. 按照权利要求12的核酸构建体，其中所述的外源基因编码RN A i 分子、药物、将被删除的隐性基因或者选择性标记。
14. 按照权利要求13的核酸构建体，其中选择性标记允许在培养 基中选择其中导入了所述核酸构建体的宿主。
15. :疾照权利要求13的核酸构建体，其中选4奪性标记允许从^L觉 上选择导入所述核酸构建体的宿主。
16. 按照权利要求13的核酸构建体，其中选择性标记包含次黄噤呤鸟噪呤磷酸核糖基转移酶(hprt)或者一种选自由绿色焚光蛋白(GFP)、兰绿色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光 蛋白(dsRed)组成的组的焚光标i己。
17. 按照权利要求13的核酸构建体，其中选择性标记对其中导入 了核酸构建体的宿主基本上不具有毒性。
18. 按照权利要求13的核酸构建体，其中将被删除的隐性基因选 自由ADA基因、PNP基因、yc链基因、TAP基因、MHCII基因、X-连接的WASP、 CD40配体、PI3K样基因和DNA解旋酶组成的组。
19. 按照权利要求13的核酸构建体，其中所述药物选自由细胞因 子、趋化因子、生长因子、蛋白激素和肽激素组成的组。
20. 按照权利要求12的核酸构建体，其中所述启动子在血细胞系 细胞，特别是T细胞中诱导外源基因的特异性表达。
21. —种包含按照权利要求11的核酸构建体的表达载体。
22. —种包含按照权利要求11的核酸构建体的细胞。
23. 按照权利要求22的细胞，其中所述细胞对于所述启动子序列 来说是异源的。
24. —种包含按照权利要求11的核酸构建体的组织。
25. —种包含按照权利要求11的核酸构建体的器官。
26. —种包含按照权利要求11的核酸构建体的生物体。
27. —种药物组合物，其包含按照权利要求1的启动子和编码一种 抗原的序列。
28. 按照权利要求27的药物组合物，其是DNA疫苗。
29. —种用于治疗期望进行淋巴细胞特异性治疗的疾病、异常或症 状的药物组合物，其包含按照权利要求1的启动子以及用于所述治疗的核酸序列。
30. 按照权利要求29的药物组合物，其中用于所述治疗的核酸序 列包含选自由编码细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白激素、肽激素、 核酶和RNAi。
31. 用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的方法，包括步骤 A)制备一种核酸构建体，其中按照权利要求1的启动子被可操作地连接到编码蛋白质的核酸序列上；和B )将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸序列表达的条件下。
32. 用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的试剂盒，包含A) —种核酸构建体，其中按照权利要求1的启动子被可操作地连 接到编码蛋白质的核酸序列上；和B) 用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。
33. 用于以淋巴细胞特异性方式地表达一种蛋白质的试剂盒，包含A) 按照权利要求1的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。
34. 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白 的疾病、异常或症状的方法，包括步骤A) 制备其中按照权利要求1的启动子被连接到编码蛋白质的核酸 序列上的核酸构建体；和B) 将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。
35. 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白 的疾病、异常或症状的试剂盒，包含A) 其中按照权利要求1的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列 上的核酸构建体；和B) 用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。
36. 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白 的疾病、异常或症状的试剂盒，包含A) 按照权利要求1的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。
37. —种制备蛋白质的方法，包括步骤A) 制备其中按照权利要求1的启动子被连接到编码蛋白质的核酸 序列上的核酸构建体；和B) 将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。
38. 用于制备蛋白质的试剂盒，包含A) 其中按照权利要求1的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列 上的核酸构建体；和B) 用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。
39. 用于制备蛋白质的试剂盒，包含A) 按照权利要求1的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。
40. 按照权利要求1的启动子的用途，用于制造一种用于治疗或预 防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白的疾病、异常或症状的 药物组合物。
41. HHV7的MIE启动子。
42. 按照权利要求41的启动子，其至少包含SEQIDNO: 2中所示 的序列中的8个毗邻的核苷酸。
43. 按照权利要求41的启动子，其至少包含SEQIDNO: 2中所示 的序列中的R2区或其功能性变体。
44. 按照权利要求41的启动子，其至少包含SEQIDNO: 2的+22 到-233的序列。
45. 按照权利要求41的启动子，其至少包含SEQIDNO: 2的+22 到-388的序列。
46. 4妄照权利要求41的启动子，其包含存在于R2区中的NF-kB 的基序。
47. 按照权利要求41的启动子，其包含SEQIDNO: 15中所示的序列。
48. 按照权利要求41的启动子，其中所述启动子包含(a) 具有SEQIDNO: 2中所示的碱基序列或者与之对应的碱基序 列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQIDNO: 2中所示的碱基序列或者与之对应的碱基序列的 等位基因变体或其序列片段的多核苷酸；(c) 与(a)或(b)中的任何一种的多核苷酸杂交并且具有其生 物活性的多核苷酸；或者(d)由(a) - (c)中的任何一种的碱基序列或者具有至少70% 同一性的互补序列组成并且具有其生物活性的多核香酸。
49. 按照权利要求41的启动子，其长度至少为IO个毗邻的核苷酸。
50. 按照权利要求48的启动子，其中所述的生物活性是启动子活性。
51. —种包含按照权利要求41的启动子的核酸构建体。
52. 按照权利要求51的核酸构建体，其包含编码外源基因的序列， 其该外源基因最初与该启动子不相关但是现在被可操作地连接到启动 子序列上。
53. 按照权利要求52的核酸构建体，其中所述外源基因编码RNAi 分子、药物、将被删除的隐性基因或者选择性标记。
54. 按照权利要求53的核酸构建体，其中选择性标记允许在培养 基中选择其中导入了该核酸构建体的宿主。
55. 按照权利要求53的核酸构建体，其中选择性标记允许从视觉 上选择其中导入了该核酸构建体的宿主。
56. 按照权利要求53的核酸构建体，其中选择性标记包含次黄噤 呤鸟噤呤磷酸核糖基转移酶(hprt)或者一种选自由绿色荧光蛋白(GFP)、兰绿色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光 蛋白(dsRed)组成的组的焚光标记。
57. 按照权利要求53的核酸构建体，其中选择性标记对其中导入 了核酸构建体的宿主基本上不具有毒性。
58. 按照权利要求53的核酸构建体，其中将被删除的隐性基因选 自由ADA基因、PNP基因、yc链基因、TAP基因、MHCII基因、X-连接WASP、 CD40配体、PI3K样基因和DNA解旋酶组成的组。
59. 按照权利要求53的核酸构建体，其中药物选自由细胞因子、 趋化因子、生长因子、蛋白激素和肽激素组成的组。
60. 按照权利要求52的核酸构建体，其中所述启动子在血细胞系 细胞，特别是T细胞中诱导外源基因的特异性表达。
61. —种包含按照权利要求51的核酸构建体的表达载体。
62. —种包含按照权利要求51的核酸构建体的细胞。
63. 按照权利要求62的细胞，其中所述细胞对于所述启动子序列 来说是异源的。
64. —种包含按照权利要求51的核酸构建体的组织。
65. —种包含按照权利要求51的核酸构建体的器官。
66. —种包含按照权利要求51的核酸构建体的生物体。
67. —种药物组合物，其包含按照权利要求41的启动子和编码一 种抗原的序列。
68. 按照权利要求67的药物组合物，其是DNA疫苗。
69. —种用于治疗其中期望进行淋巴细胞特异性治疗的疾病、异常 或症状的药物组合物，其包含按照权利要求41的启动子以及用于该治 疗的核酸序列。
70. 按照权利要求69的药物组合物，其中用于所述治疗的核酸序 列包含选自由编码细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白激素、肽激素、 核酶和RNAi的那些序列组成的组的序列。
71. 用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的方法，包括步骤A) 制备一种核酸构建体，其中按照权利要求41的启动子被可操作 地连接到编码蛋白质的核酸序列上；和B) 将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。
72. 用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的试剂盒，包含A) —种核酸构建体，其中按照权利要求41的启动子被可操作地连 接到编码蛋白质的核酸序列上；和B) 用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。
73. 用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的试剂盒，包含A) 按照权利要求41的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。
74. 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白 的疾病、异常或症状的方法，包括步骤A )制备其中按照权利要求41的启动子被连接到编码蛋白质的核酸 序列上的核酸构建体；和B)将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。
75. 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白 的疾病、异常或症状的试剂盒，包含A )其中按照权利要求41的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列 上的核酸构建体；和B)用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。
76. 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白 的疾病、异常或症状的试剂盒，包含A) 按照权利要求41的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。
77. —种制备蛋白质的方法，包括步骤A )制备其中按照权利要求41的启动子被连接到编码蛋白质的核酸 序列上的核酸构建体；和B)将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。
78. 用于制备蛋白质的试剂盒，包含A) 其中按照权利要求41的启动子一皮连接到编码蛋白质的核酸序列 上的核酸构建体；和B) 用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。
79. 用于制备蛋白质的试剂盒，包含A) 按照权利要求41的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。
80. 按照权利要求41的启动子的用途，用于制造一种用于治疗或 预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白的疾病、异常或症状 的药物组合物。
81. HHV7的U95启动子。
82. 按照权利要求81的启动子，其至少包含SEQIDNO: 12中所 示的序列中的8个毗邻的核苷酸。
83. 按照权利要求81的启动子，其至少包含SEQIDNO: 12中所示的序列中的R2区或其功能性变体。
84. 按照权利要求81的启动子，其至少包含SEQIDNO: 12的+ 16 到-233的序列。
85. 按照权利要求81的启动子，其至少包含SEQIDNO: 12的+ 16 到-379的序列。
86. 4要照权利要求81的启动子，其包含存在于R2区中的NF-kB的基序。
87. 按照权利要求81的启动子，其包含SEQIDNO: 16中所示的序列。
88. 按照权利要求81的启动子，其中所述启动子包含(a) 具有SEQIDNO: 12中所示的碱基序列或者与之对应的碱基 序列或其序列片段的多核苷酸；(b) SEQ ID NO: 12中所示的碱基序列或者与之对应的碱基序列 的等位基因变体或其序列片段的多核苷酸；(c) 与(a)或(b)中的任何一种的多核苷酸杂交并且具有其一 种生物活性的多核苷酸；或者(d) 由(a) -(c)中的任何一种的碱基序列或者具有至少70% 同一性的互补序列组成并且具有其一种生物活性的多核苷酸。
89. 按照权利要求81的启动子，其长度至少为IO个毗邻的核苷酸。
90. 按照权利要求88的启动子，其中所述生物活性是启动子活性。
91. 一种包含按照权利要求81的启动子的核酸构建体。
92. 按照权利要求91的核酸构建体，其包含编码外源基因的序列， 其与该启动子不相关但是^L可操作地连接到启动子序列上。
93. 按照权利要求92的核酸构建体，其中所述外源基因编码RNAi 分子、药物、将被删除的隐性基因或者选择性标记。
94. 按照权利要求93的核酸构建体，其中选择性标记允许在培养 基中选择其中导入了该核酸构建体的宿主。
95. 按照权利要求93的核酸构建体，其中选择性标记允许从视觉 上选择其中导入了该核酸构建体的宿主。
96. 按照权利要求93的核酸构建体，其中选择性标记包含次黄噤 呤鸟噤呤磷酸核糖基转移酶(hprt)或者一种选自由绿色荧光蛋白(GFP)、兰绿色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光蛋白(dsRed)组成的组的荧光标记。
97. 按照权利要求93的核酸构建体，其中选择性标记对其中导入 了核酸构建体的宿主基本上不具有毒性。
98. 按照权利要求93的核酸构建体，其中将^皮删除的隐性基因选 自由ADA基因、PNP基因、yc链基因、TAP基因、固CII基因、X-连接的WASP、 CD40配体、PI3K样基因和DNA解旋酶组成的组。
99. 按照权利要求93的核酸构建体，其中药物选自由细胞因子、 趋化因子、生长因子、蛋白激素和肽激素组成的组。
100. 按照权利要求92的核酸构建体，其中所述启动子在血细胞系 细胞，特别是T细胞中诱导外源基因的特异性表达。
101. —种包含按照权利要求91的核酸构建体的表达载体。
102. —种包含按照权利要求91的核酸构建体的细胞。
103. 按照权利要求102的细胞，其中所述细胞对于所述启动子序 列来说是异源的。
104. —种包含按照权利要求91的核酸构建体的组织。
105. —种包含按照权利要求91的核酸构建体的器官。
106. —种包含按照权利要求91的核酸构建体的生物体。
107. —种药物组合物，其包含按照权利要求81的启动子和编码一 种抗原的序列。
108. 按照权利要求107的药物组合物，其是DNA疫苗。
109. —种用于治疗其中期望进行淋巴细胞特异性治疗的疾病、异 常或症状的药物组合物，其包含按照权利要求81的启动子以及用于所 述治疗的核酸序列。
110. 按照权利要求109的药物组合物，其中用于所述治疗的核酸 序列包含选自由编码细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白激素、肽激 素、核酶和RNAi的那些序列组成的组的序列。
111. 用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的方法，包括步骤A) 制备一种核酸构建体，其中按照权利要求81的启动子被可操作 地连接到编码蛋白质的核酸序列上；和B) 将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。
112. 用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的试剂盒，包含A) —种核酸构建体，其中按照权利要求81的启动子被可操作地连 接到编码蛋白质的核酸序列上；和B) 用于将核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核 酸序列表达的条件下的工具。
113. 用于以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白质的试剂盒，包含A) 按照权利要求81的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。
114. 用于治疗或预防 一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋 白的疾病、异常或症状的方法，包括步骤A)制备其中按照权利要求81的启动子被连接到编码蛋白质的核酸 序列上的核酸构建体；和B )将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的核酸 序列表达的条件下。
115. 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋 白的疾病、异常或症状的试剂盒，包含A) 其中按照权利要求81的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列 上的核酸构建体；和B) 用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。
116. 用于治疗或预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋 白的疾病、异常或症状的试剂盒，包含A) 按照权利要求81的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。 〈
117. —种制备蛋白质的方法，包括步骤A) 制备其中按照权利要求81的启动子被连接到编码蛋白质的核酸 序列上的核酸构建体；和B) 将该核酸构建体放置在其中该启动子诱导编码蛋白质的核酸序 列表达的条件下。
118. 用于制备蛋白质的试剂盒，包含A) 其中按照权利要求81的启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列 上的核酸构建体；和B) 用于将该核酸构建体放置在其中所述启动子诱导编码蛋白质的 核酸序列表达的条件下的工具。
119. 用于制备蛋白质的试剂盒，包含A) 按照权利要求81的启动子；和B) 用于制备其中所述启动子被连接到编码蛋白质的核酸序列上的 核酸构建体的工具。
120. 按照权利要求81的启动子的用途，用于制造一种用于治疗或 预防一种需要以淋巴细胞特异性方式表达一种蛋白的疾病、异常或症状 的药物纟且合物。
全文摘要
本发明提供一种启动子，其在免疫系统细胞和/或血细胞，如淋巴细胞中选择性地有效诱导基因表达。在本发明中，通过发现在免疫系统细胞和/或血细胞，如T淋巴细胞中，HHV6 MIE启动子、HHV7 MIE启动子和HHV7 U95启动子出乎意外地诱导特性的基因表达，从而实现发明目的。利用这些启动子，能够实现选择性地递送DNA疫苗等。
文档编号C12N1/19GK101300350SQ200680041278
公开日2008年11月5日 申请日期2006年9月5日 优先权日2005年9月8日
发明者五味康行, 山西弘一, 森康子, 武本真清, 福家功, 高桥理明 申请人:财团法人阪大微生物病研究会