细胞培养用振荡装置以及细胞培养方法的振荡培养方法

专利名称：细胞培养用振荡装置以及细胞培养方法的振荡培养方法
技术领域：
本发明涉及用于促进培养容器内的细胞的培养的细胞培养用振荡装置 以及细胞培养方法的振荡培养方法。
背景技术：
以往，细胞培养、特别是免疫细胞疗法中使用的悬浮细胞的细胞培养几 乎都是通过人工操作来实施的。例如，将取自患者的细胞与培养基一起接种 到附着有抗体(诱导因子)的烧瓶中，并收容到恒温槽内，每天将该烧瓶从 恒温槽中取出，用显微镜等观察培养状况(例如，增殖状况)，确认增殖等。 此时，从细胞接种开始经过规定时间后，向上述烧瓶添加培养基来培养细胞 (例如增殖)。此外，在获得大量细胞时，还需要从烧瓶转移到培养袋中进 行培养。
在上述烧瓶或袋中培养时，所述细胞培养方法包括将培养容器静置的静 置培养和通过摇动例如载置有该培养容器的载置台等的振荡培养。
专利文献1:特开2001-275659号公报
但是，在细胞的静置培养中，细胞的分布以及培养基的成分浓度不均一， 从而培养环境难以控制，此外，与振荡培养相比供氧能力差，因此难以最大 程度地诱导细胞的增殖。另外，在振荡培养中，培养容器内的细胞由于振荡 培养容器的摇动，使得细胞在培养面上转动，从而存在细胞的物理损害很大
的问题。

发明内容
考虑到上述情况，本发明的目的是提供细胞培养用振荡装置以及细胞培养方法的振荡培养方法，该装置以及方法能防止对细胞的物理损害且能提高 细胞的培养性，也就是说，通过使细胞的分布以及培养基的成分浓度处于均 一的状态，使得培养环境容易控制，而且供氧能力也提高，从而能促进细胞 的增殖。
第一方面记载的发明涉及的细胞培养用振荡装置的特征在于，该装置具 有按压设备，所述按压设备是当在收容己接种有细胞的培养液的柔性的培养 容器内培养细胞时，反复按压上述培养容器；通过该按压设备的按压来搅拌
上述培养容器内的培养液。
根据第一方面所述的发明，第二方面记载的发明涉及的细胞培养用振荡 装置的特征在于，上述按压设备具有多个突出部，并由这些突出部按压培养 容器。
根据第一方面或第二方面所述的发明，第三方面记载的发明涉及的细胞 培养用振荡装置的特征在于，上述细胞为悬浮细胞。
根据第一方面至第三方面中任意一项所述的发明，第四方面记载的发明 涉及的细胞培养用振荡装置的特征在于，上述细胞用于免疫细胞疗法。
第五方面记载的发明涉及的细胞培养方法的振荡培养方法，其特征在 于，该细胞培养方法是在收容已接种有细胞的培养液的柔性的培养容器内培 养细胞，该方法通过按压设备反复按压上述培养容器，搅拌该培养容器内的 培养液，进行细胞培养。
根据第五方面所述的发明，第六方面记载的发明涉及的细胞培养方法的 振荡培养方法的特征在于，上述细胞为悬浮细胞。
根据第五方面或第六方面所述的发明，第七方面记载的发明涉及的细胞 培养方法的振荡培养方法的特征在于，上述细胞用于免疫细胞疗法。
根据第一方面至第七方面所述的发明，将收容己接种有细胞的培养液的 柔性培养容器通过按压设备反复按压，将该培养容器内的培养液进行搅拌，也就是说，通过使细胞的分布以及培养基的成分浓度处于均一的状态，使得 培养环境容易控制，而且供氧能力也提高，从而能促进细胞的增殖，可以提 高细胞的培养效率。此外，细胞只是浮游在被按压设备反复按压来进行搅拌 的培养液内，因此能够防止受到物理损害。


图1是表示应用了本发明涉及的细胞培养用振荡装置中的第1种实施方
式的细胞培养装置的结构图2是表示图1的恒温槽的立体图3是表示收容在恒温槽的罐中的培养盒的立体图4是分别表示图3的培养袋盘、培养基盒以及细胞接种盒的立体图5是表示由图2的恒温槽中的一个罐和收容在该罐内的培养盒构成的
培养单元的结构的布置图6是表示图5的培养单元的控制系统的框图7表示图5的振荡装置的振荡机构，(A)为立体图，(B)为侧视图； 图8是表示图5的培养单元中的培养顺序的工序图； 图9表示图5的培养单元中的培养顺序，是延续图8的工序图； 图10表示图5的培养单元中的培养顺序，是延续图9的工序图； 图11表示图5的培养单元中的培养顺序，是延续图10的工序图； 图12是表示图5的培养单元中的诱导因子刺激间歇式灌流培养工序的 处理操作的流程图13是表示图12的处理操作的延续的流程图"是表示图5的培养单元中的诱导因子刺激间歇式灌流培养工序(包 括通过细胞回收袋的细胞回收处理)的处理操作的流程图； 图15是表示图14的处理操作的延续的流程图；图16是图5的培养单元中的诱导因子刺激间歇式灌流培养工序的处理
操作的流程图17是表示图16的处理操作的延续的流程图18是表示应用了本发明涉及的细胞培养用振荡装置中的第2种实施 方式的培养单元以及细胞培养装置的结构(分化诱导状态)的布置图19是表示图18的培养单元的分化诱导前的状态的结构的布置图20是表示图18以及图19的培养单元中的分化诱导间歇式灌流培养 工序的处理操作的流程图21是表示图20的处理操作的延续的流程图22是表示应用了本发明涉及的细胞培养用振荡装置中的第3种实施 方式的培养单元以及细胞培养装置的结构图23是表示应用了第3种实施方式涉及的细胞培养用振荡装置的细胞 培养装置中的由一个空间上独立的培养室和低温室、以及收容在该培养室内 的培养袋盘和收容在低温室中的培养基袋盘及废液袋盘构成的培养单元的 结构的布置图24是表示图23的载置台的结构的立体图25是表示在图23的培养单元中的抗体刺激间歇式灌流培养工序中， 包括将细胞从培养袋回收的处理时的处理操作的流程图； 图26是表示图25的处理操作的延续的流程图27是表示在图23的培养单元中的抗体刺激间歇式灌流培养工序中， 包括将细胞从细胞回收袋回收的处理时的处理操作的流程图； 图28是表示图27的处理操作的延续的流程图29是表示图23的培养单元的抗体刺激连续式灌流培养工序的处理操 作的流程图30是表示图29的处理操作的延续的流程图；图31是表示图23的培养单元中的抗体刺激单纯流加培养工序的处理操 作的流程图32是表示图31的处理操作的延续的流程图33是表示在图23的培养单元中的抗体刺激单纯流加培养工序中，包 括将细胞从细胞回收袋回收的处理时的处理操作的流程图； 图34是表示图33的处理操作的延续的流程图35是表示将通过使用图7的细胞培养用振荡装置的振荡方法的培养 结果与通过现有的振荡方法的培养结果以及静置培养的结果进行对比的图。 附图标记说明 10:细胞培养装置 11:恒温槽 12:培养单元 13:运转控制盘 14:图像处理用计算机 15:监视用计算机 16:罐 17:培养盒
18:培养袋(增殖用培养容器)
19:细胞接种盒(诱导因子刺激用培养容器)
20:培养基盒(培养基储存设备)
46:载置台
47:培养袋盘
48:第一泵
49:第二泵
65:诱导因子刺激容器67:培养基袋(培养基储存容器)
68:使用后的培养基袋(使用后的培养基储存容器)
72:细胞回收袋(细胞回收容器)
80:振荡装置
85:工作板
86:突出部
87:照明用LED
88: CCD照相机(图像获得设备)
89:图像储存电路
91:振荡机构(按压设备)
100:细胞培养装置
101:分化诱导盒(分化诱导用培养容器)
200:细胞培养装置
212:培养单元
221:图像处理用单元
230:低温室
231:培养基袋盘
232:废液袋盘
233:培养基袋(培养基储存设备、培养基储存容器) 234:废液袋(废液储存设备、使用后的培养基储存容器) 240:培养室 241:培养袋盘
242:培养袋(抗体刺激用培养容器、增殖用培养容器)
252:载置台
252b:面积变化部分252c:面积变化部分 261:供给泵 271:排出泵 290:振荡装置 291:振荡机构
291a:工作板(按压设备) 291b:突出部
302: CCD照相机(图像获得设备)
具体实施例方式
下面根据附图对实施本发明的最优实施方式进行说明。 [A]第1种实施方式(图1 图17)
图1是表示应用了本发明涉及的细胞培养用振荡装置中的第1种实施方 式的细胞培养装置的结构图。图2是表示图1的恒温槽的立体图。图5是表 示由图2的恒温槽中的一个罐和收容在该罐内的培养盒构成的培养单元的结 构的布置图。
图1所示的细胞培养装置10是培养尤其是用于免疫细胞疗法的悬浮细 胞的装置，包括具有多个(例如8个)培养单元12的恒温槽11、控制该 恒温槽11以及培养单元12的运转的运转控制盘13、处理细胞的图像的图像 处理用计算机14、与运转控制盘13以及图像处理用计算机14连接且用于监 视恒温槽11及培养单元12的监视用计算机15。上述运转控制盘13以及图 像处理用计算机14起控制设备的功能。
这里，作为上述悬浮细胞，公知有末梢血单核细胞、LAK细胞(淋巴 因子激活杀伤细胞)、神经干细胞、ES细胞等。这些悬浮细胞以下简称为细 胞。另外，用与各个细胞对应的诱导因子剌激这些细胞来进行细胞培养。各个细胞的诱导因子不同，例如，LAK细胞的诱导因子为抗人CD3抗体等， 神经干细胞的诱导因子为EGF等的上皮成长因子，ES细胞的诱导因子为 FGF-8b等的成纤维细胞增殖因子。此外，本细胞培养装置IO还适合培养上 述悬浮细胞之外的贴壁依赖性细胞(anchorage dependent cell)。
上述培养单元12包括在恒温槽11内互相隔开的多个(例如8个)罐16 (图2以及图5)、和各个罐16内收容的培养盒17(图2以及图3)。如后详 细所述，该培养盒17具有作为增殖用培养容器的培养袋18、作为诱导因子 刺激用培养容器的细胞接种盒19、以及作为培养基储存设备的培养基盒20。 这些培养容器(培养袋18、细胞接种盒19)内的细胞在各个罐16的独立的
培养环境下进行培养。
如图2所示，上述恒温槽11在具有可开关的本体门21的恒温槽本体22 内设置有多层的搁板23，各搁板23上设置一个罐16。该恒温槽11在关闭 本体门21的状态下，将恒温槽本体22内的环境(温度、湿度以及C02浓度)
维持在培养细胞所必需的环境。
由此，如图5以及图6所示，在恒温槽本体22内设置了温度传感器24、 C02传感器25、门传感器26以及加热器27，而且在该恒温槽本体22中连 接了设置于外部的储气瓶28。来自温度传感器24、 C02传感器25、门传感 器26的信号传送到运转控制盘13。该运转控制盘13根据来自温度传感器 24的温度信号控制加热器27，根据来自C(M专感器25的C(V浓度信号控制 从储气瓶28向恒温槽本体22内供给的C02气体量。
如图5以及图6所示，上述罐16在罐本体30上安装有可开关的罐门31 ， 在罐本体30上设置有吸气过滤器32以及排气过滤器33，同时在罐本体30 的吸气过滤器32侧设置有送风风扇34。
吸气过滤器32以及排气过滤器33为除菌的过滤器，在通过送风风扇34 的运转将恒温槽本体22内的空气以及C02气体引入到罐16内时，可以防止细菌从恒温槽本体22流入到罐16内。此外，送风风扇34的运转由运转控 制盘13控制，在恒温槽11的本体门21打开的信号从门传感器26传送到运 转控制盘13时，送风风扇34的运转停止，可以确保罐16的密闭状态。
通过由吸气过滤器32以及排气过滤器33来防止细菌从恒温槽本体22 流入到罐16内的功能、以及由送风风扇34的运转停止来确保的罐16的密 闭性，使各罐16内形成分别独立的培养环境。由此，恒温槽11的一个罐16 中收容的培养盒17内的细胞相对于其它的罐16内的细胞隔离，同时可以防 止该罐16中收容的培养盒17内的细胞被杂菌污染。此外，还能防止被其他 患者的细胞污染的所谓的交叉污染。
在罐本体30中，还设置有门传感器35、门锁传感器36、温度传感器37、 湿度传感器38、门锁机构39、加热器40以及循环风扇41。运转控制盘13 根据来自温度传感器37的温度信号控制加热器40。此外，运转控制盘13 控制循环风扇41的运转，在罐16内使空气以及C02循环。上述湿度传感器 38检测罐16内的湿度，并向运转控制盘13传送信号，检测异常的情况。由 此，罐16内维持在用于培养细菌的最适当的环境。
此外，运转控制盘13对门锁机构39的操作进行控制，使得在一个恒温 槽11中两个以上的罐门31不会同时打开。由此，可以防止不同的罐16之 间细胞或培养基等被取错放错的情况。该门锁机构39的锁定操作由门锁传 感器36检测出，并传送到运转控制盘13。此外，罐门31的开关状态由门传 感器35检测出，并传送到运转控制盘13 。
图5所示的罐本体30内的下部设置有支持收容在罐16内的培养盒17 的台42，该台42上设置有重量计43。该重量计43测量收容在罐16内的培 养盒17的培养袋18的重量，实际中测量从培养基盒20供给到培养袋18的 培养基的量。该重量计43的测量值也传送给运转控制盘13。此外，罐本体 30中设置有指示灯44。在罐16内进行自动培养时，使该罐16的指示灯44显示为例如红色，输出了操作指令的罐16与内部未收容培养盒17的罐16 的指示灯44显示为绿色。由此，可以确保进行自动培养的罐16与其它的罐 16独立的培养环境，并能防止与收容在其它的罐16中的试样(细胞)的交 叉污染或者取错的情况。
这里，对上述培养盒17进行说明。
如图3以及图5所示，该培养盒17在大盘45上设置有培养袋18、细胞 接种盒19以及培养基盒20，培养袋18及细胞接种盒19为培养细胞的培养 容器。其中，细胞接种盒19是使细胞表现功能的功能表现用培养容器(例 如使细胞增殖，使细胞分化(后述)等)，本实施方式中，是为了增殖而通 过诱导因子刺激细胞的诱导因子刺激用培养容器。此外，培养袋18是在细 胞接种盒19中用于增殖被诱导因子刺激后的细胞的增殖用培养容器。
培养袋18是收容已接种细胞的培养液的柔性的一次性容器，通过载置 台46 (图5)载置在图4 (A)所示的培养袋盘47中，该培养袋盘47可拆 卸地安装在图3以及图5所示的大盘45中。上述培养袋18例如可以是由氧 透过性材料形成的袋。如图5所示，上述大盘45中设置有第一泵48、第二 泵49以及第三泵50。培养袋18的一端侧用管63经第二泵49与第7连接器 57连接。另外，培养袋18的另一端侧用管60与第1连接器51连接。上述 第一泵48、第二泵49以及第三泵50从更换灭菌管的便利性考虑，优选为蠕 动型泵。
在该大盘45中，管61的一端与第3连接器53连接，另一端与第5连 接器55连接。该管61设置在第一泵48的图中未示出的转动驱动部上。管 63的一端如上所述与第7连接器57连接，另一端与培养袋18连接。该管 63设置在第二泵49的图中未示出的转动驱动部上。管62的一端通过连接器 X与管61连接，另一端通过连接器Y与管63连接。该管62设置在第三泵 50的图中未示出的转动驱动部上。如图4 (C)所示，上述细胞接种盒19在诱导因子刺激容器65的底面 内侧上将诱导因子固定化，将培养基加入到该诱导因子刺激容器65内，在 该培养基中接种细胞，将该诱导因子刺激容器65设置在盒架66上，构成盒 结构。上述诱导因子刺激容器65中加入诱导因子、培养基以及细胞的操作 在净化台或安全柜(在本实施方式中以下称为净化台等)内在无菌状态下进 行。另外，将培养基和细胞的混合液称作培养液。
如图3所示，上述细胞接种盒19可拆卸地安装在大盘45上。此时，如 图5所示，细胞接种盒19的第2连接器52以及第4连接器54分别与大盘 45的第1连接器51、第3连接器53无菌结合。S卩，第1连接器51与第2 连接器52通过例如在一方的橡胶状结合部上插入另一方的针状结合部来进 行无菌结合。第3连接器53与第4连接器54的结合也相同。
通过第1连接器51与第2连接器52的结合，使用管60，将不同的培养 环境的细胞接种盒19和培养袋18连接，即将具有用于通过诱导因子刺激细 胞而使该细胞表现出增殖功能的培养环境的细胞接种盒19、与具有用于细胞 增殖的培养环境的培养袋18连接。从而，可以将在细胞接种盒19中被诱导 因子刺激后开始增殖的细胞转移到培养袋18，仅在该培养袋18中进行增殖。
如图4 (B)所示，所述培养基盒20将作为培养基储存容器的培养基袋 67以及作为使用后的培养基储存容器的使用后的培养基袋68载置在培养基 袋盘69上，构成盒结构。上述培养基袋67储存向培养袋18、细胞接种盒 19供给的培养基。此外，上述使用后的培养基袋68储存从培养袋18排出的 使用后的培养基(上清液)。培养基盒20通过构成盒结构，在将培养袋18 保持在罐16内的状态下，只要在该罐16内的培养盒17上安装培养基盒20， 就能进行培养基的交换、供给。
上述培养基盒20可拆卸地安装在大盘45 (图3)上。此时，如图5所 示，培养基盒20的第6连接器56、第8连接器58分别与大盘45的第5连接器55、第7连接器57如第1连接器51与第2连接器52那样进行无菌结 合。通过第6连接器56与第5连接器55的结合，培养基袋67与细胞接种 盒19连接。此外，通过第7连接器57与第8连接器58的结合，使用后的 培养基袋68与培养袋18连接。通过培养袋18、细胞接种盒19以及培养基盒20按照如上所述进行连接 构成封闭结构，所述封闭结构为培养基盒20中的培养基袋67内的培养基 通过第一泵48的启动经细胞接种盒19供给到培养袋18，该培养袋18内的 使用后的培养基通过第二泵49的启动排出到培养基盒20的使用后的培养基 袋68中。通过该封闭结构，该系统(培养袋18、细胞接种盒19以及培养基 盒20)保持在无菌状态。另外，上述细胞接种盒19在内部的细胞没有之后可以用空盒70替换。 由此，可以防止细胞接种盒19内的诱导因子转移到培养袋18内。此外，培 养基盒20在培养基袋67变空时，可以用具有充满培养基的培养基袋67和 空的使用后的培养基袋68的新的培养基盒20进行更换。该更换由操作者实 施。上述空盒70仅起作为使培养基流动的流动通路的功能。培养袋18内的培养(细胞增殖)包括流加培养，其使第一泵48启动， 将培养基盒20的培养基袋67内的培养基供给(流加)到培养袋18中，从 而使细胞增殖；灌流培养，其使第一泵48和第二泵49启动，将培养袋18 内的使用后的培养基排出到培养基盒20的使用后的培养基袋68内，并将培 养基袋67内的培养基供给到培养袋18，从而使细胞增殖；振荡培养，其使 用后述的振荡装置80;静置培养，其不实施振荡。其中，所述灌流培养包括: 交替实施使用后的培养基的排出和培养基的供给的间歇式灌流培养、与使用 后的培养基的排出和培养基的供给同时实施的连续式灌流培养。在该连续式 灌流培养中，通常在管63内在培养袋18和第二泵49之间设置有阻止细胞 移动的过滤器71，可以防止培养袋18内的细胞排出到使用后的培养基袋68中。所述第三泵50在通过图象观察培养袋18内的细胞增殖等时启动。艮口，培养袋18内的细胞在管63中未设置过滤器71的情况下，从培养袋18经管 63、管62以及管61导入到细胞接种盒19或者空盒70中，由后述的CCD 照相机88照相，从而可以观察增殖的细胞数等。在上述管63内设置过滤器 71的情况下，第三泵50的上游侧通过旁路管73与培养袋18连接，培养袋 18内的细胞经上述旁路管73以及管62导入到细胞接种盒19或者空盒70 内，使用CCD照相机88进行观察。培养袋18中的细胞的增殖结束后，培养袋18内的使用后的培养基排出 到上述培养基盒20的使用后的培养基袋68中，该培养袋18内的细胞浓縮。 该使用后的培养基的排出由第二泵49的启动来实施，根据重量计43的测定 值，通过运转控制盘13的控制，使得培养袋18内的培养液的容量为约1/2-1/3 为止。通过该培养袋18内的细胞的浓縮，可以减少随后实施的以细胞洗涤、 浓縮为目的的离心分离机的离心分离次数。此外，在培养基盒20中，培养袋18中的细胞如上所述被浓縮后，也可 以将使用后的培养基袋68替换为作为在离心分离机上可安装的细胞回收容 器的细胞回收袋72，通过第二泵49的启动将培养袋18内的细胞被浓縮后的 培养液供给到该细胞回收袋72中。此时，管63中未设置过滤器71。由此， 离心分离机中可安装的袋中的细胞的回收可以在密闭空间的罐16内实施， 使得细胞回收作业省力化。如图5以及图6所示，在收容于罐16内的培养盒17的大盘45中，设 置有检测细胞接种盒19或者空盒70安装到大盘45上的细胞接种盒传感器 74、和检测培养基盒20安装到大盘45上的培养基盒传感器75。这些传感器 74以及75的信号传送给运转控制盘13。该运转控制盘13确认在培养盒17 的大盘45中安装了细胞接种盒19或者空盒70，且安装了培养基盒20后，使第一泵48、第二泵49以及第三泵50启动。但是，如图5所示，培养盒17收容在罐16内，该培养盒17被罐16的 台42支持。在该台42上，在设置培养盒17的培养袋盘47的下方位置上设 置有倾斜电机76、凸轮机构79以及定位传感器77。在培养袋盘47上直接 载置培养袋18的载置台46中，其一部分(图中未示出的升降部)可升降地 构成。上述倾斜电机76使凸轮机构79转动，使载置台46的上述升降部进 行升降。该升降部的位置由定位传感器77检测，并向运转控制盘13传送信 号。倾斜电机76由运转控制盘13控制，在培养袋18中的培养初期阶段， 使载置台46的升降部下降。由此，培养袋18中形成储液部78(图8以及图 9)。在培养袋18中的培养初期阶段，来自细胞接种盒19的培养液储存在储 液部78中，从而培养袋18内的单位面积的细胞密度保持在适合增殖的密度， 细胞可以在培养初期有效地进行增殖。在培养袋18内培养液达到规定量a (后述)以上的培养中期以及后期，倾斜电机76通过凸轮机构79使载置台 46的升降部上升，使培养袋18成为水平状态，消除上述储液部78。而且，在罐16内，如图5所示，振荡装置80的振荡机构91作为按压 设备设置在培养盒17的设置培养袋盘47的上方位置。该振荡装置80具有上述振荡机构91、工作电机81、凸轮机构90以及 定位传感器82。如图7所示，振荡机构91通过导杆84在装置框架83上可 上下自由移动地设置有作为按压设备的工作板85，且该工作板85的底面上 突设有多个突出部86。工作板85通过工作电机81，在凸轮机构90 (图5) 的作用下能向上方或者下方交替移动，从而该工作板85的突出部86反复按 压位于振荡机构91的下方的培养袋18，即反复对培养袋18进行按压或者解 除按压。这里，在将培养袋18的容量设置为500-1500ml、工作板85的大小设定为30X40cm时，如图7 (A)所示，在振荡机构91上突设的突出部优选为 5-25个。此外，如图7(B)所示，该突出部86的直径r例如可以是0.5-7cm， 优选为l-3cm。突出部86的高度例如可以是0.5-7cm，优选为l-3cm。突出 部86的材料例如可以是塑料、铝、橡胶等。通过用这样的材料制作突出部 86，可以对培养袋18以及培养袋18内的细胞无损伤地进行按压。突出部86 的形状例如可以是半球形或圆筒形等，但是只要是不损伤培养袋的形状，可 以是任意的形状。另外，突出部86的按压例如可以以每分钟10-180次的速 度、以l-15mm的按压幅度进行按压。此外，这些数值只是一个例子，并不 限定于上述数值。通过这样的结构的振荡装置91，可以搅拌培养袋18内的培养液，从而 培养袋18内的细胞在培养液中悬浮移动，使得该培养袋18内的细胞的分布 以及培养基的成分浓度均一化，而且氧气供给能力也提高，从而可以促进细 胞的增殖。如图6所示，通过上述定位传感器82检测工作板85的位置，并向运转 控制盘13传送信号，通过该运转控制盘13控制工作电机81。使用了上述振 荡装置80的培养袋18内的细胞培养(振荡培养)可以在培养袋18内充满 培养液之前实施，也可以在充满培养液之后实施。此外，如图5所示，在罐16内，在设置培养盒17的细胞接种盒19或 者空盒70的位置的上方设置有照明用LED87，并在下方设置有作为图像获 得设备的CCD照相机88。照明用LED87从上方照亮细胞接种盒19或者空 盒70。 CCD照相机88从下方对细胞接种盒19或者空盒70内的细胞照相， 并获得该图像。这些照明用LED87的照明操作和CCD照相机88的照相操 作由运转控制盘13控制(图6)，每隔规定时间(例如6小时)获得细胞接 种盒19或者空盒70内的细胞的图像。各时段的细胞图像储存在图像处理用 计算机14的图像储存电路89中。上述图像处理用计算机14将图像储存电路89中储存的各时段的细胞图 像进行图像处理，例如进行二值化处理或多值化处理，并计算出单一细胞的 投影面积的平均值、和作为单一细胞聚集后的细胞聚集块的非单一细胞的增 加速度来作为细胞培养的评价参数。单一细胞的投影面积的平均值(单一细胞的平均投影面积)是通过从将细胞接种盒19安装在培养盒17中并将该培 养盒17收容在罐16内进行培养开始，经过例如24小时后的细胞图像计算 得到的。此外，上述是否为非单一细胞可以按照如下所述进行判断由于培养初 期的单一细胞的投影面积不足100um2，因此投影面积为100un^以上时可 以判断为非单一细胞。从细胞的经时变化的图像(例如，从培养开始经过24 小时、48小时、72小时后的图像)，计算出相对于所有细胞的非单一细胞的 比例的变化，从而算出非单一细胞的增加速度。图像处理用计算机14从单一细胞的平均投影面积计算出延迟时间，推 断该细胞的增殖开始时间。这里，上述延迟时间是指从在细胞接种盒19的 诱导因子刺激容器65中接种细胞后到开始增殖所需要的诱导期的时间。图 像处理用计算机14从细胞增殖开始时间判断该细胞的培养状况，即判断该 细胞通过诱导因子刺激有无增殖的可能性。然后，图像处理用计算机14将 该细胞的判断结果(例如，该细胞具有增殖可能时"YES"、没有增殖可能 性时"NO"等的信号)传送给运转控制盘13。运转控制盘13在接收到判断 细胞接种盒19的诱导因子刺激容器65内的细胞增殖的可能性明显低的信号 时，显示该细胞的状态。另外，延迟时间过长的细胞是指诱导因子的刺激明 显难以起作用的细胞，可以判断为增殖的可能性低。此外，图像处理用计算机14从非单一细胞的增加速度计算出该细胞的 最小倍化时间。这里，倍化时间是指某一时刻的细胞的细胞数增加一倍所需 要的时间。图像处理用计算机14根据该最小倍化时间判断该细胞的培养状况，即判断该细胞的增殖能力，并传送信号给运转控制盘13。然后，从图像 处理用计算机14接收到信号的运转控制盘13根据上述细胞的增殖能力，确
定将细胞从细胞接种盒19移动到培养袋18的时间、向培养袋18流加培养 基的流加速度等。另外，最小倍化时间过长的细胞可以判断为增殖能力明显 低的细胞。
起控制设备作用的运转控制盘13以及图像处理用计算机14图中未示， 它们具有进行演算和控制的CPU、储存处理程序和数据的储存装置(存储 器)、以及将用于输入数据和命令等的键盘、鼠标或者触摸屏等的输入装置 与显示器等的输出装置进行连接的输入输出电路。而且，图像处理用计算机 14还具有储存来自CCD照相机88的图像数据的图像储存电路89。
在图像处理用计算机14的储存装置中储存有程序，该程序将由CCD照 相机88每隔规定时间照相得到的细胞接种盒19内的细胞的图像进行图像处 理(例如二值化处理或多值化处理)，算出细胞培养的评价参数(单一细胞 的平均投影面积、非单一细胞的增加速度)等，并根据该细胞培养的评价参 数判断细胞的培养状况(细胞的增殖可能性、细胞的增殖能力)。
此外，在运转控制盘13的储存装置中储存有如下程序该程序根据细 胞的培养状况，控制与恒温槽ll、罐16以及培养盒17相关的设备(例如， 第一泵48、第二泵49等)，实施培养操作。另外，在运转控制盘13的储存 装置中还储存有如下的设备控制用程序该设备控制用程序每隔规定时间控 制CCD照相机88，取得细胞的图像等，并根据来自恒温槽11、罐16以及 培养盒17的各种传感器的信号，对这些与恒温槽11、罐16以及培养盒17 相关的设备进行控制。
然后，通过图8至图11的工序图以及图12至图17的流程图来说明运 。转控制盘13以及图像处理用计算机14实施上述程序来培养细胞的工序。在 该细胞培养工序中，运转控制盘13以及图像处理用计算机14独立地设定并控制恒温槽11的各个罐16的培养环境，培养各个罐16中收容的培养盒17
中的细胞。
图S至图13表示诱导因子刺激间歇式灌流培养工序，表示从培养袋18 中回收细胞的情况。首先，如图8 (A)以及图12所示，操作者通过载置台 46将空的培养袋18载置在培养袋盘47上，将该培养袋盘47安装在大盘45 上，培养袋18与第一泵48、第二泵49以及第三泵50连接。
然后，操作者将该大盘45搬入到恒温槽11的、指示灯44显示为例如 绿色的单独的罐16内，由台42进行支持。然后，操作者在净化台等内在诱 导因子刺激容器65中将诱导因子固定化，加入培养基，如图8 (B)所示， 将接种了细胞的细胞接种盒19安装在上述罐16内的上述大盘45上。接着， 操作者在净化台等内将在培养基袋67中加入有培养基的培养基盒20安装到 上述罐16内的上述大盘45上(图12的S1)。
然后，操作者确认收容有培养盒17的罐16中的CCD照相机的图像输 出(图12的S2)，所述培养盒17在大盘45上安装有培养袋18、细胞接种 盒19以及培养基盒20。在该图像输出的确认之前或之后，操作者使该罐16 的倾斜电机76启动，使载置台46的升降部下降，在培养袋18上形成储液 部78。然后操作者再通过该罐16的重量计43测量空的培养袋18的重量。
然后，如图9 (A)所示，操作者关闭罐门31，在该罐16内开始细胞的 培养(图12的S3)。由此，细胞接种盒19的诱导因子剌激容器65中，通 过用于增殖的诱导因子来刺激细胞(图12的S4)。该罐16的CCD照相机 88每隔规定时间(例如6小时)对细胞接种盒19的诱导因子刺激容器65 内的细胞进行照相，图像处理用计算机14从该照相图像算出细胞培养的评 价参数。然后，图像处理用计算机14从该评价参数算出延迟时间，判断该 细胞受到诱导因子的刺激后是否存在增殖的可能性，再算出最小倍化时间， 算出该细胞的增殖能力(图12的S5)。运转控制盘13在从图像处理用计算机14接收到判断细胞在细胞接种盒
19的诱导因子刺激容器65内被诱导因子刺激到经过规定时间(例如72小时) 仍没有增殖的可能性的信号时，表示出该结果。此外，运转控制盘13在从 图像处理用计算机14接收到判断细胞在细胞接种盒19的诱导因子刺激容器 65内具有增殖的可能性的信号时，根据该细胞的增殖能力，确定将该细胞转 移到培养袋18中的时间、和流加到培养袋18内的培养基的流加速度等。运 转控制盘13根据该确定的内容使第一泵48工作，如图9 (B)所示，培养 基盒20的培养基袋67内的培养基流加到细胞接种盒19中，将该细胞接种 盒19的诱导因子刺激容器65内的细胞转移到培养袋18中，同时，将培养 基袋67内的培养基流加到培养袋18中(图12的S6)。
通过该第一泵48的工作，开始培养袋18的储液部78内的细胞的静置 培养(图12的S7)。运转控制盘13根据程序流加培养基的同时进行流加培 养，并判断通过重量计43测定的培养袋18内的培养液的重量是否为规定值 a以上(图12的S8)。在达到规定值a以上的时刻，运转控制盘13启动倾 斜电机76，通过凸轮机构79使载置台46的升降部上升，如图10 (A)所示， 培养袋18成为水平状态，消除储液部78 (图12的S9)。
然后，运转控制盘13判断通过重量计43测定的培养袋18内的培养液 的重量是否为规定值b以上(图12的S10)，在达到规定值b以上的时刻启 动工作电机81。由此，如图10 (B)所示，振荡装置80工作，并开始振荡 装置80的振荡机构91中的工作板85反复按压培养袋18的振荡培养(图12 的Sll)。接着，运转控制盘13判断通过重量计43测定的培养袋18内的培 养液的重量是否为规定值c以上(图12的S12)。在达到规定值c以上的时 刻停止第一泵48，停止从培养基盒20的培养基袋67向培养袋18流加培养 基，停止工作电机81，停止培养袋18内的振荡培养(图13的S13)。
在培养袋18内细胞沉降后，运转控制盘13启动第二泵49，如图11 (A)所示，将培养袋18内的使用后的培养基(培养袋18内的上清液)排出到培
养基盒20的使用后的培养基袋68中(图13的S14)。然后，运转控制盘13 启动第一泵48，将培养基从培养基盒20的培养基袋67流加到培养袋18中， 启动工作电机81，通过振荡装置80在培养袋18内实施振荡培养(图13的 S15)。经过规定时间后，运转控制盘13停止第一泵48，停止从培养基盒20 的培养基袋67向培养袋18流加培养基，停止工作电机81，停止培养袋18 内的振荡培养(图13的S16)。
运转控制盘13判断是否达到与增殖的细胞的使用时间相关的所希望的 培养期限，此外，图像处理用计算机14判断培养袋18内的细胞是否达到所 希望的细胞数(图13的S17)。在判断培养袋18内细胞是否达到所希望的 细胞数时，运转控制盘13启动第三泵50 (图11 (A))，将培养袋18内的细 胞的一部分转移到细胞接种盒19或空盒70(大多数情况为空盒70)，由CCD 照相机对该细胞进行照相。图像处理用计算机14对该细胞的图像进行图像 处理，判断细胞数是否达到规定值以上，并向运转控制盘13传送信号。然 后，运转控制盘13在未达到上述培养期限或细胞数时，重复步骤S14至S17 的处理操作。
上述步骤S13至S17为交替实施培养袋18内的使用后的培养基的排出 和向培养袋18内供给(流加)新的培养基的间歇式灌流培养。
此外，在步骤S9至S17中，用CCD照相机确认细胞接种盒19的诱导 因子刺激容器65内的细胞的有无，在诱导因子刺激容器65内细胞不存在时， 运转控制盘13提醒操作者将细胞接种盒19替换成空盒70，从而使得诱导因 子不会从诱导因子刺激容器65流入到培养袋18内。在替换成该空盒70时， 运转控制盘13暂时中断从培养基盒20到培养袋18的培养基的流加、和通 过振荡装置80进行的振荡培养，直至空盒70替换结束。
而且，在步骤S9至S17中，运转控制盘13在根据重量计43的测定值判断培养基盒20的培养基袋67中没有培养基的情况下，提醒操作者将培养 基盒20换成新的培养基盒20。在替换成新的培养基盒20时，运转控制盘 13暂时中断从培养基盒20到培养袋18的培养基的流加、和通过振荡装置 80进行的振荡培养，直至培养基盒20替换结束。
运转控制盘13在步骤S17达到所希望的培养期限或者所希望的细胞数 时，停止振荡，细胞沉降后，如图ll (B)所示，启动第二泵49，将培养袋 18内的使用后的培养基排出到培养基盒20的使用后的培养基袋68中，根据 重量计43的测定值，将细胞浓縮至培养袋18内的培养液为约1/2-1/3 (图 13的S18)。
运转控制盘13随后停止第二泵49，终止细胞培养(图13的S19)。该 培养结束后，由操作者将培养袋18内的细胞在净化台等内转移到离心分离 机用的容器中，然后通过离心分离回收细胞(图13的S20)。
然后，在同样的诱导因子剌激间歇式灌流培养工序中，图14以及图15 显示了包括通过细胞回收袋72 (图5)回收细胞的处理的情况。因此，表示 该图14以及图15所示的工序的步骤S21至S38与图12以及图13的步骤 S1至S18相同，因此省略说明。
图15所示的步骤S38中，通过第二泵49的启动将培养袋18内的细胞 浓縮，然后，运转控制盘13停止第二泵49，并提醒操作者将培养基盒20 的使用后的培养基袋68换成细胞回收袋72 (图15的S39)。该细胞回收袋 72为安装在离心分离机中并能用于离心分离的袋。
将培养基盒20的使用后的培养基袋68换成细胞回收袋72之后，运转 控制盘13启动第二泵49以及工作电机81，通过振荡装置80使培养袋18 内部振荡，同时将该培养袋18内的细胞与培养基一起转移到安装在培养基 盒20中的细胞回收袋72中(图15的S40)。运转控制盘13随后停止第二 泵49以及工作电机81，停止细胞培养(图15的S41)。该培养结束后，通过操作者将细胞回收袋72安装在离心分离机中，通过离心分离回收细胞(图
15的S42)。
然后，通过图16以及图17说明诱导因子刺激连续式灌流培养工序。该 图16以及图17所示的诱导因子刺激连续式灌流培养工序中的步骤S51至 S62与图12以及图13的诱导因子刺激间歇式灌流培养工序中的Sl至S12 相同，因此省略说明。在该诱导因子刺激间歇式灌流培养工序中，在培养袋 18和第二泵49之间设置过滤器71 。
运转控制盘13将培养基从培养基盒20的培养基袋67流加到培养袋18 (图16的S56)，培养袋18内的通过振荡装置80进行的振荡培养中(图16 的S61)，培养袋18内的培养液的重量为规定值c以上时(图16的S62)启 动第二泵49，将培养袋18内的使用后的培养基排出到培养基盒20的使用后 的培养基袋68中。由此，连续式灌流培养在培养袋18内开始(图17的S63)， 所述连续式灌流培养同时实施向培养袋18流加培养基和从培养袋18排出使 用后的培养基。此时，培养袋18内的细胞通过过滤器71被阻止流动，从而 不会流动到使用后的培养基袋68内。在上述连续式灌流培养中，通过振荡 装置80进行的振荡培养也可以同时实施。
运转控制盘13判断是否达到与增殖的细胞的使用时间相关的所希望的 培养期限，此外，图像处理用计算机14判断培养袋18内的细胞是否达到所 希望的细胞数(图17的S64)。在判断培养袋18内细胞是否达到所希望的 细胞数时，运转控制盘13启动第三泵50，将培养袋18内的细胞的一部分转 移到细胞接种盒19或空盒70 (大多数情况为空盒70)，由CCD照相机对该 细胞进行照相。图像处理用计算机14对该细胞的图像进行图像处理，判断 细胞数是否达到规定值以上，并向运转控制盘13传送信号。然后，运转控 制盘13在未达到上述培养期限或细胞数时，重复步骤S63的连续式灌流培 养。这里，在步骤S59至S64中，用CCD照相机确认细胞接种盒19的诱导 因子刺激容器65内的细胞的有无，在诱导因子刺激容器65内细胞不存在时， 运转控制盘13提醒操作者将细胞接种盒19替换成空盒70，从而使得诱导因 子不会从该诱导因子刺激容器65流入到培养袋18内。在替换成该空盒70 时，运转控制盘13暂时中断从培养基盒20到培养袋18的培养基的流加、 和通过振荡装置80进行的振荡培养，直至空盒70替换结束。
而且，在步骤S59至S64中，运转控制盘13在根据重量计43的测定值 判断培养基盒20的培养基袋67中没有培养基的情况下，提醒操作者将培养 基盒20换成新的培养基盒20。在替换成新的培养基盒20时，运转控制盘 13暂时中断从培养基盒20到培养袋18的培养基的流加、和通过振荡装置 80进行的振荡培养，直至培养基盒20替换结束。
运转控制盘13在步骤S64达到所希望的培养期限或者所希望的细胞数 时，停止第一泵48、第二泵49以及工作电机81，停止灌流培养以及振荡培 养(图17的S65)。
运转控制盘13随后启动第二泵49，将培养袋18内的使用后的培养基排 出到培养基盒20的使用后的培养基袋68中，根据重量计43的测定值，将 细胞浓縮至培养袋18内的培养液为约1/2-1/3 (图17的S66)。
运转控制盘13随后停止第二泵49，终止细胞培养(图17的S67)。该 培养结束后，由操作者将培养袋18内的细胞在净化台等内转移到离心分离 机用的容器中，然后通过离心分离回收细胞(图17的S68)。
按照上述构成的情况下，根据上述实施方式，起到如下的效果(1) (8):
(1)图像处理用计算机14将CCD照相机88照相得到的细胞接种盒 19内的细胞的图像进行图像处理，获得细胞培养的评价参数(单一细胞的平 均投影面积、非单一细胞的增加速度)，判断评价该细胞的培养状况(细胞的增殖可能性以及增殖能力)。运转控制盘13实施与该培养状况对应的培养
操作(将细胞从细胞接种盒19向培养袋18转移的时间、和从培养基盒20 向培养袋18以规定的流加速度进行培养基的流加等)。其结果，可以在非接 触、非侵害的状态下判断细胞的培养状况，因此该细胞不会受到损伤，可以 避免取样引起的污染的危险性以及细胞的损失。此外，由于操作者无须逐步 实施培养操作，可以减少操作者的劳动。而且， 一个患者的细胞接种到收容 在单独的罐16内的培养盒17的细胞接种盒19中，由于对该细胞实施与细 胞的培养状况对应的培养操作，从而各个患者的细胞可以实现适当的培养操 作，可以避免交叉污染。通过实现与该细胞的培养状况对应的适当的培养操 作，可以进行按小时计算的培养操作，可以促进培养，縮短培养期限。
(2) 培养基盒20构成为盒结构，与培养袋18以及同样构成为盒结构 的细胞接种盒19连接，从而可以将培养袋18时常保持在最适于培养的环境 的罐16内。因此，可以降低环境变化对培养罐18内的细胞的损伤，同时可 以省略在净化台等内将培养基供给到培养袋18中的无菌操作。
(3) 将培养基盒20、细胞接种盒19以及培养袋18连接并构成密闭体 系，从而培养基盒20、细胞接种盒19以及培养袋18可以保持在无菌状态。
(4) 在培养袋18内的培养初期阶段，该培养袋18的储液部78内储存 了培养液，从而单位面积的细胞密度可以维持在适合增殖的密度，可以在培 养初期阶段使细胞有效地增殖。
(5) 将培养袋18内增殖的细胞导入到细胞接种盒19或空盒70内，该 细胞的图像通过CCD照相机88获得时，将培养袋18内增殖的细胞形成图 像，从而无需取样就能观察细胞数和细胞形态。
(6) 将培养袋18内的使用后的培养基排出到培养基盒20的使用后的 培养基袋68中进行储存，从而使培养袋18内的细胞密度提高，浓缩，因此 可以减少用于细胞回收的离心分离操作次数。其结果，能实现细胞回收作业省力化，同时可以降低离心分离对细胞的损害。
(7) 将培养袋18内浓縮的细胞全部回收到安装在培养基盒20中的细 胞回收袋72中时，可以将该细胞回收袋72直接安装到离心分离机中进行细 胞回收，因此可以实现细胞回收作业的省力化。
(8) 振荡装置80的振荡机构91中的工作板85的突出部86对收容己 接种细胞的培养基的柔性的培养袋18进行反复按压，对该培养袋18内的培 养液进行搅拌，从而该培养袋18内的细胞的分布以及培养基的成分浓度可 以均一化，而且氧气供给能力也提高，由此可以促进细胞的增殖，可以提高 细胞的培养效率。此外，细胞仅在通过振荡装置80的工作板85反复按压而 被搅拌的培养液内悬浮，因此可以防止细胞受到损害。第2种实施方式(图18 图21)
图18是表示应用了本发明涉及的细胞培养用振荡装置的第2种实施方 式的培养单元以及细胞培养装置的结构(分化诱导状态)的布置图。图19 是表示图18的培养单元的分化诱导前状态的结构的布置图。该第2种实施 方式中，与所述第1种实施方式相同的部分用相同的符号标记，并省略说明。
该第2种实施方式的细胞培养装置100是将第1种实施方式的细胞培养 装置10中的细胞接种盒19 (图5)替换成预先添加了分化诱导因子的作为 分化诱导培养容器的分化诱导盒101。然后，在该细胞培养装置100中，通 过第二泵49的启动将培养基从培养基盒20的培养基袋67导入到培养袋18 中，进行细胞增殖，然后通过第一泵48的启动将该增殖的细胞导入到分化 诱导盒101中，对该细胞起作用，即，将该细胞分化。这里，分化是指使细 胞具有作为心脏细胞的作用或者具有作为肝脏细胞的作用等。使在培养袋18 中增殖的细胞在分化诱导盒101中分化之前，如图19所示，设置空盒102 来取代该分化诱导盒101，培养袋18内的使用后的培养基通过第一泵48的 启动经空盒102排出到培养基盒20的使用后的培养基袋68中。上述空盒102与空盒70 (图5)相同，仅起使培养基流动的流动通路的功能。
在第2种实施方式中，如图18所示，CCD照相机88每隔规定时间对 在分化诱导盒IOI内分化的细胞的图像进行照相。实施该照相的程序储存在 运转控制盘13的储存装置中。图像处理用计算机14将该细胞的图像进行二 值化处理或多值化处理，获得细胞形态的评价参数。用于实施获得该评价参 数的程序储存在图像处理用计算机14的储存装置中。图像处理用计算机14 从细胞形态的经时变化判断该细胞是否分化。接收到来自图像处理用计算机 14的信号的运转控制盘13控制通过该分化诱导盒101进行的分化诱导操作。 例如，在图像处理用计算机14判断该细胞存在分化可能性时，运转控制盘 13使分化诱导操作继续，而与此相反的不存在分化可能性的情况下，表示出 该结果。用于实施上述分化的判定的程序储存在图像处理用计算机14的储 存装置中，用于实施分化诱导操作的程序储存在运转控制盘13的储存装置 中。
然后，根据图20以及图21对通过上述细胞培养装置IOO进行的分化诱 导间歇式灌流培养工序进行说明。
首先，操作者在净化台等内将培养基和细胞添加到培养袋18中(图20 的S71)，该培养袋18通过载置台46载置在培养袋盘47上，将该培养袋盘 47安装在大盘45上(图20的S72)。然后，操作者将该大盘45搬入到恒温 槽11的、指示灯44显示为例如绿色的单独的罐16内。
然后，操作者在上述罐16内的大盘45中安装培养基盒20，并安装空盒 102 (图19)(图20的S73)。然后，由操作者将上述罐16的罐门31关闭， 开始在培养袋18内进行细胞的静置培养(图20的S74)。在上述静置培养 时，在原先培养袋18中培养液较少时，操作者启动倾斜电机76，使载置台 46的升降部下降，在培养袋18中形成储液部78 (图8)。
静置培养开始后，运转控制盘13启动第二泵49，将培养基从培养基盒20的培养基袋67流加到培养袋18中(图20的S75)。运转控制盘13根据 重量计43的测定值确认培养袋18内的培养液是否达到规定值a以上(图20 的S76)，重量计的测定值为上述规定值a以上时，启动倾斜电机76，使载 置台46的升降部上升，使培养袋18成为水平状态，消除储液部78 (图20 的S77)。
然后，运转控制盘13判断通过重量计43测定的培养袋18内的培养液 的重量是否为规定值b以上(图20的S78)，在达到规定值b以上的时刻启 动工作电机81，使振荡装置80工作，开始振荡培养(图20的S79)。接着， 运转控制盘13判断通过重量计43测定的培养袋18内的培养液的重量是否 为规定值c以上(图20的S80)，在达到规定值c以上的时刻停止第二泵49， 停止从培养基盒20的培养基袋67向培养袋18流加培养基，停止工作电机 81，停止培养袋18内的振荡培养(图20的S81)。
在培养袋18内细胞沉降后，运转控制盘13启动第一泵48，将培养袋 18内的使用后的培养基(培养袋18内的上清液)排出到培养基盒20的使用 后的培养基袋68中(图21的S82)。然后，运转控制盘13启动第二泵49， 将培养基从培养基盒20的培养基袋67流加到培养袋18中，启动工作电机 81，通过振荡装置80在培养袋18内实施振荡培养(图21的S83)。经过规 定时间后，运转控制盘13停止第二泵49，停止从培养基盒20的培养基袋 67向培养袋18流加培养基，停止工作电机81，停止培养袋18内的振荡培 养(图21的S84)。
运转控制盘13判断是否达到与增殖的细胞的使用时间相关的所希望的 培养期限，此外，图像处理用计算机14判断培养袋18内的细胞是否达到所 希望的细胞数(图21 的S85)。在判断培养袋18内细胞是否达到所希望的 细胞数时，运转控制盘13启动第三泵50，将培养袋18内的细胞的一部分转 移到空盒102，由CCD照相机对该细胞进行照相。图像处理用计算机14对该细胞的图像进行图像处理，判断细胞数是否达到规定值以上，并向运转控 制盘13传送信号。然后，运转控制盘13在未达到上述培养期限或细胞数时，
重复步骤S82至S85的处理操作。
上述步骤S81至S85为交替实施培养袋18内的使用后的培养基的排出 和向培养袋18内供给(流加)新的培养基的间歇式灌流培养。
这里，在步骤S77至S85中，运转控制盘13在根据重量计43的测定值 判断培养基盒20的培养基袋67中没有培养基的情况下，提醒操作者将培养 基盒20换成新的培养基盒20。在替换成新的培养基盒20时，运转控制盘 13暂时中断从培养基盒20到培养袋18的培养基的流加、和通过振荡装置 80进行的振荡培养，直至培养基盒20替换结束。在步骤S85达到所希望的 培养期限或者所希望的细胞数时，运转控制盘13启动第一泵48，将培养袋 18内的使用后的培养基排出到培养基盒20的使用后的培养基袋68中，根据 重量计43的测定值，将细胞浓縮至培养袋18内的培养液为约1/2-1/3 (图 21的S86)。
然后，通过运转控制盘13停止第一泵48后，操作者如图18所示，将 空盒102换成分化诱导盒101 (图21的S87)。
换成分化诱导盒101后，运转控制盘13启动第二泵49，将培养基盒20 的培养基袋67内的培养基流加到培养袋18中，启动工作电机81，通过振荡 装置80在培养袋18内进行振荡培养(图21的S88)。然后，运转控制盘13 启动第一泵48，继续进'行在培养袋18内的振荡培养以及来自培养基盒20 的培养基的流加，同时使培养袋18内的培养液向分化诱导盒101移动(图 21的S89)。由此，在该分化诱导盒101内开始分化诱导培养(图21的S90)。
运转控制盘13在上述分化诱导培养中每隔规定时间(例如6小时)通 过CCD照相机对分化诱导盒101内的细胞进行照相。图像处理用计算机14 对该照相得到的图像进行图像处理，获得细胞形态的评价参数，根据该细胞形态的经时变化，判断该细胞在分化诱导盒101内是否分化(S21的S91)。 运转控制盘13在接收到在步骤S91中通过图像处理用计算机14判断出 细胞分化的信号时，停止第二泵49、第一泵48以及工作电机81，停止分化 诱导培养，结束细胞培养(图21的S92)。该培养结束后，操作者通过在净 化台等内的细胞回收操作来回收分化诱导盒101内的细胞(图21的S93)。
按照上述构成的情况下，根据上述第2种实施方式，除了能达到与上述 第1种实施方式的效果(2) (6)以及(8)相同的效果(其中，细胞接 种盒19替换成分化诱导盒101)之外，还能达到如下的效果(9)。
(9) 对分化诱导盒101内的细胞的图像进行图像处理，获得细胞培养 的评价参数(细胞形态)，判断该细胞的培养状况(细胞是否分化)，实施与 该培养状况对应的培养操作(以规定的流加速度进行从培养基盒20向培养 袋18的培养基的流加和从培养袋18向分化诱导盒101的细胞转移的时间 等)，从而可以在非接触、非侵害的状态下判断细胞的培养状况，因此该细 胞不会受到损伤，可以避免取样引起的污染的危险性以及细胞的损失。此外， 可以减少操作者的劳动。而且， 一个患者的细胞在收容于单独的罐16内的 培养盒17的培养袋18中进行增殖，在分化诱导盒101中进行分化，因此可 以对各个患者的细胞实施适当的培养，可以避免交叉污染。
此外，根据上述第1种以及第2种实施方式中的细胞培养装置10以及 100，可以达到如下的效果(10)。
(10) 细胞培养装置10以及100都是在不同的培养环境下培养细胞的 多个培养容器中，将在一个培养容器中培养的细胞转移到下游侧的另一个培 养容器中。即，在细胞培养装置10中，在作为一个培养容器的细胞接种盒 19中通过诱导因子刺激细胞来进行增殖，然后，将上述细胞从该细胞接种盒 19转移到作为另一个培养容器的培养袋18中，使该细胞增殖。此外，在细 胞培养装置100中，在作为一个培养容器的培养袋18中增殖细胞后，将上述细胞从该培养袋18转移到作为另一个培养容器的分化诱导盒101中，使
该细胞分化。这样，通过细胞培养装置10以及100，可以扩大细胞的培养方 式的变化。
以上基于上述实施方式对本发明进行说明，但是本发明并不限定于此。
例如，在第1种、第2种实施方式中，图像处理用计算机14将CCD照 相机88的图像进行图像处理，算出评价参数，从该评价参数判定细胞的培 养状况(细胞的增殖可能性、细胞的增殖能力)，但是，运转控制盘13也可 以实施该图像处理用计算机14的功能。此外，通过CCD照相机88进行的 细胞图像的照相，也可以在培养袋18中进行。另外，在诱导因子刺激连续 式灌流培养工序(图16以及图17)中，在不实施通过振荡装置80进行的振 荡培养时，也可以在第二泵49和培养袋18之间不设置过滤器71。
此外，在第1种、第2种实施方式中，运转控制盘13以及图像处理用 计算机14控制一个恒温槽内的各罐，但是同样的恒温槽有多个，对于这些 恒温槽的各个罐，也可以由运转控制盘13以及图像处理用计算机14来控制。第3种实施方式(图22 图34)
图22是表示应用了本发明涉及的细胞培养用振荡装置的第3种实施方 式的培养单元以及细胞培养装置的结构图。图23是表示第3种实施方式涉 及的细胞培养装置200中的由一个空间上独立的培养室240和低温室230、 以及收容在该培养室240内的培养袋盘241和收容在低温室230中的培养基 袋盘231及废液袋盘232构成的培养单元212的结构的布置图。
图22中所示的细胞培养装置200是培养特别用于免疫细胞疗法中的悬 浮细胞的装置，包括具有多个(例如3个)培养单元212的培养装置210; 控制该多个培养单元212的运转的运转控制用PLC(可编程逻辑控制器)223; 用于处理细胞的图像的图像处理用单元221;收集所有的数据的数据收集装 置224;用于运转控制用PLC223和图像处理用单元221的信息显示以及控制输入的触摸屏222;通过集线器225与运转控制用PLC223、图像处理用 单元221、数据收集装置224连接，用于监视细胞培养装置200以及培养单 元212的监视用计算机226。上述运转控制用PLC223以及图像处理用单元 221作为控制设备起作用。多个培养单元212分别具有观察用照相机(CCD 照相机)302。
这里，作为上述悬浮细胞，公知有末梢血单核细胞、LAK细胞(淋巴 因子激活杀伤细胞)、神经干细胞、ES细胞等。这些悬浮细胞以下简称为细 胞。本细胞培养装置200也适用于培养除上述悬浮细胞之外的贴壁依赖性细 胞(例如，间充质干细胞)。
上述细胞培养装置200为将空间上、结构上独立的多个(例如3个)培 养单元212重叠而成结构，各个培养单元212如图23所示，分隔为低温室 230和培养室240。在该细胞培养装置200内收容有培养袋盘241、培养基袋 盘231以及废液袋盘232。培养袋盘241中，如后所述，载置有作为抗体刺 激以及增殖用培养容器的培养袋242，培养基袋盘231以及废液袋盘232中 分别载置有作为培养基储存设备的培养基袋(新培养基袋)233以及作为废 液储存设备的废液袋(废培养基袋)234。
上述培养单元212在培养室240以及低温室230中具有可开关的门(未 图示)。该培养单元212在门关闭的状态下，将培养室240内的环境(温度 以及C02浓度)维持在必要的环境中，用于进行细胞培养，且将低温室230 内的环境(温度)维持在最适合保存培养基的环境。
由此，在培养单元212中设置有温度传感器236、 243、 0)2传感器244、 门传感器(未图示)以及加热器(未图示)。而且，细胞培养装置200 (培养 单元212)经C02供给体系245，与设置在外部的储气瓶(未图示)连接。 来自温度传感器236、 243、 C02传感器244以及门传感器的信号传送到运转 控制用PLC223中。该运转控制用PLC223根据来自温度传感器236、 243的温度信号控制加热器，根据来自C02传感器244的C02浓度信号控制从储气 瓶向培养单元212供给的C02气体量。室内的C02通过循环泵246每次排出 预先确定的量。
搅拌风扇247的运转由运转控制用PLC223控制，打开培养单元212的 门的信号从门传感器传送到运转控制用PLC223时，搅拌风扇247的运转停 止，培养单元212内的环境变化缓和。
该细胞培养装置200具有干热灭菌功能，在分别设置了培养袋盘、培养 基袋盘、废液袋盘的状态下，能对装置内灭菌以及对各盘灭菌，可以防止培 养单元212内的细菌增殖。此外，各培养单元212分别构成独立的空间结构， 因此，与其它的培养单元212内的细胞相隔离，同时将收容在培养单元212 中的培养袋242、培养基袋233、废液袋234在净化台等内进行连接后，设 置在培养单元212中，从而收容在该培养单元212中的培养袋242可以确保 在密闭体系(非开放体系)中，可以防止培养袋242内的细胞被杂菌污染。
在培养单元212中，还设置有门传感器(未图示)、门锁传感器(未图 示)、温度传感器236、 243、门锁机构(未图示)、加热器(未图示)以及搅 拌风扇247。运转控制用PLC223根据来自温度传感器236、 243的温度信号 控制加热器。此外，运转控制用PLC223控制搅拌风扇247的运转，使空气 以及C02在培养室240内循环。由此，培养室240内维持在用于培养细菌的 最适当的环境。
此外，运转控制用PLC223控制门锁机构的操作，使得一个细胞培养装 置200中两个以上的培养单元212的门不会同时进行开的操作。由此，可以 防止在不同的培养单元212之间细胞和培养基等被取错放错的情况。该门锁 机构的锁定操作由门锁传感器检测出，并传送到运转控制用PLC223。此外， 培养单元212的门的开关状态由门传感器检测出，并传送到运转控制用 PLC223。在图23所示的培养单元212内的下部设置有支持收容在培养室240内 的培养袋盘241的框架250，该框架250支持设置在培养单元212上部的重 量计251。该重量计251是测定收容在培养室240内的培养袋盘241的培养 袋242的重量的设备，实际中，测定从培养基袋233供给到培养袋242的培 养基量以及测定从培养袋242排出到废液袋234中的废液量。该重量计251 的测定值也传送给运转控制用PLC223。此外，在培养单元212本体上，设 置有显示培养单元212内的培养袋242的有无的指示灯(未图示)。运转控 制用PLC223，在培养室240内收容有培养袋242时，使指示灯显示为例如 红色，而在培养室240内未收容培养袋242时，使指示灯显示为例如绿色。
这里对上述培养袋盘241进行说明。
该培养袋盘241如图23所示安装有培养袋242，该培养袋242为培养细 胞的培养容器。该培养袋242为使细胞表现功能的功能表现用培养容器(例 如使细胞增殖，使细胞分化等)，本实施方式中，是为了增殖而利用抗体来 刺激细胞的抗体刺激用培养容器。另外，该培养袋242也是在相同培养袋242 中用于增殖由抗体刺激后的细胞的增殖用培养容器。
培养袋242为收容已接种细胞的培养基的柔性的容器，通过载置台252 载置在培养袋盘241中。上述培养袋242例如为由氧透过性材质制作的袋。
这里对上述培养单元212进行说明。
如图23所示，在培养室240中设置有供给泵261、排出泵271。培养袋 242的一端侧用管262经供给泵261连接到供给系统接头264上。另外，培 养袋242的另一端侧用管272经排出泵271连接到排出系统接头274上。
在该培养单元212中，培养袋242通过管262与供给系统接头264连接， 同时通过管265与培养基袋233连接。此外，培养袋242通过管272与排出 系统接头274连接，同时通过管275与废液袋234连接。
如图23所示，上述培养袋242在培养袋242的与供给泵261连接的一部分底面内侧将抗体固定化，在该培养袋242中加入培养基，在该培养基中 接种细胞，将该培养袋242设置在培养袋盘241上，构成为盒结构。将抗体 在上述培养袋242上固定化，加入培养基以及细胞的作业在净化台等内的无 菌状态下实施。
通过在上述培养袋242中将一部分抗体固定化，可以在同一培养袋242 中作出由抗体刺激细胞而使该细胞表现出增殖功能的培养环境、和使细胞增 殖的培养环境。因此，向在培养袋242的一部分中受到抗体刺激并开始增殖 的细胞供给培养基，从而可以高效地在同一培养袋242中实施增殖。
在所述培养基袋盘231以及废液袋盘232中，分别载置有作为培养基储 存容器的培养基袋233、以及作为使用后的培养基储存容器的废液袋234， 构成盒结构。上述培养基袋233储存向培养袋242供给的培养基。此外，上 述废液袋234储存从培养袋242排出的使用后的培养基(上清液)。培养基 袋盘231构成为盒结构，从而在培养袋242保持在培养室240内的状态下， 仅通过在该培养单元212内的低温室230中安装培养基袋盘231，就能进行 培养基的交换、供给。
上述培养袋盘241可拆卸地安装在培养单元212上。此时，培养袋242 的供给系统接头264与培养基袋233的接头无菌结合，排出系统接头274与 废液袋234的接头无菌结合。即，供给系统接头264与培养基袋233的接头 的结合是，例如一方的橡胶装结合部中插入另一方的针状结合部，从而无菌 结合。排出系统接头274和废液袋234的结合也相同。将上述培养袋242与 培养基袋233以及废液袋234结合的作业在净化台等内的无菌状态下实施。
培养袋242、培养基袋233以及废液袋234如上所述进行连接，从而培 养袋盘231中的培养基袋233内的培养基可以通过供给泵261的启动而供给 到培养袋242中，该培养袋242内的使用后的培养基通过排出泵271的启动 而排出到废液袋盘232的废液袋234中，由此构成闭合循环。通过该闭合循环的结构，该系统(培养袋242、培养基袋233、废液袋234)保持在无菌状 态。
培养袋242内的培养(细胞增殖)包括静置培养(单纯流加)，其通 过启动供给泵261，将培养基袋盘231的培养基袋233内的培养基供给(流 加)到培养袋242中，使细胞增殖；灌流培养，其启动供给泵261以及排出 泵271 ，将培养袋242内的使用后的培养基排出到废液袋盘232的废液袋234 中，且将培养基袋233内的培养基供给到培养袋242中，从而使细胞增殖； 振荡培养，其使用后述的振荡装置290。其中，灌流培养包括交替实施使 用后的培养基的排出和培养基的供给的间歇式灌流培养；同时实施使用后的 培养基的排出和培养基的供给的连续式灌流培养。在该连续式灌流培养中， 通常在培养袋242和排出泵271之间的管272中设置有阻止细胞移动的过滤 器，可以防止培养袋242内的细胞排出到废液袋234中。
在培养袋242中的细胞增殖结束后，培养袋242内的使用后的培养基排 出到上述废液袋盘232的废液袋234中，该培养袋242内的细胞被浓縮。该 使用后的培养基的排出通过排出泵271的启动来实施，根据重量计251的测 定值，通过运转控制用PLC223的控制，实施排出，使得培养袋242内的培 养基以及细胞的容量为约1/2-1/3为止。通过该培养袋242内的细胞的浓縮， 可以减少随后实施的离心分离机的离心分离次数。
此外，废液袋盘232中，也可以将培养袋242中的细胞如上所述进行浓 縮后，将废液袋234替换成作为在离心分离机上可安装的细胞回收容器的细 胞回收袋，通过启动排出泵271，将在培养袋242内细胞被浓縮后的培养液 (培养基以及细胞)供给到该细胞回收袋内。此时，管272中未设置过滤器。 由此，离心分离机中可安装的袋中的细胞的回收可以在作为密闭空间的培养 单元212内实施，使得细胞回收作业省力化。
这里，如图23所示，培养袋盘241收容在培养单元212内，该培养袋盘241被培养室240的框架250支持。在该培养袋盘241上直接载置培养袋 242的载置台252包括不可升降的部分252a和可升降的多个连接的面积变化 部分252b、 252c。通过这些面积变化部分252b、 252c控制培养袋242的培 养面积。此外，在设置培养袋盘241上的面积变化部分252b、 252c的下方 位置设置有倾斜电机(升降机构)280、凸轮机构281以及定位传感器(未 图示)。上述倾斜电机280使凸轮机构281转动，使载置台252的上述面积 变化部分252b、 252c互相独立地进行升降。该升降部的位置由定位传感器 检测，并向运转控制用PLC223传送信号。倾斜电机280由运转控制用PLC223 控制，在培养袋242中的培养初期阶段，使载置台252的面积变化部分252b、 252c下降。由此，在与培养袋242的面积变化部分252b、 252c对应的部分 中形成储液部。例如，如图24所示的载置台252通过使面积变化部分252b、 252c的高度分别为上下的状态，可以使培养面积变成3段。另外，面积变化 部分也可以设置3个以上，由此可以对培养面积作更微小的调整。这里，图 24是表示图23的载置台252的结构的立体图。
在培养袋242中的培养初期阶段，细胞以及培养基储存在储液部，从而 可以保持适合抗体刺激的培养条件，即可以使培养袋242内的细胞密度保持 为适合增殖的密度。此外，在培养袋242内培养基以及细胞达到规定量以上 的培养中期以及后期，倾斜电机280通过凸轮机构281使载置台252的面积 变化部分252b、 252c上升，仅仅使培养袋242的规定面积部分成为水平状 态，从而使上述储液部的面积变化。随着培养的进行，通过使细胞以及培养 基的储液部的面积变化，培养袋242内的单位面积的细胞密度保持为适合增 殖的密度，在细胞增殖阶段能够高效地增殖细胞。
例如，如图24所示，在载置台252形成两段储液部时，首先将培养基 和细胞保持在最低的图24的面积变化部分252c的部分，细胞的密度不会降 低。在细胞开始增殖并培养基量增加时，图24的面积变化部分252c的高度上升一段，使面积变化部分252b和面积变化部分252c的高度相同，从而使 可培养的培养袋242的面积扩大一定量。由此，可以使适合再度增殖的细胞 密度保持一定时间。而且，在细胞增殖且培养基增加时，面积变化部分252b 和面积变化部分252c的高度再上升一段，与上述部分252a的高度相同，从 而可以在培养袋242整体上进行培养。
如图23所示，在培养室240内，在设置培养袋盘241的培养袋242的 上方位置设置有振荡装置290的振荡机构291作为按压设备。该振荡装置290 具有上述振荡机构291、工作电机292、凸轮机构293以及定位传感器(未 图示)。如图23所示，振荡机构291通过导杆250a在装置框架250上可上 下自由移动地设置有作为按压设备的工作板291a，且该工作板291a的底面 上突设有多个突出部291b。工作板291a通过工作电机292，在凸轮机构293 的作用下能向上方或者下方交替移动，从而该工作板29la的突出部291b反 复按压位于振荡机构291的下方的培养袋242，即反复对培养袋242进行按 压或者解除按压。由此，培养袋242内的培养基被搅拌，培养袋242内的细 胞在培养基内悬浮移动，在该培养袋242内的细胞分布以及氧气浓度分布均 一化，能够促进细胞的增殖。
此外，如图23所示，通过上述定位传感器检测工作板291a的位置，并 向运转控制用PLC223传送信号，而且根据重量计251的测定值通过该运转 控制用PLC223控制工作电机292。使用了上述振荡装置290的培养袋242 内的细胞培养(振荡培养)可以在培养袋242内充满培养基和细胞之前实施， 也可以在充满培养基和细胞之后实施。该振荡装置290根据工作板的检测位 置以及重量计251的测定值由运转控制用PLC223控制。
此外，如图23所示，在培养室240内，在设置将培养袋242的抗体固 定化的部位的位置的上方设置有照明灯301，并在下方设置有作为图像获得 设备的CCD照相机302。 CCD照相机302中，根据观察形态等，可追加使用镜头、棱镜、镜筒以及其它的光学设备。照明灯301从上方照亮培养袋242。 CCD照相机302从下方对培养袋242内的细胞照相，并获得该图像。这些 照明灯301的照明操作和CCD照相机302的照相操作由运转控制用PLC223 控制，每隔规定时间(例如6小时)获得培养袋242内的细胞的图像。各时 段的细胞图像储存在图像处理用单元221的图像储存电路(未图示)中。
上述图像处理用单元221将图像处理用单元221的图像储存电路中储存 的每隔规定时间的细胞图像进行图像处理，例如进行二值化处理或多值化处 理，并计算出单一细胞的投影面积的平均值、和作为单一细胞聚集后的细胞 聚集块的非单一细胞的增加速度，来作为细胞培养的评价参数。单一细胞的 投影面积的平均值(单一细胞的平均投影面积)是通过从将培养袋242安装 在培养袋盘241中并将该培养袋盘241收容在培养室240内进行培养开始， 经过例如24小时后的细胞图像计算得到的。
此外，上述是否为非单一细胞的判断可以以投影面积100ur^为基准， 投影面积为100un^以上时可以判断为非单一细胞，100111112以下时可以判 断为单一细胞。这是由于培养初期的单一细胞的投影面积均为100"1112以 下。从细胞的经时变化的图像(例如，从培养开始经过24小时、48小时、 72小时后的图像)计算出相对于所有细胞的非单一细胞的比例的变化，从而 算出非单一细胞的增加速度。将该非单一细胞的增加速度和上述单一细胞的 平均投影面积从图像处理用单元221输出到运转控制用PLC223。
运转控制用PLC223从单一细胞的平均投影面积算出延迟时间，推断该 细胞的增殖开始时间。这里，上述延迟时间是指将细胞接种到培养袋盘241 的抗体固化部上开始到开始增殖所需要的诱导期的时间。运转控制用 PLC223从细胞增殖开始时间判断该细胞的培养状况，即判断该细胞通过抗 体刺激有无增殖的可能性，并判定该细胞的优劣。根据该判定，运转控制用 PLC223对于增殖可能性明显低的细胞，终止在本细胞培养装置200中的培养。
此外，运转控制用PLC223从非单一细胞的增加速度计算出该细胞的最 小倍化时间。这里，上述倍化时间是指某一时刻的细胞的细胞数增加一倍所 需要的时间。运转控制用PLC223根据该最小倍化时间判断该细胞的培养状 况，即判断该细胞的增殖能力，确定将培养基流加到培养袋242中的时间和 流加速度等。
起控制设备的作用的运转控制用PLC223以及图像处理用单元221图中 未示，它们具有进行演算和控制的CPU、储存处理程序和数据的储存装置(存 储器)、以及将用于输入数据和命令等的键盘、鼠标或者触摸屏等的输入装 置与显示器等的输出装置进行连接的输入输出电路。而且，图像处理用单元 221还具有储存来自CCD照相机302的图像数据的图像储存电路。
在图像处理用单元221的储存装置中储存有程序，该程序将由CCD照 相机302每隔规定时间照相得到的培养袋242内的细胞的图像进行图像处理 (例如二值化处理或多值化处理)，算出细胞培养的评价参数(单一细胞的 平均投影面积、非单一细胞的增加速度)等。
此外，在运转控制用PLC223的储存装置中储存有根据细胞培养的评 价参数判断细胞的培养状况(细胞的增殖可能性、细胞的增殖能力)的程序； 根据细胞的培养状况，控制与细胞培养装置200以及培养单元212相关的设 备(例如，供给泵261、排出泵271等)，实施培养操作的程序。另外，在该 运转控制用PLC223的储存装置中还储存有如下的设备控制用程序该设备 控制用程序根据来自细胞培养装置200以及培养单元212的各种传感器的信 号，控制这些与细胞培养装置200以及培养单元212相关的设备。在图像处 理用单元221的储存装置中储存有每隔规定时间控制CCD照相机302来取 得细胞的图像等的设备控制用程序。
下面，通过图25至图34所示的流程图来说明通过运转控制用PLC223和图像处理用单元221实施上述程序来进行细胞培养的工序。
图25和图26表示抗体刺激间歇式灌流培养工序，是从培养袋242中回 收细胞的情况。首先，如图25所示，操作者在净化台等内将抗体在培养袋 242中固定化(图25的W01)，加入培养基，将接种有细胞的培养袋242安 装在培养袋盘241上。接着，操作者在净化台等内将加入有培养基的培养基 袋233安装到培养基袋盘231上，将废液袋234安装到废液袋盘232上，分 别通过供给接头264以及废液接头274将培养袋242与培养基袋233以及废 液袋234连接(图25的W02)。
然后，操作者将该培养袋盘241、培养基袋盘231以及废液袋盘232搬 入到细胞培养装置200的、指示灯显示为例如绿色的单独的培养单元212内， 培养袋盘241由培养室240的框架250支持，培养袋盘231以及废液袋盘232 设置在低温室230中。然后，操作者分别将培养袋242的泵管262、 272与 供给泵261以及排出泵271连接(图25的W03)。
然后，操作者确认收容在培养单元212内的培养袋242中的CCD照相 机302的图像输出(图25的W05)。在确认该图像输出之前，操作者启动该 培养单元212的倾斜电机280，使载置台252的面积变化部分252b、 252c 下降，在培养袋242上形成储液部(图25的W04)。然后，操作者通过该培 养单元212的重量计251 ，测定设置的培养袋242的重量。
然后，操作者关闭培养单元门，在该培养单元212内开始细胞的培养(图 25的W06)。由此，在培养袋242的储液部中，通过抗体刺激细胞进行增殖 (图25的W07)。该培养单元212的CCD照相机302每隔规定时间(例如 6小时)对培养袋242的储液部的细胞进行照相，图像处理用单元221根据 该照相图像计算出细胞培养的评价参数。运转控制用PLC223根据该评价参 数计算延迟时间，判断该细胞受抗体刺激后是否存在增殖的可能性，再算出 最小倍化时间，判定该细胞的增殖能力(图25的W08)。运转控制用PLC223在细胞从在培养袋242内受到抗体刺激开始经过规 定时间(例如24小时)仍未发现增殖的可能性的情况下，终止本细胞培养 装置200中的细胞培养(图25的W08')。运转控制用PLC223在判断培养 袋242内的细胞存在增殖的可能性时，根据该细胞的增殖能力，决定向该培 养袋242内流加培养基的流加速度和时间等。运转控制用PLC223根据该决 定启动供给泵261，将培养基袋盘231的培养基袋233内的培养基流加到培 养袋242中(图25的W09)。
通过该供给泵261的工作，在培养袋242内的规定面积的储液部中开始 细胞的静置培养(图25的WIO)。运转控制用PLC223判断由重量计251测 定的培养袋242内的培养基以及细胞的重量是否达到规定值a以上(图25 的Wll)，在达到规定值a以上浓度时刻，启动倾斜电机280，通过凸轮机 构281，将载置台252的面积变化部分252b、 252c上升，将培养袋242的规 定的面积成为水平状态，使储液部变化(图25的W12)。该工序反复进行直 至完全消除形成在载置台252上的段落差，使得培养袋242成为水平(图25 的W13)。
然后，运转控制用PLC223判断通过重量计251测定的培养袋242内的 培养基以及细胞的重量是否为规定值b以上(图25的W14)，在达到规定值 b以上的时刻启动工作电机292。由此，使振荡装置290工作，使振荡装置 290的振荡机构291反复按压培养袋242，开始振荡培养(图25的W15)。 接着，运转控制用PLC223判断通过重量计251测定的培养袋242内的培养 基以及细胞的重量是否为规定值c以上(图26的W16)。在达到规定值c以 上加时刻停止供给泵261 ，停止从培养基袋盘231的培养基袋233向培养袋 242流加培养基(图26的W17),停止工作电机292，停止培养袋242内的 振荡培养(图26的W18)。
在培养袋242内细胞沉降后，运转控制用PLC223启动排出泵271，如图11 (A)所示，将培养袋242内的使用后的培养基(培养袋242内的上清 液)排出到废液袋盘232的废液袋234中(图26的W19)。然后，运转控制 用PLC223判断通过重量计251测定的培养袋242内的培养基以及细胞的重 量是否为规定值d以下(图26的W20)，在达到规定值d以下的时刻，停止 排出泵271，停止从培养袋242排出使用后的培养基(图26的W21)。然后 启动供给泵261，将培养基从培养基袋盘231的培养基袋233流加到培养袋 242，启动工作电机292，通过振荡装置290在培养袋242内实施振荡培养(图 26的W22)。经过规定时间后，运转控制用PLC223停止供给泵261,停止 将培养基从培养基袋盘231的培养基袋233流加到培养袋242，在保持工作 电机292启动的状态下，继续振荡培养(图26的W23)。
运转控制用PLC223判断是否达到与增殖的细胞的使用时间相关的所希 望的培养期限，此外，图像处理用单元221判断培养袋242内的细胞是否达 到所希望的细胞数(图26的W24)。在未达到上述培养期限或细胞数时，重 复步骤W18-W23的处理操作。在测定细胞数时，暂时停止振荡装置290， 直至细胞沉降为止。然后，用CCD照相机302拍摄培养袋242内的图像。 图像处理用单元221从获得的图像推断、计算袋内存在的细胞数。
上述步骤W18-W23为交替实施培养袋242内的使用后的培养基的排出 和向培养袋242内供给(流加)新的培养基的间歇式灌流培养。
运转控制用PLC223在步骤W24中达到所希望的培养期限或者所希望 的细胞数时，如图26所示，停止工作电机292，停止在培养袋242内的振荡 培养(图26的W25)。然后，在培养袋242内的细胞沉降后，启动排出泵 271，将培养袋242内的使用后的培养基排出到废液袋盘232的废液袋234 中，根据重量计251的测定值，将细胞浓縮至培养袋242内的培养基以及细 胞为约1/2-1/3 (图26的W26)。
运转控制用PLC223随后停止排出泵271 ，终止细胞培养(图26的W27)。该培养结束后，由操作者将培养袋242内的细胞在净化台等内转移到离心分 离机用的容器中，然后通过离心分离回收细胞(图26的W28)。
然后，在同样的抗体刺激间歇式灌流培养工序中，图27以及图28显示 了包括通过细胞回收袋回收细胞的处理的情况。因此，表示该图27以及图 28所示的工序的步骤W31-W56与图25以及图26的步骤W01-W26相同， 因此省略说明。
图28所示的步骤W56中，通过排出泵271的启动将培养袋242内的细 胞浓縮，然后，运转控制用PLC223停止排出泵271，并提醒操作者将废液 袋盘232的废液袋234换成细胞回收袋(图28的W57)。该细胞回收袋为安 装在离心分离机中并能用于离心分离的袋。
将废液袋盘232的废液袋234换成细胞回收袋之后，运转控制用PLC223 启动排出泵271以及工作电机292。然后，通过振荡装置290振荡培养袋242 内部，同时将该培养袋242内的细胞与培养基一起转移到安装在废液袋盘 232中的细胞回收袋中(图28的W58)。运转控制用PLC223随后停止排出 泵271以及工作电机292，停止从培养袋242的细胞回收，终止细胞培养(图 28的W59)。该细胞回收结束后，由操作者将细胞回收袋安装在离心分离机 中，通过离心分离回收细胞(图28的W60)。
然后，通过图29以及图30说明抗体刺激连续式灌流培养工序。该图29 以及图30所示的抗体刺激连续式灌流培养工序中的步骤X01-X15与图25 以及图26的抗体刺激间歇式灌流培养工序中的步骤W01-W15相同，因此省 略说明。该抗体刺激连续式灌流培养工序中，培养袋242与排出泵271之间 设置有过滤器(未图示)。
运转控制用PLC223将培养基从培养基袋盘231的培养基袋233流加到 培养袋242，在培养袋242内的通过振荡装置290进行的振荡培养中，培养 袋242内的培养基以及细胞的重量为规定值c以上时(图30的X16)启动排出泵271，将培养袋242内的使用后的培养基排出到废液袋盘232的废液 袋234中。由此，连续式灌流培养在培养袋242内开始(图30的X17)，该 连续式灌流培养同时实施向培养袋242流加培养基和从培养袋242排出使用 后的培养基。此时，培养袋242内的细胞通过过滤器被阻止流动，从而不会 流动到废液袋234内。另外，在上述连续式灌流培养中，也可以同时实施通 过振荡装置290进行的振荡培养。
运转控制用PLC223判断是否达到与增殖的细胞的使用时间相关的所希 望的培养期限，此外，图像处理用单元221判断培养袋242内的细胞是否达 到所希望的细胞数(图30的X18)。在未达到上述培养期限或细胞数时，重 复步骤X17的连续式灌流培养。在测定细胞数时，暂时停止振荡装置290， 直至细胞沉降为止。然后，用CCD照相机302拍摄培养袋242内的图像。 图像处理用单元221从获得的图像推断、计算袋内存在的细胞数。
在步骤X18中达到所希望的培养期限或者所希望的细胞数时，运转控制 用PLC223停止供给泵261、排出泵271以及工作电机292，停止灌流培养 以及振荡培养(图30的X19)。然后，在培养袋242内的细胞沉降后，运转 控制用PLC223启动排出泵271，将培养袋242内的使用后的培养基排出到 废液袋盘232的废液袋234中，根据重量计251的测定值，将细胞浓縮至培 养袋242内的培养基以及细胞为约1/2-1/3 (图30的X20)。浓缩过程中停止 振荡装置是为了防止由于大量的细胞流入到管中而堵塞过滤器。
运转控制用PLC223随后停止排出泵271 ，终止细胞培养(图30的X21 )。 该培养结束后，由操作者将培养袋242内的细胞在净化台等内转移到离心分 离机用的容器中，然后通过离心分离回收细胞(图30的X22)。
然后，根据表示该工序的处理操作的图31以及图32来说明抗体刺激单 纯流加培养工序。该图31以及图32所示的抗体刺激连续式灌流培养工序中 的步骤Y01-Y15与图25以及图26的抗体刺激间歇式灌流培养工序中的步骤W01-W15相同，因此省略说明。
运转控制用PLC223判断通过重量计251测定的培养袋242内的培养基 以及细胞的重量是否为规定值c以上(图32的Y16)。在达到规定值c以上 的时刻停止供给泵261，停止从培养基袋盘231的培养基袋233向培养袋242 流加培养基，在工作电机292保持启动的状态下，继续振荡培养(图32的 Y17)。
运转控制用PLC223判断是否达到与增殖的细胞的使用时间相关的所希 望的培养期限，此外，图像处理用单元221判断培养袋242内的细胞是否达 到所希望的细胞数(图32的Y18)。在未达到上述培养期限或细胞数时，继 续振荡培养(Y18中No)。在测定细胞数时，暂时停止振荡装置290，直至 细胞沉降为止。然后，用CCD照相机302拍摄培养袋242内的图像。图像 处理用单元221从获得的图像推断、计算袋内存在的细胞数。
运转控制用PLC223在步骤Y18中达到所希望的培养期限或者所希望的 细胞数时，如图32所示，停止工作电机292，停止培养袋242内的振荡培养
(图32的Y19)，在培养袋242内的细胞沉降后，启动排出泵271，将培养 袋242内的使用后的培养基排出到废液袋盘232的废液袋234中，根据重量 计251的测定值，将细胞浓缩至培养袋242内的培养基以及细胞为约1/2-1/3
(图32的Y20)。
运转控制用PLC223随后停止排出泵271 ，终止细胞培养(图32的Y21 )。 该培养结束后，由操作者将培养袋242内的细胞在净化台等内转移到离心分 离机用的容器中，然后通过离心分离回收细胞(图32的Y22)。
然后，在同样的抗体刺激单纯流加培养工序中，包括由细胞回收袋回收 细胞的处理的情况在图33以及图34中表示，图33以及图34表示了该处理 操作。因此该图33以及图34所示的工序的步骤Y31-Y50与图31以及图32 的步骤Y01-Y20相同，因此省略说明。在如图34所示的步骤Y50中，通过排出泵271的启动将培养袋242内 的细胞浓縮后，运转控制用PLC223停止排出泵271，提醒操作者将废液袋 盘232的废液袋234换成细胞回收袋(图34的Y51)。该细胞回收袋为安装 在离心分离机中用于离心分离的袋。
废液袋盘232的废液袋234换成细胞回收袋之后，运转控制用PLC223 启动排出泵271以及工作电机292，通过振荡装置290振荡培养袋242内部， 同时将该培养袋242内的细胞与培养基一起转移到安装在废液袋盘232中的 细胞回收袋中(图34的Y52)。运转控制用PLC223随后停止排出泵271以 及工作电机292，停止从培养袋242的细胞回收，终止细胞培养(图34的 Y53)。该细胞回收结束后，由操作者将细胞回收袋安装在离心分离机中，通 过离心分离回收细胞(图34的Y54)。
按照上述构成的情况下，根据上述实施方式，起到如下的效果(1) (7):
(1) 图像处理用单元221将CCD照相机302照相得到的培养袋242内 的细胞的图像进行图像处理，获得细胞培养的评价参数(单一细胞的平均投 影面积、非单一细胞的增加速度)，运转控制用PLC223判断评价该细胞的 培养状况(细胞的增殖可能性以及增殖能力)，实施与该培养状况对应的培 养操作(以规定的流加速度将培养基从培养基袋233流加到培养袋242以及 流加的时间)。其结果，可以在非接触的状态下判断细胞的培养状况，因此 该细胞不会受到损伤。此外，由于操作者无须逐步实施培养操作，可以减少 操作者的劳动。而且， 一个患者的细胞接种到收容在单独的培养单元212内 的培养袋242中，由于对各个细胞实施与细胞的培养状况对应的培养操作， 从而可以实现适当的培养操作。通过实现与该细胞的培养状况对应的适当的 培养操作，可以进行按小时计算的培养操作，可以促进培养，縮短培养期限。
(2) 将培养基袋233、废液袋234以及培养袋242在净化台等内连接，并设置在培养单元212上，构成密闭体系，从而可以保持在完全密闭体系的
无菌状态。
(3) 将培养袋盘241、培养基袋盘231以及废液袋盘232在培养开始时 设置在培养单元212内，从而培养工序可以自动实施直至培养结束，因此， 可以降低环境变化对培养袋242内的细胞的损伤，同时可以省略在净化台等 内将培养基供给到培养袋242中的无菌操作。
(4) 培养袋242内的培养初期阶段的抗体刺激与细胞增殖在同一培养 袋242内进行，可以使在该培养袋242内储存细胞以及培养基的储液部以规 定的面积变化，从而培养中的单位面积的细胞密度可以维持在适于增殖的密 度，因而可以高效地使细胞增殖。
(5) 将培养袋242内的使用后的培养基排出到废液袋盘232的废液袋 234中进行储存，从而培养袋242内的细胞密度提高，实现浓縮，因此可以 减少用于细胞回收的离心分离操作次数。其结果，能实现细胞回收作业省力 化，同时可以降低离心分离对细胞的损害。
(6) 将培养袋242内浓縮的细胞全部回收到安装在废液袋盘232中的 细胞回收袋中时，可以将该细胞回收袋直接安装到离心分离机中进行细胞回 收，因此可以实现细胞回收作业的省力化。
(7) 振荡装置290的振荡机构291中的工作板291a的突出部291b对 收容已接种细胞后的培养基的柔性的培养袋242进行反复按压，对该培养袋 242内的培养基进行搅拌，从而该培养袋242内的细胞的分布以及氧气浓度 分布可以均一化，从而可以促进细胞的增殖，可以提高细胞的培养效率。
此外，细胞仅在通过振荡装置290的工作板291a反复按压而被搅拌的 培养基内悬浮，因此可以防止细胞受到损害。
实施例然后，参照图35对使用图7的振荡装置80的细胞培养的实施例进行说 明。这里，图35是表示将通过使用图7的振荡装置80的振荡方法进行细胞 培养的结果与通过现有的振荡方法进行的细胞培养的结果以及静置培养(不 进行振荡)的结果进行对比的图。在该图35中，横轴为培养时间(单位 小时)，纵轴为细胞数(单位106个)，图中，翻表示使用振荡装置80时的 培养结果，令表示现有的旋转式振荡装置的培养结果，參表示静置培养的培 养结果。
本实施例中按照如下的条件、顺序进行细胞培养。 艮P，首先从健康者获取末梢血，使用血细胞分离用比重液，分离出末梢 血单核细胞。
将1.0X 107个的得到的末梢血单核细胞悬浮到30ml的ALyS203培养液 (细胞科学株式会社)(含供体本身的血桨2.4ml)中，在固定化有抗CD3 抗体的悬浮细胞用75T-Flask (SUMILON)中进行接种，在37°C、 5%C02 的培养箱中进行培养(前培养)。
前培养进行3天，将培养至第4天的进入对数增殖期的细胞回收，将2.0 X10卩个细胞悬浮到350ml的新的ALyS505N培养液(细胞科学株式会社) (含供体本身的血浆3.5ml)中，并转移到350ml的培养袋(株式会社二7。 口制)中。准备3个内容物相同的该培养袋。
然后，对加入有细胞悬浮液的3个350ml的培养袋分别进行通过使用振 荡装置80的振荡方法的细胞培养、通过现有的旋转式的振荡方法的细胞培 养、以及静置培养，并将这些培养称为本培养。
这里，现有的旋转式的振荡装置设置成转速为30ipm，在转台上设置 网，从培养袋两面可以透过氧气。
此外，振荡装置80的转速设为30rpm，作为按压、解除按压培养袋的 突出部86，在振荡机构91上设置了 3个圆柱形的橡胶(直径30mm，高度20mm )。
在开始本培养的24小时、48小时、72小时后，从培养袋取2ml的培养 液(含培养基以及细胞)，测定细胞数，此时，如图35所示，与静置培养以 及使用现有的旋转式振荡装置的培养相比，使用振荡装置80的培养在进行 本培养72小时后细胞数较多。
权利要求
1、一种细胞培养用振荡装置，其特征在于，该装置具有按压设备，当在收容已接种有细胞的培养液的柔性的培养容器内培养细胞时，所述按压设备反复按压所述培养容器，通过该按压设备的按压来搅拌所述培养容器内的培养液。
2、 根据权利要求1所述的细胞培养用振荡装置，其特征在于，所述按 压设备具有多个突出部，并由这些突出部按压培养容器。
3、 根据权利要求1或2所述的细胞培养用振荡装置，其特征在于，所 述细胞为悬浮细胞。
4、 根据权利要求1至3中任意一项所述的细胞培养用振荡装置，其特 征在于，所述细胞用于免疫细胞疗法。
5、 一种细胞培养方法的振荡培养方法，其特征在于，该细胞培养方法 是用于在收容已接种有细胞的培养液的柔性的培养容器内培养细胞，该细胞 培养方法的振荡培养方法通过按压设备反复按压所述培养容器，搅拌该培养 容器内的培养液，来进行细胞培养。
6、 根据权利要求5所述的细胞培养方法的振荡培养方法，其特征在于， 所述细胞为悬浮细胞。
7、 根据权利要求5或6所述的细胞培养方法的振荡培养方法，其特征 在于，所述细胞用于免疫细胞疗法。
全文摘要
本发明提供了细胞培养用振荡装置，该细胞培养用振荡装置能防止对细胞的损害，同时能提高细胞的培养效率。振荡装置(80)、(290)用于在收容接种有细胞的培养液的柔性的培养袋(18)、(242)内培养细胞的细胞培养装置(10)、(100)、(200)，该振荡装置包括具有反复按压培养袋(18)、(242)的工作板(85)、(291a)的振荡机构(91)、(291)，并通过突设在上述工作板(85)、(291a)上的多个突出部(86)、(291b)的按压来对上述培养袋(18)、(242)内的培养液进行搅拌。
文档编号C12M1/02GK101300339SQ20068004081
公开日2008年11月5日 申请日期2006年11月1日 优先权日2005年11月1日
发明者幡多德彦, 有吉直子, 神宫司英雅 申请人:迈世耐特股份公司