植物的同源重组的制作方法

专利名称：：植物的同源重组的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及在植物中改变减数分裂同源重组频率和/或重组事件的染色体位置的方法，和测量干扰敏感性的减数分裂同源重组频率和/或重组事件的染色体位置细胞学分析。还提供了在所述方法中使用的新型蛋白质和编码MLH1蛋白的核酸序列，以及转基因植物和植物细胞。在进一步的实施方案中，提供了适用于产生它们的抗体和序列。
背景技术：
：植物和动物基因组的共同特征是都具有遗传连锁图，该图反映了基于重组频率(RF)确定的分子或表型标记物在染色体上或者连锁群内的位置。育种工作者使用这些遗传图来开发新植物和动物品种或者品系。然而，重组在染色体上的分布并不均匀，所以存在重组"热点，，，而染色体上的其他区域不发生重组("冷点")。例如，同源染色体之间的交换事件可能很少在着丝粒附近或者异染色质内发生。结果导致不可能产生这些区域的遗传组成发生改变的重组体，或者，需要有大量的植物才能在这些区域发现重组事件。因此，基因组某些部分的重组频率降低可严重阻碍育种进程，这是由于，例如，在所需要的等位基因附近的基因座位置上的不需要的等位基因很难被去除，导致染色体区域的共同遗传。该现象通常被称为"连锁累赘"或"遗传累赘，，，常见于等位基因从野生近缘种渗入栽培种之时。另外，经常需要产生大量的子代，以尽最大可能地发现具有所需性状和等位基因组合的重组体。为了帮助鉴别出合适的重组体，当前育种工作者通常使用分子标记物，例如基于PCR的标记物(如AFLP标记、SNP标记，如SNPWaveTM),这些手段有助于更加定向地筛选，能够快速筛选大量的子代，从而节省成本。通常，使用位于所研究的特定基因的侧翼的标记物来检测该基因是否存在。除了同源重组的频率，特别是减数分裂同源重组的频率是产生植抹的限制因素外，重组事件在染色体上的位置和分布也可为限制因素。因此，提高减数分裂同源重组频率的方法和改变重组事件的染色体位置或分布的方法将有益于植物育种，例如，用于除去连锁累赘和减小育种种群的规模(以及与此相关的成本)。增加或减少减数分裂同源重组还可用于增加某种作物的遗传变异。反之亦然，降低同源重组频率的方法能够使染色体和等位基因组合稳定地保持，这种保持是一旦获得性状的良好组合时所需要的。这些方法例如能够使串联的等位基因叠加，并保持它们的稳定。或者，可使用所谓的"反向育种"法重建交换的亲代基因组，见WO03/017753。然而，还没有可用于控制减数分裂交换的频率和位置的可靠方法，本发明的一个目的即是提供这样的方法。同源重组是一种在减数分裂过程中发生的现象，所述减数分裂发生于配子(的前体)形成之前，通过减数分裂过程，每个细胞的染色体数目减少，通常从二倍体变成单倍体。染色体加倍，并以两条染色单体(姐妹染色单体)进入减数分裂。在减数分裂前期I,在细线期，染色体浓缩形成长的细线。每条染色体获得一个由蛋白质构成的轴向元件，两条姐妹染色单体附着于该轴向元件上。在偶线期，同源染色体排列在一起，形成所谓的联会复合体(SC)。在粗线期，同源染色体的非姐妹染色单体可交换相对应的部分(重组)，形成交叉，继而形成重组染色体。随后的两次细胞分裂可产生配子(的前体)，它们每个均具有一个染色体组，这样，染色体组中就可能含有重组染色体。同源重组也发生于有丝分裂期间(在体细胞或营养细胞中)，但通常频率很低。为了开发影响减数分裂重组的方法，需要对减数分裂交换的频率和位置进行有效的分析。迄今为止，减数分裂同源重组的频率和分布的测量主要在遗传研究中使用标记物来进行，例如分子标记物(如AFLP、RFLP、微卫星、单核苷酸多态性)或表型标记物，或者使用电子显微镜通过超微结构细胞学分析来进行，如Sherman和Stack,1995(Genetics141:683-708)中所述。采用使染色体分散(染色体分散)上的重组节(RN)物理可见的超微结构细胞学分析，可生成显示RN频率和位置的图谱，并且该图语可用于估计整个基因组、整条染色体或者染色体部分中的交换率。这些方法费力且成本高，因此需要更简单的方法。例如，到目前为止，RN是通过使用电子显微镜观察粗线期二价体形式的联会复合体(SC)可见的(参见Sherman和Stack,同上，以及Andersonetal.2004，Genetics166，p1924)。另外，如果有超微结构细胞学分析的替代方法，遗传连锁图会与粗线期染色体图更容易地结合，如Andersn等人(2004;Genetics166:1923-1933)所述。另外，在多种真核生物中，越来越多的证据表明存在至少两种减数分裂交换，即干扰交换和非干扰交换。干扰(也称"交换干扰"或"交叉干扰")是指在真核生物中发现的这样一种现象，即一次染色体交换事件会影响其附近发生第二次交换的可能性。在多数生物中，一次交换的发生会以距离依赖性方式抑制另一次交换的发生，这样交换就会比随机分布时更加均匀地分布在染色体上(Jones，1984，Symp.Soc.Exp.Biol.38，293-320)。例如，Copenhaveretal.(2002，Genetics160，1631-1639)、Higginsetal.(2004，GenesDev.18，2557-2570)和Mercieretal.(2005，CurrentBiologyVol15，691-701)提供的证据支持这种假说拟南芥(爿m&V/0/w/s)中存在两种交换途径，只有一种表现出干扰。类似地，人和小鼠中似乎也存在两种交换途径(HousworthandStahl，2003，Am.J.Genet.73以及BromanandWeber,2000,Am.J.Hum.Genet.66:1911-1926)，而还有人提出在酵母中存在第三种途径(一种有害的交换途径)(Arguesoetal.2004，Genetics.168(4):1805-16)。据推测，在每一种途径中都有多种基因参与，主要是涉及减数分裂重组机制的基因，特别是涉及双链断裂修复的基因。这些数据正变得越来越复杂，特别是在植物中仍有诸多问题。比如在拟南芥的遗传研究中发现，等位基因附wJ突变体的减数分裂交换降低了75%,干扰类的交换特别地受到影响(Mercieretal.2005，同上)。迄今为止，还没有区分不同类型的交换(CO)途径的细胞学方法，径，已有^丄提出它们存在于植物中。本发明人惊奇地发现，使用某些种类的抗体可将代表干扰交换的RN和代表非千扰交换的RN区分开来，由此可开发出这样一种细胞学分析方法，这种方法只测量一种特定类型的RN，从而测定一种特定类型的交换，或者测量产生干扰交换和非干扰交换的两种途径对减数分裂重组的贡献的差异。在一个实施方案中，该发现在植物中使用抗MLH1抗体。MLH1同源物1)是一种参与细胞错配修复系统的蛋白质，它首先是从人体中分离出来的(hMLHl,Bronneretal.1994，Nature,368，258-261)。WO02/248卯描述了MLH1的稻直系同源基因，以及通过表达无活性MLH1蛋白或者通过沉默编码MLHl的内源基因来抑制植物细胞错配修复系统的方法。抑制细胞错配修复系统明显提高了诱变和非特异性重组事件的比例(参见第19页，第14-17行)。没有迹象表明，在植物中过表达功能性MLHl蛋白，特别是使用减数分裂特异性或减数分裂偏向性启动子来过表达功能性MLH1蛋白，可改变减数分裂同源重组(同源染色体对之间的重组)的频率和/或重组事件的分布及染色体位置。另外，没有迹象表明，使用野生型w狄/核酸序列难以实现过表达。该稻直系同源物只是另一种植物来源的MLH1蛋白，与Jeanetal.(1999.MolGenGenet262:633-343;编号AJ012747)描述的拟南芥MLHl蛋白具有66.6%的氨基酸同一性。通用定义本文中的"重组体"是指这样一种生物体，它所含有的一条或多条染色体具有与其两个亲本中任一个均不同的等位基因组合。因而，"重组植物"是指这样一种植物，它所含有的一条或多条染色体具有与亲代染色体不同的等位基因组合，特别是由于交换而产生。本文中的"一群重组植物，，是指使用本发明的转化植物而获得的一群植物，获得方法为使所述的转基因植物自交和/或杂交，并获得所述自交体和/或杂交体的种子。"交换，，或"互换，，是指染色体臂的相互交换，并且例如，在减数分裂前期I的晚期可以以交叉的形式见到。"同源重组"是指在减数分裂期间，同源染色体之间(如同源染色体的非姐妹染色单体之间)的相应位置的互相交换。同源重组也可发生在体细胞的有丝分裂过程中(体细胞交换)。"减数分裂同源重组"是指在减数分裂期间，发生于同源染色体的非姐妹染色单体之间的同源重组(与体细胞同源重组不同)。"同源染色体"是指一个细胞中外观和遗传信息相同或非常相似的染色体，它们在第一次减数分裂的前期(减数分裂前期I)配对。例如，在二倍体生物(2n)的体细胞或营养细胞中，每条染色体存在两个拷贝(同源物)，每条来自于一个亲本。"重组节"(RN)是在粗线期的中期到晚期位于联会复合体(SC)的中心区域的球形或椭圆形的亚显微结构，它与交换和交叉有关(参见Andersonetal.2004，Genetics166:第1924页，第一段)。基于每个SC的出现时间、大小、形状和数目，可以区分"早RN"和"晚RN"。晚RN在粗线期出现于联会复合体(SC)上发生交换的位点。与之相比，早RN从细线期到粗线期的早期与轴向元件和SC结合。一个晚RN代表两条同源非姐妹染色单体之间的一次交换事件，产生两条重组体和两条亲代染色单体。"配子，，是指减数分裂后获得的细胞，或者以这些细胞为起源的细胞，它们可与另一个配子融合形成合子，例如动物和植物的精细胞和卵细胞。在植物中，减数分裂后的4个细胞会进一步发育。在花药中，每个细胞形成一个花粉粒，花粉粒中有(营养)核和两个精细胞；在胚珠中，发育形成胚嚢，胚嚢由卵细胞和中央细胞构成，还常有反足细胞和助细胞。"重组频率"(RF)或"同源RF"是指每个细胞/核或者每条染色体或者一条染色体上每个确定的亚区中发生交换事件的平均次数。因此，需要测定多个细胞/核或者多条单个染色体的RF。"减数分裂同源重组频率"是指每条染色体或者减数分裂过程中每个细胞/核的平均RF。它可以如Sherman和Stack,1995(同上)所述，使用电子显微镜，通过计算每个细胞/核或者每条染色体的晚RN平均数目来测定。干扰交换和非干扰交换都包含在内，因为每个细胞中晚RN的数目等于每个细胞中所有交换的次数。RF也可在分离群体中，使用遗传标记物，如AFLP标记物、SNP或SSR来测定。"减数分裂干扰交换频率"是指每个细胞/核或者每条染色体中干扰交换的平均次数。它可使用例如本文所述的抗MLH1抗体，通过测定每个细胞/核或者每条染色体中的MLH1焦点(MLHl-foci)数目来测定。"重组频率改变"是指与对照相比，平均重组频率在统计学上显著增力口或减小。"减数分裂干扰交换频率改变"或者"干扰性减数分裂同源重组频率改变"是指减数分裂干扰交换的平均频率在统计学上显著增加或减小(见上文)。"干扰交换"既指干扰敏感性的交换，也指施加干扰的交换。本文中的"交换干扰"或"干扰"是指在减数分裂过程中，由于每次干扰交换会影响其附近发生另一次交换的可能性，从而导致交换在染色体上的非随机分布。减数分裂同源重组事件的"分布，，"位置"或"定位，，是指重组事件在细胞的一条或多条染色体上的物理位置。"分布改变""位置改变，，或"定位改变"是指重组事件的物理位置的相对变化，不一定会影响重组频率。本文使用的术语"等位基因，，是指在特定基因座的一个基因的一种或多种变化形式中的任意一种，在特定基因座的所有等位基因都涉及同一个性状或特征。在生物体的二倍体细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置，或者说基因座中。两条同源染色体的每一条上存在一个等位基因。在二倍体植物种类中，同源染色体上的对应的基因座可能具有不同的等位基因。"转基因植物"或"转化的植物"在本文中是指已经使用嵌合基因转化的植物或植物细胞。所述的嵌合基因可以整合也可以未整合到植物的基因组中。在一个优选的实施方案中，所述的嵌合基因没有整合。转基因植物细胞可以指分离的或者组织培养中的植物细胞，或者植物中或者分化的器官或组织中所含的植物细胞，两种可能都特别地包含于本文中。因此，在说明书或权利要求中提到植物细胞时，不仅指分离的细胞或者培养的原生质体，也指任何植物细胞，不管它位于何处，或者存在于什么植物组织或器官类型之中。术语"核酸序列"(或者核酸分子)是指单链或双链形式的DNA或RNA分子，特别指编码本发明的蛋白质或蛋白质片段的DNA分子。"分离的核酸序列"是指不再存在于分离它的天然环境中的核酸序列，例如细菌宿主细胞或者植物细胞核或质体基因组中的核酸序列。术语"蛋白质"或"多肽"可互换使用，它们是指由氨基酸链构成的分子，而不管具体的作用方式、大小、三维结构或者来源。因而蛋白质的"片段"或"部分"仍然可以被称为"蛋白质"。"分离的蛋白质"用于指不再存在于其天然环境中的蛋白质，例如在体外或者在重组的细菌或植物宿主细胞中。术语"基因"是指这样一种DNA序列，它含有在细胞中可被转录为RNA分子(如mRNA)的区域(转录区)，该区域与适当的调控区域(如启动子)有效连接。因此，一个基因可包含几个有效连接的序列，例如启动子、5，前导序列(包括例如参与翻译起始的序列)、(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA)以及3，非翻译序列(包括例如转录终止位点)。"嵌合基因"(或重组基因)是指任何一种这样的基因，它在一个物种中通常情况下并不天然存在；特别指这样一个基因，其中核酸序列的一个或多个部分在天然状况下并不彼此结合。例如，启动子与转录区的部分或全部或者与另一个调控区在天然状况下并不结合。术语"嵌合基因"被理解为包括这样的表达构建体，其中启动子或转录调控序列与一个或多个编码序列或者与反义序列(有义链的反向互补序列)或反向重复序列(有义序列和反义序列，从而使RNA转录物一旦转录就形成双链RNA)有效连接。"基因的表达"是指一个DNA区域转录成RNA的过程，其中所述DNA区域与适当的调控区域(特别是启动子)有效连接，所述RNA具有生物活性，即能够翻译成生物活性蛋白质或肽(或活性肽片段)，或者其本身是具有活性的(如转录后基因沉默或RNAi)。编码序列优选为有义方向，并且编码所需的生物活性蛋白质或肽，或者活性肽片段。在基因沉默方法中，DNA序列优选以反义DNA或反向重复DNA的形式存在，包括靶基因的反义或者有义和反义方向的短序列。"异位表达"是指该基因在通常不表达它的组织中表达。"转录调控序列"在本文中被定义为能够调节与该转录调控序列有效连接的(编码)序列的转录率的核酸序列。因此，本文中定义的转录调控序列包括启动转录(启动子元件)、维持和调节转录(包括例如弱化子或增强子)所需的所有序列元件。虽然该定义多数情况下是指编码序列上游(5，)的转录调控序列，但也包括存在于编码序列下游(3，)的调控序列。本文使用的术语"启动子"是指这样一种核酸片段，它可控制一个或多个基因的转录，位于该基因的转录起始位点的转录方向的上游，其结构特征是存在DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他的DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点、阻抑和激活蛋白结合位点，以及本领域技术人员所知的任何可直接或间接地调节该启动子转录的量的核苷酸序列。"组成型，，启动子是在多数组织中，在多数生理和发育条件下都有活性的启动子。"诱导型"启动子是受生理(如外部施加某些化合物)或发育调控的启动子。"组织特异性"启动子只在特定类型的组织或细胞中有活性，而"组织偏向性"启动子偏向于但不专门在某些组织或细胞中有活性。"在植物或植物细胞中有活性的启动子，，是在植物细胞中能够启动转录的启动子。"减数分裂相关的启动子"或"减数分裂偏向性启动子"是指主要在减数分裂期间或者在减数分裂部分期间，优选在减数分裂的较早阶段(如前期I的较早阶段到中间阶段)有活性的启动子。优选地，该启动子在体细胞或者减数分裂后的细胞中没有活性或者仅有非常弱的活性。"减数分裂特异性启动子，，只在减数分裂期间或者减数分裂部分期间有活性。"前期的较早阶段"是指减数分裂前期I的细线期和偶线期的较早阶段，而"前期的中间阶段"是指减数分裂前期I的偶线期的较晚阶段和粗线期阶段。本文使用的术语"有效连接"是指多核苷酸元件在功能关系上的连接。当一个核酸与另一个核酸序列具有功能关系时，即为"有效连接，，。例如，若一个启动子，或者说一个转录调控序列可影响一个编码序列的转录，那么它与该编码序列是有效连接的。有效连接是指所连接的DNA序列通常是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的时候，所连接的DNA序列是连续的并且位于读框内，以产生"嵌合蛋白质"。"嵌合蛋白质"或"杂合蛋白质"是由不同的蛋白质"结构域"(或基序)构成的蛋白质，它本身并不天然存在，但连接起来可形成功能性蛋白质，并表现各连接的结构域的功能(例如DNA结合或抑制，实现显性负功能)。嵌合蛋白质还可为天然存在的两种或多种蛋白质的融合蛋白质。本文使用的术语"结构域"是指蛋白质的具有特定结构或功能的任何部分或区域，它可转移至另一种蛋白质中，以形成至少具有该结构域的功能特征的新的杂合蛋白质。术语"靶肽"是指这样的氨基酸序列，它们可将蛋白质靶向至胞内细胞器，例如质体，优选叶绿体、线粒体，或者靶向至胞外空间(分泌信号肽)。编码靶肽的核酸序列可与编码蛋白质氨基末端(N末端)的核酸序列(框内)融合。"核酸构建体"或"载体"在本文中被理解为指通过使用重组DNA技术而获得的人工核酸分子，它用于将外源DNA送递至宿主细胞中。载体骨架可为例如本领域7>知的以及本文其他部分记载的二元或超二元载体(参见例如US5591616、US2002138879和WO9506722)、共整合载体(co-integratevector)或者T-DNA载体，其中整合了嵌合基因，或者在已经存在适当的转录调控序列的情况下，就只在该转录调控序列的下游整合一段所需的核酸序列(例如编码序列、义序列或反向重复序列)。载体通常包括其他遗传元件以帮助将它们用在分子克隆中，例如选择性标记物、多克隆位点等等(见下文)。术语"宿主细胞"或"转基因宿主细胞"或"转化的细胞，，是指在所述细胞中已经引入至少一种核酸分子而获得的新的个体细胞(或生物)，所述核酸分子特别包括编码所需蛋白质的嵌合基因，或者转录时产生反义RNA或反向重复RNA(或发夹RNA)以沉默耙基因/基因家族的核酸序列。宿主细胞优选植物细胞。宿主细胞可含有核酸构建体作为染色体外的(游离型)复制分子，或者在一个实施方案中，含有整合到宿主细胞核基因组或质体基因组中的嵌合基因。术语"选择性标记物"是一个本领域技术人员很熟悉的术语，本文中用于描述任何一种这样的遗传实体，它在表达时，可用于选择出含有该选择性标记物的一个或多个细胞。选择性标记基因产物产生例如抗生素抗性，或者更优选地，除草剂抗性，或者其他的选择性状，例如表型性状(例如色素沉着发生改变)或营养需求。术语"报告物"主要用于指可见的标记物，例如绿色荧光蛋白(GFP)、eGFP、萤光素酶、GUS等。本文中，基因或蛋白质的"直系同源物"是指在其他物种中发现的同源基因或蛋白质，它与所述的基因或蛋白质具有相同的功能，但(通常)从带有该基因的物种发生分歧的时间点开始序列即发生分歧(即这些基因在物种形成中从共同祖先进化而来)。因而，番茄///^基因的直系同源物可在其他植物物种中，基于序列比较(例如基于整条序列或特定结构域上的序列同一性百分比)以及功能分析来鉴别。200680041296.5说明书第10/49页术语"同源的"和"异源的"是指核酸或氨基酸序列与其宿主细胞或生物体之间的关系，特别是在转基因生物的情况下。因此，同源序列天然存在于宿主物种中(例如使用番茄基因转化的番茄植林)，而异源序列在天然情况下不存在于宿主细胞中(例如使用来自马铃薯植林的序列转化的番茄植林)。根据上下文，术语"同源序列"或"同源的"也可指来自共同的先祖序列的序列(例如它们可以是直系同源物)。"严格的杂交条件"可用于鉴别核苷酸序列，所鉴别的核苷酸序列与给定的核苷酸序列基本相同。严格的条件是序列依赖性的，并因环境不同而不同。通常，在确定的离子强度和pH条件下，所选的严格的条件为比特定序列的热解链点(Tm)低大约5。C。Tm为(在确定的离子强度和pH条件下)50%的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。通常，所选的严格条件为在pH7时盐浓度为大约0.02摩尔，温度至少60°C。降低盐浓度和/或提高温度会提高严格性。RNA-DNA杂交(使用例如100nt的探针进行的RNA印迹)的严格条件例如包括在63n至少一次用0.2XSSC洗涤20min,或等同条件。DNA-DNA杂交(j吏用例如100nt的探针进行的DNA印迹)的严格条件例如包括在至少50°C(通常大约55。C)的温度下，至少一次(通常2次)用0.2XSSC洗涤20min，或等同条件。另参见Sambrooketal.(1989)和SambrookandRussell(2001)。"序列同一性"和"序列相似性"可使用总体或局部比对算法，通过两个肽或两条核苷酸序列的比对来确定。当序列(通过例如GAP或BESTFIT程序，使用默认参数进行最优比对)共有至少某一最低序列同一性百分数(如下文所限定)时，那么该序列就可以被称为"基本相同"或"基本相似"。GAP使用Needleman和Wunsch的总体比对算法，在全部长度上比对两条序列，使匹配数尽量大，而使空位数尽量小。通常使用GAP默认参数，空位创建罚分(gapcreationpenalty)=50(核苷酸)/8(蛋白质)，空位延伸罚分(gapextensionpenalty)=3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白质，使用的默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992，PNAS89，915-919)。序列比对和序列同一性百分数评分可使用计算机程序确定，例如GCGWisconsinPackage,Version10.3，它购自AccelrysInc.,9685ScrantonRoad,SanDiego，CA92121-3752,美国。还可使用EmbossWinversion2.10.0，利用程序"needle"(它与GAP对应)，参数与上述的GAP相同。或者，相似性或同一性百分数可通过搜索数据库，例如FASTA、BLAST等来进行。在本文件及其权利要求中，动词"包括"及其变化形式以其非限制性意义使用，表示该单词后面的项目被包括在内，但没有具体提及的项目不被排除。另外，使用不定冠词"一"或"一个"提及某一要素时并不排除存在多于一个该要素的可能性，除非上下文明确要求有且只有一个该要素。因此，不定冠词"一"或"一个"通常表示"至少一个"。还应理解，当本文提及"序列"时，通常是指具有特定亚单元(如氨基酸)序列的实体物理分子。"植物"指整林植物或植物部分，例如可从该植物获得的细胞、组织或器官(例如花粉、种子、配子、根、叶、花、花芽、花药、果实等)，以及它们中任一种的衍生物和通过自交或杂交由该植物获得的子代。"植物细胞"包括原生质体、配子、悬浮培养物、小孢子、花粉粒等，既可以是分离的形式，也可以是在组织、器官或生物体内。术语"抗体"包括抗体的抗原结合形式的指代物(如Fab、F(ab)2)。术语"抗体"通常指基本由一个或多个免疫球蛋白基因编码的多肽或其片段，它可特异性结合和识别分析物(抗原)。然而，虽然各种抗体片段可根据完整抗体的消化方法来定义，但技术人员能够理解，这些片段可采用化学方法或者利用重组DNA方法从头合成。因而，本文使用的术语抗体还包括抗体片段，例如单链Fv、嵌合抗体(即包括来自不同物种的恒定区和可变区)、人源化抗体(即包括来自非人类来源的互补决定区(CDR))和异源缀合抗体(例如双特异性抗体)。术语"抗原"包括这样一种物质的指代物，针对它可产生抗体，并且/或者该抗体可与之发生特异性的免疫反应。抗原内的特异性免疫反应位点被称为表位或抗原决定簇。这些表位可为单体在聚合组合物中的线性排列一一正如氨基酸在蛋白质中的排列一一或者由更复杂的二级或三级结构构成，或者包括更复杂的二级或三级结构。"丄j;co/ws7VwiescM,e"似附(番薪)"已被正式更名为5Wa""附/F^7emV"附(番茄)，但非正式名称仍在4吏用。在本文中，这些名称具有相同含义。具体实施例方式制备本发明的转基因植物和重组体的方法在本发明的一个实施方案中，提供了一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物与非转基因植物或其他对照植物(例如用对照载体转化的植物)相比，同源重组频率发生改变。现已惊人地发现，在适当的启动子的调控下，过表达编码活性MLH1蛋白质的核酸序列可导致减数分裂同源重组频率发生改变(或修改)。根据启动子的选择，可实现重组频率的各种改变，这将在下文详细叙述。在一个优选的实施方案中，通过在植物活性启动子的调控下表达编码MLH1蛋白的cDNA或基因组DNA，可实现减数分裂同源重组频率的显著升高或显著降低。优选地，所使用的启动子在植物细胞中至少在减数分裂过程中是有活性的，或者是减数分裂偏向性的或减数分裂特异性的(定义如上)。这样的启动子包括例如参与减数分裂的基因的启动子，如W098/2843中所述的AtDMCl启动子、HvDMCl启动子或者LeDMCl启动子，或者从其他植物物种中获得的DMC1启动子。也可使用其他发育调控或者诱导型启动子，这将在下文进一步叙述。减数分裂同源重组频率的显著改变(升高或降低)可通过本领域公知的方法测定，例如细胞学分析，如用电子显微镜观察每个细胞中晚RN的(平均)数目的研究，或者使用标记物通过遗传学研究进行。本文中，"显著改变"(升高或降低)优选为与对照相比较，改变了至少0.5%、1%、2%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多(如100%)。在一个实施方案中，干扰性减数分裂同源重组频率显著改变，优选显著升高或降低。干扰性减数分裂同源重组增加可能导致减数分裂同源重组在整体上显著增加，或者可能导致非干扰性减数分裂同源重组同时减少，而不显著影响减数分裂同源重组的总频率。因而，干扰性与非干扰性减数分裂同源重组的比例可能与非转基因植物物种中的相比有所改变。例如，在非转基因樱桃番茄中，发现该比例大约为70:30。通过过表达MLH1蛋白质，该比例可被改变为任何其他比例，例如0:100、IO:卯、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、80:20、90:10、100:0。干扰性减数分裂同源重组频率的改变可使用多克隆或单克隆抗MLH1抗体进行确定，在实施例和下文所述的细胞学分析中，将所述的抗MLH1抗体与减数分裂染色体分散相接触，或者与暴露了核染色体的样本相接触。然后，抗MLH1标记的焦点(即抗体标记的晚RN)的数目可通过检测标签来进行评估，所述标签优选为荧光标签，可由免疫荧光光学显微镜或免疫电子显微镜来检测，并可通过图像分析来定量。通过确定干扰性重组频率和总重组频率的差别，可计算出干扰性/非干扰性减数分裂同源重组的比例，以及它们与总体的比例。参见实施例。例如，野生型樱桃番茄每条染色体平均大约有1.82个RN,每个核(12条染色体)总共大约有21.89个RN。这总共的RN中，大约70%的RN(大约15.36个RN/核)代表干扰交换，而余下的30。/。RN代表非干扰交换。在另一个实施方案中，提供了一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物的减数分裂同源重组事件在一条或多条染色体上的分布或位置有所改变。位置的改变可与重组事件频率变化同时发生，或者，减数分裂同源重组频率不变，或干扰性减数分裂同源重组频率不变。分布变化可导致例如某种染色体上的RN数目比正常情况下出现于所述染色体上或者染色体区段或染色体臂上的RN数目更多(例如多于2、3、4、5或更多个RN)，而其他染色体可能具有较少的数目(例如没有RN)。为检测RN在染色体上的位置，优选采用使用三种类型抗体的细胞学分析，即一种抗体标记晚RN和干扰交换(例如抗MLH1抗体)，一种抗体检测联会复合体的轴向元件(例如抗SMC1或抗SMC3抗体)，一种抗体标记着丝粒区域(例如抗CENP-C抗体)。这样即可测量染色体长度，鉴别染色体，以及对单条染色体上的着丝粒和RN进行定位。产生具有上述变化的转基因植物的方法包括首先，使用与植物细胞活性启动子有效连接的、编码MLH1蛋白的核苷酸序列转化植物或植物细胞，其次，再生一种植物。在一个实施方案中，所述核苷酸序列优选不整合到植物基因组中，但保留在细胞内的游离单元上。在另一个实施方案中，嵌合基因稳定地整合到基因组中。两种类型的转化体都可使用已知的方法产生。例如，如果使用农杆菌(爿g/Y^i"en7/附)介导的转化，并且在转化载体的嵌合基因的每一侧都存在左右边界序列，则会发生与基因组的整合。编码MLH1的核酸序列不整合到基因组的优点在于，它在以期望的方式使减数分裂同源重组发生变化以后，又可通过选择出缺少该游离单元的子代来容易地除去。再生的转基因植物随后可用于制备另一种植物或者一群(或多林)植物(或植物种子)，并任选地，使用各种标准从中选出一林或多林植物。例如，可以选择这样一种植物，它在两个先前紧密连锁的基因座(loci)之间发生了重组事件，现在该连锁被破坏。这样，就可鉴别和/或选择出罕见重组体供进一步使用。因此，该转基因植物可用作父本或母本与同种的另一植林杂交，它可以自交，或者该植林的细胞可用于从它再生其他植林。杂交或自交的子代可包含更多或更少的重组体，并且/或者每条染色体或每个染色体组的重组位点的分布可发生变化。因此，本发明的方法还提供了一种制备一群重组植林(或一群种子)的方法，它们与对照群相比较，重组体的数目发生变化和/或重组事件的分布发生变化。如果重组频率降为零，则"重组体"事实上已经不是真正的重组体，而是与亲代植林相同。本发明的这些植物还可在育种方法等中进一步使用或者使用分子方法进行分析。特别让人感兴趣的是鉴别罕见重组体，例如染色体冷点重组或者两个通常难以由重组分开(连锁累赘)的所研究的基因之间发生的重组。如果w/Z^转基因仍然存在于一些子代中，那么它可以使用本领域公知的例如flp/frt或cre/lox重组系统来去掉或除去。或者，如果该转基因存在于游离单元中，那么它可以通过选择出缺少该单元的植林/细胞来除去。核酸和氨基酸序列，嵌合基因和载体任何编码活性MLH1蛋白或蛋白变体或片段的核酸序列可用于制备嵌合基因、载体以及转化的植物或植物细胞。活性MLH1蛋白是在体内细胞中显示MLH1活性的蛋白质，即它具有生物活性，从而能够改变转化的植物中的减数分裂同源重组(频率和/或分布)。生物活性(或生物功能)可使用多种已知的方法测定，例如，如实施例所述产生过表达该基因的转化植物，并使用例如本文所述的细胞学分析，分析同源重组频率相对于对照植物是否发生了变化。生物活性还可通过测定蛋白质错配修复活性来测定。这些方法为本领域技术人员所熟知，包括但不限于体外错配修复分析、体外错配切除分析、硝酸纤维素滤膜结合分析、凝胶迁移率变动分析、解螺旋酶分析和体内诱变物分析等等。参见WO02/248卯。应该理解，在任何转化实验中，都能观察到转化体表型的一定程度的变异，这通常是由于基因组中的位置效应和/或由于拷贝数目引起的。技术人员应该知道如何将转化体进行相互对比，例如通过选择单拷贝数目事件，并对它们进行分析。确定或证实体内基因/蛋白质功能的其他方法包括产生敲除突变体或进行短暂表达研究。启动子-报告基因表达研究也可提供关于时空表达模式和蛋白质作用的信息。一些编码MLH1的核酸序列已经被克隆，例如拟南芥(Jni6/^/w/sA"/,Vm<i)和稻的核酸序列(WO0224890),它们是可以获得的仅有的两种全长植物序列。从许多其他植物物种中已经鉴别出了MLH1蛋白的片段，它们可用于分离全长序列。另外，本文提供了SEQIDNO:1(野生型番茄丄e附狄7序列)和SEQIDNO:2(SEQIDNO:1的表达优化)和SEQIDNO:3(番茄的LeMLHl氨基酸序列)。由于遗传密码的简并性，本文还提供了编码SEQIDNO:3蛋白质的其他的核酸序列。编码功能性MLH1蛋白或蛋白片段的这些序列，以及变体和片段(参见下文)，用于优选的实施方案中，特别是用于转化茄科(&/mi"fle)植物，特别是茄属(5W"w"附)植物(在本文中"茄属，，包括番茄属(Z^copwVwi))，尤其是番痴种。其他推测性的编码MLH1的核酸序列可通过计算机模拟来鉴别，例如通过在现有的核酸或蛋白质数据库(如GENBANK、SWISSPROT、TrEMBL)中鉴别核酸或蛋白质序列，并且可使用标准的序列分析软件，例如序列相似性搜索工具(BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLAST、FASTA等)。特别理想的是对植物序列数据库，例如小麦基因组数据库等进行筛选，以确定是否存在编码MLH1蛋白的氨基酸序列或核酸序列。然后可以选择出推定的氨基酸序列或核酸序列，克隆或从头合成，并通过例如在宿主或宿主细胞中过表达来测试其体内功能。如下文所述，使用已知的附//^序列来设计(简并)引物或探针，可鉴别出更多的序列。因此，原则上，任何编码MLH1蛋白的核酸序列(cDNA、基因组DNA、RNA)都可使用。还包括附狄/核酸序列的变体和片段，例如在所限定的严格的杂交条件下，与w/Z^核酸序列(例如丄e附狄/)杂交的核酸序列。附狄7核酸序列的变体包括这样一些核酸序列，在使用GAP程序以全长序列进行配对比对测定时，它们与SEQIDNO:1(丄e附狄/)和/或SEQIDNO:2(优化的丄e/w伙/)的序列同一性为至少50%或更多，优选至少55%、60%、70%、80%、卯％、95%、99%、99.5%、99.8%或更多。这样的变体也可称为与SEQIDNO:l和/或2"基本相似"。片段包括上述附狄7核酸序列的部分，它们可例如用作引物或探针，或者用于基因沉默构建体中。部分可为至少15、20、21、100、200、450、500、1000或更多核苷酸长度的连续延伸。优选地，附伙J核酸序列为植物来源(即它们天然存在于植物物种中)或者为经修饰的植物序列。很明显，很多方法可用于鉴别、合成或分离附狄7核酸序列的变体或片段，例如核酸杂交、PCR技术、计算机模拟分析和核酸合成等等。因此，编码MLH1的核酸序列可为化学合成的序列或者从任何生物体(例如植物、动物、真菌、酵母)克隆的序列，但优选使用植物序列，更优选将来自特定植物物种的序列重新引入所述物种(任选地先进行序列修饰，例如密码子选择优化)。因此，在一个优选的实施方案中，附狄7DNA对应于转化所用宿主物种的内源性w//^DNA,或者为该内源性附//^DNA的修饰体/变体。因而，优选将番痴附/WcDNA或基因组DNA(或其变体或其片段)用于转化番茄植物。因为野生型丄ew//^核酸序列的克隆和载体构建由于存在多个不同的限制位点而非常困难，所以优选的实施方案是对野生型核酸序列进行修饰，以使那些不需要的限制位点被除去，而核苷酸序列到氨基酸的翻译保持相同。因此，例如，可将不同限制酶的一个、两个、三个或多个识别位点除去/改变，以便能够克隆到细菌宿主中和/或构建用于转化的载体。为了"除去"这些位点，需要对核酸序列进行修饰，以使所使用的限制酶不能识别该位点，而到氨基酸的翻译仍保持相同。这可使用多种方法实现，例如该序列的从头合成。由于其他植物物种的/w狄/核酸序列中很可能存在类似的问题，所以一个通用的实施方案是提供这样一种(任何上述附/W核酸序列及序列变体的)/w/A2核酸序列，它们所含的限制酶识别位点的数目减少，优选其中不同限制酶的至少2、3、4、5或更多个识别位点被除去，优选至少针对实施例中提及的那些限制酶。而且，为使在植物中的表达最优化，在一个实施方案中，使编码MLH1的核酸序列的密码子选择适合于待转化的宿主物种的优选的密码子选择。在一个优选的实施方案中，对任何上述附/WDNA序列(或变体)进行的密码子优化是通过下述方法进行的使用可用的密码子选择表，使密码子选择适合宿主属(或优选宿主种)的最优选的密码子选择(Be画tzen&Hall,1982，J.Biol.Chem.257，3026-3031;Itak眼etal"1977Science198，1056-1063)(例如4吏之更适合在棉花、大豆、玉米或稻中表达)。各种植物物种的密码子选择表公开于例如Ikemura(1993，"PlantMolecularBiologyLabfax"，Croy，ed.，BiosScientificPublishersLtd.)和Nakamuraetal.(2000，Nucl.AcidsRes.28，292)以及大型DNA序列数据库(如EMBL,位于海德堡，德国)中。因此，可构建合成的DNA序列以制备相同或基本相同的蛋白质。在专利和科学文献中可找到一些用于改变密码子选择使之适合宿主细胞的优选的密码子选择的技术。改变密码子选择的具体方法并非本发明的关键。可优化在植物中的表达并且/或者可使克隆过程简化的其他改变也可以进行，例如除去隐含的剪接位点，避免较长的富含AT或GC的链等(参见实施例)。这些方法为本领域所公知，可使用标准的分子生物学技术。SEQIDNO:2提供了一种优化的丄em狄/核酸序列，它与野生型Z^附狄7核酸序列编码相同的氨基酸序列。通过除去限制位点并进4亍密码子优化来优化该序列。"密码子优化的"序列优选地与将引入它的宿主物种的基因具有至少大约相等的GC含量或者比其更高的GC含量。例如在番茄(丄.^c"/e"^mi)中，内源基因的GC含量大约为30-40%。因此，用于转化番茄的、编码MLH1的核酸序列的优选的GC含量为至少30-40%,优选超过40%，例如至少45%、50%、55%、60%、70%或者更高。优选地，应该避免GC含量非常高(>80%)或非常低的(<30%)区域。可常规地对DNA序列进行一些微小修饰，即通过PCR介导的诱变(Hoetal"1989，Gene77，51-59.，Whiteetal"1989，TrendsinGenet5，185-189)。对DNA序列的更大的修饰可利用现有的技术，通过从头DNA合成所需的编码区来常规地进行。另外，可对附//^核酸序列进行修饰以使MLH1蛋白的N末端具有最佳的翻译起始环境，这可通过在该蛋白质的N末端添加或去掉一个或多个氨基酸来实现。通常，要在植物细胞中表达的本发明的蛋白质优选以Met-Asp或Met-Ala二肽开始，以利于最佳翻译起始。因此，可将Asp或Ala密码子插入已有的Met之后，或者可以将第二个密码子Val替换为密码子Asp(GAT或GAC)或Ala(GCT、GCC、GCA或GCG)。还可对DNA序列进行修饰以除去不合理的剪接位点。除其生物学功能之外，"MLH1蛋白"还可以通过其全长序列上的序列同一性百分数进行结构性限定。使用GAP程序通过配对比对进行测定(空位创建罚分为8，延伸罚分为2)，在氨基酸序列水平上，MLH1蛋白全长与SEQIDNO:3(LeMLHl)具有50%或更高的序列同一性，例如但不限于至少40%、45%、50%、55%、56%、58%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5，％、99.8%或者更高。这样的变体也称为与SEQIDNO:3"基本相似，，。例如，拟南芥MLH1蛋白和稻MLH1蛋白分别与LeMLHl具有55.9%和52.9%的氨基酸序列同一性。优选地，该定义包括这样的蛋白质，它们中增加、置换或缺失了一些(优选5-10、20、30、50、100、200、300或更多个)氨基酸，而未显著改变该蛋白质的活性。例如，在碱性(例如Arg、His、Lys)、酸性(例如Asp、Glu)、非极性(例如Ala、Val、Trp、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp)或极性(例如Gly、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln)分类内的保守性氨基酸置换落入本发明的范围，只要MLH1蛋白的活性没有显著(优选没有)改变。另外，非保守性氨基酸置换也落入本发明的范围，只要MLH1蛋白的活性没有显著改变，优选没有改变。MLH1蛋白片段和活性嵌合MLH1蛋白也涵盖于本文之中。蛋白质片段可例如用于产生针对MLH1的抗体(抗MLH1抗体)，如本文其他地方所述。蛋白质片段可为至少大约5、10、20、40、50、60、70、90、100、150、152、160、200、220、230、250、300、400、500、600、700或更多个连续氨基酸的片段。还提供了编码这些片段的核酸序列，它们可用于例如构建下文所述的基因沉默载体，或者用于表达可用于诱导抗体产生的肽。另外，还提供了在植物体内保持活性的最小的蛋白质片段。编码这样的片段的核酸序列可用于产生所述的转基因植物。本发明的嵌合基因和载体在本发明的一个实施方案中，如上所述的编码MLH1蛋白的核酸序列(或变体或片段)被用于制备嵌合基因，以及含有嵌合基因的载体，用于将该嵌合基因转移至宿主细胞中，并在宿主细胞中产生MLH1蛋白，所述宿主细胞例如由转化的细胞获得的细胞、组织、器官或整个生物体。宿主细胞优选植物细胞。任何植物均可为合适的宿主，例如单子叶植物或双子叶植物，例如玉米/玉黍蜀(玉蜀黍属种(Zeaspecies)，如玉米(Z.mays)、大刍草(Z.diploperennis(chapule))、繁茂大当草(Zealuxurians(Guatemalanteosinte))、玉米亚种huehuetenangensis(SanAntonioHuistateosinte)、玉米亚种mexicana(Mexicanteosinte)、玉米亚种parviglumis(Balsasteosinte)、多年生玉米(Z.perennis(perennialteosinte))和Z.ramosa)、小麦(小麦属种(Triticumspecies))、大麦(如大麦(Hordeumvulgare))、燕麦(如燕麦(Avenasativa))、高粱(Sorghumbicolor)、黑麦(Secalecereale)、大豆(大豆属种(Glycinespp),如大豆(G.max))、棉花(棉属种(Gossypiumspecies)，如陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense))、芸苔属种(Brassicaspp.)(如油菜(B.napus)、芥菜(B.juncea)、甘蓝(B.oleracea)、完青(B.rapa)等)、向曰婆(Helianthusannus)、烟草(烟草属种(Nicotianaspecies))、苜蓿(Medicagosativa)、稻(稻属种(Oryzaspecies)，如栽培稻(O.sativa)indica栽培组或japonica栽培组)、牧草、珍珠粟(狼尾草属种(Pennisetumspp.)，如珍珠粟(P.glaucum))，树种，蔬菜种类如番茄属种(Lycopersiconssp)(最近被重新归于茄属(Solanum))、如番痴(L.esculentum，即Solanumlycopersicum)、马铃薯(Solanumtuberosum)和其他茄属种类，i口茄子(Solanummelongena)、番痴(S.lycopersicum,如楼杉匕番痴，品种cerasiforme，或者小果野番茄，品种pimpinellifolium)、树番茄(S.betaceum，即Cyphomandrabetaceae)、荡瓜(S.muricatum)、cocona(S.sessiliflorum)和查东痴(S.quitoense);胡椒(Capsicumannuum，Capsicumfrutescens)、豌豆(如Pisumsativum)、菜豆(如菜豆属种(Phaseolusspecies))、肉质果(葡萄、桃、李、草莓、芒果)、观赏种类(如玫瑰、牵牛花、菊花、百合、大丁草属种)、木本树木(如杨属(Populus)、柳属(Salix)、栎属(Quercus)、桉树属(Eucalyptus)种类)、纤维种类,如亚麻(Linumusitatissimum)和大麻(Cannabissativa)。在一个实施方案中，优选蔬菜种类，特别是茄属种类(包括番茄属种类)。因此，例如可以转化下列属的种类南瓜属(Cucurbita)、玫瑰属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉4艮属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、车轴草属(Trifolium)、胡，巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸莒属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠痴属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、黄瓜属(Cucumis)、茛菪属(Hyoscyamus)、番痴属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、苹果属(Malus)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、牛至属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、西瓜属(Citrullus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、致命鱼鼠属(Nemesis)、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、《良尾草属(Pennisetum)、毛良属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、Browaalia属、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseohis)、棉花、大豆和黑麦草属(Lolium)。进一步优选南瓜属、芸苔属、番茄属、茄属、稻属和玉蜀黍属中的每一种。优选燕麦属(Avena)、苜蓿属(Medicago)、辣椒属、烟草属、莴苣属、豌豆属、南瓜属、芸苔属、茄属(包括番茄属)、稻属和玉蜀黍属中的每一种。用于将编码MLH1蛋白的核酸序列引入宿主细胞基因组中的嵌合基因和载体的构建为本领域所普通公知。为了产生嵌合基因，使用标准的分子生物学技术，将编码MLH1蛋白(或变体或功能性片段)的核酸序列与适于在宿主细胞中表达的启动子序列有效连接。启动子序列可以已经存在于载体中，这样柳/W核酸序列简单地插入载体中该启动子序列的下游即可。然后将载体用于转化宿主细胞，嵌合基因被插入到核基因组中或者插入到质体、线粒体或叶绿体基因组中并使用适当的启动子在该处表达(如McBrideetal"1995Bio/Technology13，362;US5，693，507)。在一个实施方案中，嵌合基因含有适于在植物细胞中表达的启动子，该启动子与编码本发明的MLH1蛋白、蛋白变体或蛋白片段(或融合蛋白或嵌合蛋白)的核酸序列有效连接，所述核酸序列后面任选地接续一个3，非翻译核酸序列。编码功能性MLH1蛋白的附//^核酸序列(优选Att/W嵌合基因)可以以常规方式稳定地插入单个植物细胞的核基因组中，这样转化的植物细胞可以以常规方式用于产生转化的植林，所述植林由于在特定时间特定细胞内存在MLH1蛋白而发生表型变化。为此，可将根癌农杆菌(v4g/Y6flr"e/7'w附似附e/"c/ews)中的T國DNA载体(含有编码MLH1蛋白的核酸序列)用于转化所述的植物细胞，然后可从该转化的植物细胞再生转化的植抹，利用的再生方法记载于例如EP0116718、EP0270822、PCT公布文本WO84/02913和公布的欧洲专利申请EP0242246以及Gouldetal.(1991，PlantPhysiol.95,426-434)。用于农杆菌介导的植物转化的T-DNA载体的构建为本领域所熟知。T-DNA载体可为EP0120561和EP0120515中所述的二元载体，或者为EP0116718中所述的共整合载体，后者可通过同源重组整合到农杆菌的Ti质粒中。优选的T-DNA栽体每个都在T-DNA边界序列之间，或者至少位于右边界序列的左边，含有与编码MLHl的核酸序列有效连接的启动子。边界序列记载于Gielene/tf/.(1984，EMBOJ3，835-845)。当然，其他类型的载体也可使用下述方法用于转化植物细胞，所述方法例如直接基因转移(例如，如EP0223247中所述，或者颗粒或微:粒轰击，如US2005/055740和WO2004/092345所述)，花粉介导的转化(例如，如EP0270356和WO85/01856所述)，原生质体转化(例如，如US4,684，611所述)，植物RNA病毒介导的转化(例如，如EP0067553和US4，407，956所述)，脂质体介导的转化(例如，如US4,536，475所述)，以及其他，例如所记载的用于转化特定的玉米品系的方法(如US6,140，553;Fromm"1990，Bio/Technology8,833-839;Gordon画Kamm"a/"19卯，ThePlantCell2，603-618)和用于转化特定的稻品系的方法(Shimamoto"1989，Nature338，274-276;Datta"a/.19卯，Bio/Technology8，736-740)以及通常用于转化单子叶植物的方法(PCT公布文本WO92/09696)。关于棉花转化，可另外参见WO00/71733,关于稻转化，可另外参见W092/09696、W094/00977和W095/06722中记载的方法。关于高梁转化，参见例如JeoungJMetal.2002，Hereditas137:20-8或ZhaoZYetal.2000，PlantMolBiol.44:789-98)。同样，从转化的细胞选择和产生转化的植林也为本领域熟知。显然，对于不同物种，甚至同一物种的不同品种或栽培种，应该具体地调整方法以适于以高频率产生转化体。除转化核基因组之外，本发明还包括转化质体基因组，优选叶绿体基因组。质体基因组转化的一个优点是减少了该转基因扩散的风险。质体基因组转化可以以本领域熟知的方法进行，参见例如SidorovVA/.1999，PlantJ.19:209-216或LutzKAW2004，PlantJ.37(6):卯6-13。产生的转化植物可在常规的植物育种方法中使用，以制备更多的含有该转基因的转化植物，或者产生重组植物/植物群，优选缺少嵌合基因。将附/W核酸序列插入植物细胞基因组中，以使所插入的编码序列位于一个启动子的下游(即3')，并受该启动子的调控，所述启动子可指导植物细胞中的表达。优选地通过将嵌合基因插入植物细胞基因组中来实现，特别是插入核基因组或质体(如叶绿体)基因组中。优选的启动子包括至少在减数分裂期间具有活性的启动子，更优选所定义的减数分裂特异性启动子或减数分裂偏向性启动子。减数分裂偏向性启动子的一个实例是DMC1启动子，这是由于该启动子在减数分裂(至少部分)期间具有活性。显然，可使用任何物种的DMC1启动子。DMC1基因和上游启动子序列可使用已知的方法从其他物种中克隆。特别优选的DMC1启动子来自于植物物种，例如番茄、拟南芥和大麦。还可使用缺失分析来鉴别具有减数分裂特异性的最小启动子。其他适合的启动子有m/W基因本身的启动子或者来自附/Zl直系同源基因的启动子。同样，也可鉴别并使用至少在减数分裂期间或者在减数分裂部分期间表达的基因的启动子。适合的其他启动子有MER3启动子、MSH4启动子、SPOll、MSH5、DIF1等。可能具有适合的启动子的其他减数分裂植物基因记载于T.Schwarzacher，J.Exp.Botany54(2003)11-23。启动子的时空特异性，以及它或它的衍生物(例如使用末端缺失分析)是否具有减数分裂偏向性或减数分裂特异性表达模式，可使用已知的方法将启动子与报告基因有效连接而容易地测定。或者，可将编码MLH1的核酸序列置于可在减数分裂细胞中被诱导的诱导型启动子的调控之下。诱导型启动子的实例有可由缺氧或冷应激诱导的Adhl启动子，可由热应激诱导的Hsp70启动子，可由光诱导的PPDK启动子。诱导型启动子的其他实例有可由创伤(例如由昆虫或物理伤口引起)i秀导的创伤-誇导型启动子，例如Corderaetal.(1994，ThePlantJournal6，141)中记载的MPI启动子，或者COMPTII启动子(WO0056897)或者US6031151中记载的启动子。或者，启动子可由化学试剂i秀导，侈'J:ft口Aoyama和Chua(1997，PlantJournal11:605-612)和US6063985中记载的地塞米(dexamethasone),或者四环素(tetracycline)(TOPFREE或TOP10启动子，参见Gatz，1997，ArniuRevPlantPhysiolPlantMolBiol.48:89-108和Loveetal.2000,PlantJ.21:579-88)。其他诱导型启动子为通过例如温度变化诱导，例如记载于US5,447，858中的热激启动子，通过缺氧条件i秀导(例如玉米ADHIS启动子)，通过光诱导(US6455760)等。显然，还有一系列其他启动子可以使用。受发育调控的启动子的实例包括花药特异性启动子5126(美国专利5，689，049和5,689,051)，glob-1启动子和y-zein启动子。组成型启动子也可用于某些实施方案中。因为它们优选用于基因沉默方法中，所以它们将在下文进一步叙述。将w幼7编码序列插入植物基因组中，以使该编码序列位于适当的3'端转录调控信号("3，端")(即转录物形成和多腺苷酸化信号)的上游(即5，端)。多腺苷酸化和转录物形成信号包括胭脂碱合成酶基因("3，nos，，)(Depickeretal.，1982J.Molec.Appl.Genetics1，561-573.)、章鱼碱合成酶基因("3，ocs")(Gielenetal.，1984，EMBOJ3，835-845)和T-DNA基因7("3，基因7")(VeltenandSchell，1985，NucleicAcidsResearch13，6981-6998)的信号等等，它们在转化的植物细胞中作为3，非翻译DNA序列。编码MLH1的核酸序列可任选地以杂合基因序列的形式插入到植物基因组中，从而使附/W序列与编码一个可选择或可评分标记物的基因框内连接(US5，254，799;Vaecketal"1987，Nature328，33-37),例如与编码卡那霉素抗性的neo(或nptll)基因(EP0242236)连接，从而使植物表达可容易检测的融合蛋白。编码MLH1蛋白的全部或部分核酸序列还可用于转化樣i生物，例如细菌(例如大肠杆菌(^^/rw/c/i/flco//)、假单胞菌(尸sem/。卿聽s)、农杆菌、杆菌(丑nc/〃MS1)等)、真菌、病毒、藻类或昆虫。4吏用引入适当的克隆载体中的、全部或部分本发明的附狄/核酸序列转化细菌可以以常规方式进行，优选使用常规的电穿孔技术，如Maillonetal.(1989，FEMSMicrobiol.Letters60，205-210.)和WO卯/06999中所述。为了在原核宿主细胞中表达，可对核酸序列的密码子选择进4亍相应的优化(如上面植物部分所述)。应该去掉内含子序列，为了最优表达而进行的其他优化也已知。为了获得在单子叶植物例如禾草种类(例如玉米或稻)中的增强的表达，可在嵌合基因中添加内含子，优选单子叶植物内含子。例如，已经证明，将玉米Adhl基因的内含子插入5'调控区可增强玉米中的表达(Calliset.al"1987，GenesDevelop.1:1183-1200)。同样，如US5，859，347中所述的HSP70内含子也可用于增强表达。附/W核酸序列的DNA序列可以以不影响翻译的方式被进一步改变，以对基因部分中可能存在的抑制性DNA序列进行修饰，这可通过下列方式进行定点内含子插入和/或改变密码子选择，例如使密码子选择适合于植物中最优选的密码子选择，优选适合于如上所述的具体相关的植物属或种中最优选的密码子选择。基因沉默在某些应用中，例如稳定植物基因组、植物染色体或某些等位基因组合(例如等位基因叠加)，或者重建亲本基因组(反向育种)，需要产生这样的转基因植物，它的内源附//^基因或附//^基因家族为非功能性的(T-DNA插入、突变)、沉默的或者在该植物的特定细胞或组织中(特别是在减数分裂期间)沉默的。在这样的植物中，减数分裂同源重组(尤其至少是干扰性减数分裂同源重组)频率被显著改变，优选显著降低。在该上下文中，"显著降低"是指与对照植物(非转基因植物或使用对照构建体转化的植物)相比，降低至少1、2、3、5、10、20、30、50、70、90或优选100%。更重要的是，转基因植物中的重组频率的降低在统计学上具有显著性。因此，这样的转基因植物的减数分裂后的细胞(雄性和雌性配子)应保持宿主植物的染色体组成。通过克隆繁殖、杂交或自交等方法，该转基因植物可用于产生其他植物。上述的制备过表达MLH1蛋白的转基因植物的方法的实施方案，基本上也可应用于制备内源附//^基因被沉默的转基因植物的方法中，区别是使用基因沉默载体。"基因沉默"是指下调或完全抑制一个或多个靶基因的基因表达。使用抑制性RNA来减少或阻止基因表达的方法在本领域中已经很成熟，并成为几篇综述的主题(例如Baulcombe1996，Stametal.1997,DepickerandVanMontagu,1997)。有多种技术可在植物中实现基因沉默，例如可产生靶基因的全部或部分的反义RNA的嵌合基因(参见例如EP0140308Bl、EP0240208Bl和EP0223399Bl)或者可产生有义RNA的嵌合基因(也称共抑制)，参见EP0465572Bl。然而，到目前为止最成功的方法是同时产生靶基因的有义和反义RNA("反向重复序列")，它在细胞中形成双链RNA(dsRNA)，并沉默靶基因。用于dsRNA产生和基因沉默的方法和载体已经记栽于EP1068311、EP983370Al、EP1042462Al、EP1071762Al和EP1080208Al中。因此，本发明的栽体可含有在植物细胞中有活性的转录调控区，该调控区与本发明的附狄7基因的有义和/或反义DNA片段有效连接。通常，耙基因序列的短(有义和反义)链，例如编码或非编码序列的17、18、19、20、21、22或23个核苷酸就已经足够。也可使用更长些的序列，例如IOO、200或250个核苷酸。优选地，短有义和反义片段:f皮间隔序列(例如内含子)所分隔，它在dsRNA形成时形成环(或发夹)。SEQIDNO:1或2或者它们的变体的任何短链都可用于制备附/W基因沉默栽体和转基因植物，在所述的转基因植物中，在全部或一些组织或器官中或者在一定的发育阶段，一种或多种附狄/基因被沉默。产生发夹结构的一种简便的方式是使用通用载体，例如pHANNIBAL和pHELLSGATE，它们是基于Gateway⑧技术(参见Wesleyetal.2004，MethodsMolBiol.265:117-30;Wesleyetal.2003,MethodsMolBiol.236:273-86和Helliwell&Waterhouse2003，Methods30(4):289-95.)的栽体，所述这些文献都通过引用纳入本文。通过选择保守性核酸序列，宿主植物中的所有m/W基因家族成员都可被沉默。本文还涵盖这样的转基因植物，所述转基因植物含有在植物中有活性的启动子(它与附/W核酸序列的有义和/或反义DNA片段有效连接)，并显示附狄/基因沉默表型(减数分裂同源重组频率显著改变，优选干扰性减数分裂同源重组频率显著改变)。启动子可为上述的减数分裂偏向性或减数分裂特异性或者诱导型启动子，或者为组成型启动子。适合的组成型启动子包括CabbB-S(Francketal"1980，Cell21，285-294)和CabbB-JI(HullandHowell,1987，Virology86,482-493)、泛素家族来源的启动子(例如玉米泛素启动子，Christensenetal.，1992，PlantMol.Biol.18,675-689，EP0342926，另参见Cornejoetal.1993，PlantMol.Biol.23，567-581)、gos2启动子(dePateretal"1992PlantJ.2,834-844)、emu启动子(Lastetal"19卯，Theor.Appl.Genet.81,581-588)、拟南芥肌动蛋白启动子(例如Anetal.，1996，PlantJ.10，107中所述的启动子)、稻肌动蛋白启动子(例如Zhangetal.，1991，ThePlantCell3，1155-1165中记载的启动子和US5，641，876中记载的启动子)或者WO070067记载的稻肌动蛋白2启动子；木薯叶脉花叶病毒启动子(WO97/48819，Verdagueretal.1998，PlantMol.Biol.37,1055-1067)、来自地三叶草矮化病毒的pPLEX系列启动子(WO96/06932，特别是S7启动子)、醇脱氲酶启动子如pAdhlS(GenBank编号X04049、X00581)，以及分别驱动T-DNA的l，和2'基因表达的TR1'启动子和TR2'启动子(分别为"TR1'启动子"和"TRT启动子")(Veltenetal"1984，EMBOJ3,2723-2730)、US6051753和EP426641中记载的玄参花叶病毒(figwortmosaicvirus)启动子、组蛋白基因启动子例如来自拟南芥的Ph4a748启动子(PMB8:179-191)、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利5,683,439)、Nos启动子、pEmu启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子或其他启动子。另外，在本申请中，嵌合基因可稳定地引入宿主基因组中，或者以游离单元的形式存在。本发明的植物和植物种子本文提供了可由上述方法获得的转基因植物、植物细胞、组织或器官。这些植物的特征在于在其细胞或基因组中存在嵌合基因，和/或在于重组频率发生改变，和/或在于重组事件的位置/分布发生改变。重组频率的任何变化都可使用例如细胞学分析(如本文所述或者如上文ShermanandStack,1995所述)、遗传标记分析、选择和报告基因、表型标记物等来测定。表达高、中或低水平MLH1蛋白(或者在沉默植物中的有义和/或反义转录物)的转化体可通过下述方法选择例如，分析拷贝数目(DNA印迹分析)、mRNA转录物水平(例如RNA印迹分析或者使用附/W引物对或侧翼引物进行RT-PCR)，或者，在例如发育中的花朵器官中在减数分裂期间分析MLH1蛋白的存在和水平(例如SDS-PAGE随后进行蛋白质印迹分析；ELISA分析，免疫细胞学分析等)。附//^嵌合基因的表达水平不仅依赖于启动子的强度和特异性，还依赖于该嵌合基因在基因组中的位置。该表达水平,皮认为可影响同源重组频率以及干扰性和非干扰性交换的比例。然而，本领域技术人员可容易地鉴别出具有所需的重组频率和/或位置变化(任选地没有不期望的影响)的植物。因此，通过测试各种启动子，并分析使用同一构建体转化的各种重组植物(即"转化事件")，可鉴别并选择出所需的植物供进一步使用。同样情况也适用于使用基因沉默构建体转化的植物中，此时使用常规方法可容易地选择出适合的构建体和转化事件。还提供了使用所述重组植物作为父本和/或母本而获得的一群植物和一群植物种子。该群的特征在于重组体的频率/百分比升高，或者在于重组体的频率/百分比降低，和/或重组事件的分布改变。可以选出个体植物并进一步用于育种方法中或者种子生产方法中。优选地，为寻找目标重组体所需的植物群大小显著减小。育种方法为本领域已知，并记载于标准的植物育种教科书中，例如AHard，R.W.，PrinciplesofPlantBreeding(1960)NewYork,NY，Wiley，pp485;Simmonds，N.W.，PrinciplesofCropImprovement(1979)，London,UK,Longman,pp408;Sneep，J.etal"(1979)TomatoBreeding(p.135-171)见于BreedingofVegetableCrops,MarkJ.Basset,(1986，编者)，TheTomatocrop:ascientificbasisforimprovement,Atherton，J.G.&J.Rudich(编者)，PlantBreedingPerspectives(1986);Fehr，PrinciplesofCultivarDevelopment~TheoryandTechnique(1987)NewYork,NY，MacMillan.本发明的分离核酸和蛋白质在一个实施方案中，提供了新的附狄7核酸和MLH1氨基酸序列，以及含有它们的载体和使用它们的方法。该分离序列和载体已经在上文的方法中叙述，其本身也是一个实施方案。具体地说，提供了SEQIDNO3(LeMLHl)、其片段和变体(以及含有它们的嵌合基因和栽体)，提供了编码它们的核酸序列，例如SEQIDNO:1和2,及其片段和变体(以及含有它们的嵌合基因和载体)。在一个优选的实施方案中，提供了野生型附//^核酸序列的密码子优化序列(见上文)，它特别适于在植物中过表达。还提供了适用于诱导抗体产生以用于细胞学分析的序列，如下文所述。本发明的抗体及其用途本发明的MLH1蛋白(包括上文定义的片段和变体)可用于诱导产生单克隆或多克隆抗体，这些抗体可用于例如检测植物样本中的MLH1蛋白(免疫化学分析方法和试剂盒)。这样的抗体特别适用于(a)测定植物细胞核中代表干扰交换的晚重组节的数目，从而测定每条染色体或每个细胞中干扰性减数分裂同源重组频率，和/或(b)测定代表干扰交换的晚RN在细胞中、在染色体中和在染色体上的位置或分布。为实现目的U),需要一种可特异性标记代表干扰交换的晚RN的抗体，例如抗MLH1抗体，它能够标记染色体分散中的MLH1。已发现抗MLH1抗体只特异性针对全部晚RN的一部分，即代表干扰交换的RN。可以鉴别出可特异性标记代表干扰交换的晚RN的其他抗体。在不限制本发明范围的前提下，据推测抗MLH3抗体、抗Mer3抗体、抗Msh4抗体和抗Msh5抗体也特异性针对代表干扰交换的RN。为实现目的(b)，至少需要三种抗体，一种抗体标记代表干扰交换的晚RN(例如抗MLH1抗体)，一种抗体标记联会复合体的轴向元件(例如抗SMC1和/或抗SMC3抗体)，一种抗体标记着丝粒区域(例如抗CENP-C)。可使用诱导多克隆或单克隆抗体产生的标准方法，如HarlowandLane(1988，ISBN0-87969-314-2，Antibodies-—部实验室手册)中所述。例如，含所需表位的肽在宿主细胞中表达或者合成，纯化并注入动物(小鼠、兔、大鼠等)中，采集该动物的血液，从血液中回收抗体。在一个实施方案中，提供了一种抗MLH1抗体，它由SEQIDNO:3或如上文所定义的SEQIDNO:3的变体的至少5、10、20、50、100、150、160、200或更多个连续氨基酸诱导产生。在一个实施方案中，该抗MLH1抗体由SEQIDNO:4或者由SEQIDNO:4的片段所i秀导产生，其中所述片段包含SEQIDNO:4的氨基酸37-195(对应于SEQIDNO:3的氨基酸443-601)的至少5、10、20、50、100、150或更多个连续的氨基酸。优选地，抗体由SEQIDNO:3或者如上文定义的SEQIDNO:3的变体的C末端片段所诱导产生。C末端被发现特别适用于诱导产生强的特异性抗MLH1抗体。本文中的"C末端MLH1区"是指MLHl蛋白或其变体的大约第400位氨基酸到末端。C末端的长度依赖于该蛋白质的总长度。对于LeMLHl，C末端区为201个氨基酸，而对于拟南芥和稻MLH1蛋白，C末端区要长一些，因为这些蛋白质要长一些。其片段包含所述C末端区的至少5、10、20、50、100、150、200或更多个连续氨基酸。或者，可使用MLH1蛋白或变体的其他部分，例如N末端区。例如，由SEQIDNO:3的氨基酸1-193所诱导产生的抗体也是可用的。抗MLH1抗体以及可特异性标记干扰交换的其他抗体在对植物细胞中晚RN进行检测和/或定量中的用途是本发明的一个实施方案。在下文所述的细胞学分析中的用途也涵盖于本文中。进一步提供了这样的抗体，它们分别适于检测植物细胞核中的SC的轴向元件和着丝粒，特别是在本文所述的细胞学分析和试剂盒中。这样的抗体包括抗SMC1、抗SMC3和抗CENP-C抗体。它们是由植物蛋白质中的SMC1、SMC3和CENP-C蛋白片段所诱导产生的。例如，本文提供了LeSMCl的氨基酸和核酸片段(SEQIDNO:6的氨基酸46-293和SEQIDNO:7的核苷酸136-817)和LeSMC3的氨基酸和核酸片段(SEQIDNO:10的氨基酸37-318和SEQIDNO:11的核苷酸108-954)和LeCENP-C的氨基酸和核酸片段(SEQIDNO:8的氨基酸37-209和SEQIDNO:的核苷酸109-630)，它们可用于诱导产生抗体。因此，在一个实施方案中，提供了由下述序列诱导产生的抗SMCl抗体SEQIDNO:6的氨基酸46-293(LeSMCl的259N末端氨基酸序列)的至少5、10、20、50、100、150、200或更多个连续氨基酸，或者与SEQIDNO:6的氨基酸46-293具有至少50、60、70、80、90、95、98或更多氨基酸同一性的氨基酸序列中的至少5、10、20、50、100、150、200或更多个连续氨基酸。在一个实施方案中，抗SMC1抗体由SEQIDNO:6或者由SEQIDNO:6的片段诱导产生，其中所述片段包含SEQIDNO:6的氨基酸46-293中的至少5、10、20、50、100、200或更多个连续氨基酸。或者，抗体可由植物SMCl蛋白的任何片段诱导产生。全长SMC1蛋白可从任何植物物种中克隆并测序，该序列可用于诱导产生抗体。在一个实施方案中，提供了由下述序列诱导产生的抗SMC3抗体SEQIDNO:10的氨基酸37-318的至少5、10、20、50、100、150、200或更多个连续氨基酸，或者与SEQIDNO:10的氨基酸37-318具有至少50、60、70、80、90、95、98或更多氨基酸同一性的氨基酸序列中的至少5、10、20、50、100、150、200或更多个连续氨基酸。在一个实施方案中，抗SMC3抗体由SEQIDNO:IO或者由SEQIDNO:10的片段诱导产生，其中所述片段包含SEQIDNO:10的氨基酸37-318中的至少5、10、20、50、100、200或更多个连续氨基酸。或者，抗体可由植物SMC3蛋白的任何片段诱导产生。全长SMC3蛋白可从任何植物物种中克隆并测序，该序列可用于诱导产生抗体。在另一个实施方案中，提供了由下述序列诱导产生的抗CENP-C抗体SEQIDNO:8的氨基酸37-209(LeCENP-C的C末端氨基酸序列)的至少5、10、20、50、100、150或更多个连续氨基酸，或者与SEQIDNO:8的氨基酸37-209具有至少60、70、80、90、95、98或更多氨基酸同一性的氨基酸序列中的至少5、10、20、50、100、150或更多个连续氨基酸。在一个实施方案中，抗CENP-C抗体由SEQIDNO:8或者由SEQIDNO:8的片段诱导产生，其中所述片段包含SEQIDNO:8中的至少5、10、20、50、100、150或更多个连续氨基酸。或者，抗体可由植物CENP-C蛋白的任何片段诱导产生。全长CENP-C蛋白可从任何植物物种中克隆并测序，该序列可用于诱导产生抗体。所提供的抗体特别适用于本文所述的细胞学分析中。应该理解，适用于诱导产生上述抗体的核酸和氨基酸序列及其变体也是本发明的一个实施方案。本发明的细胞学分才斤和抗MLH1抗体的用途提供了两种类型的细胞学分析，在这些分析中，使用了至少一种可标记代表干扰交换的晚RN的抗体，例如抗MLH1抗体。一个实施方案是在细胞学分析中使用可标记代表干扰交换的晚RN的抗体(例如抗MLH1抗体)以测定植物细胞中干扰性减数分裂同源重组频率，所述方法包括(a)制备一种植物的减数分裂粗线期细胞/核的样本，(b)使所述样本接触至少一种可标记代表干扰交换的晚RN的抗体，优选抗MLH1抗体，任选地接触可标记联会复合体的轴向元件的抗体，例如抗SMCl或抗SMC3抗体，和/或可标记着丝粒区的抗体，例如抗CENP-C抗体，任选地，使用DAPI对染色体DNA进行复染，以及(c)测定每个细胞中MLH1焦点的数目，优选使用光学显孩i镜或电子显微镜。另一个实施方案是在细胞学分析中使用可标记代表干扰交换的晚RN的抗体(如抗MLH1抗体)以测定植物细胞中干扰性减数分裂同源重组事件的位置和分布，所述方法包括U)制备一种植物的减数分裂粗线期细胞/核的样本，(b)使所述样本同时或先后接触至少一种可标记代表干扰交换的晚RN的抗体，例如抗MLH1抗体，一种可标记联会复合体的轴向元件的抗体，如抗SMC1或抗SMC3抗体，和一种可标记着丝粒区的抗体，例如抗CENP-C抗体，任选地，使用DAPI对染色体DNA进行复染，以及(c)测定每个细胞中标记的MLH1焦点的数目，优选使用光学显微镜或电子显微镜。两种分析的步骤(a)中使用制备植物细胞核样本的标准方法，例如实施例中和Sherman和Stack(1995)所记载的染色体分散技术。采集花药，将至少一个花药用于检查减数分裂阶段，检查是通过压片和例如醋酸-地衣红染色法进行的。所述阶段优选为前期I的中间阶段，最优选粗线期。如果阶段适合，就使用其他花药来分离花粉母细胞，制备原生质体和染色体分散。然后将染色体分散与一种或多种抗体相接触，所述接触先后或组合/同时进行。可使抗体与染色体接触的样本也可使用本领域中公知的其他方法制备。免疫细胞学标记方法(免疫荧光法)优选地利用荧光化合物(荧光染料)，所述荧光化合物可使用光学显微镜/荧光显微镜检测。焚光化合物可直接地共价连接到"测试抗体"(如抗MLH1)上(直接测试)，或者优选地连接到第二抗体上，其中所述第二抗体特异性针对第一测试抗体(间接测试)。因此，第二抗体可使用一种荧光化合物标记/缀合，并可以结合测试抗体。适合的焚光化合物均为熟知，如FITC(异硫氰酸荧光素)、TR(德克萨斯红)、AMCA。荧光通过图像分析评分，并使用本领域公知的方法定量。可将图像进行叠加，以使着丝粒、SC轴向元件和MLH1焦点出现在一幅图上。如果要测定代表干扰交换的RN与代表非干扰交换的RN的相对比例，那么优选地，还进行RN的超微结构检测(ShermanandStack,1995)和/或遗传标记物分析以测定总的重组频率。这些细胞学分析适用于分析转化的、未转化的或重组的植物，以及各种因素对减数分裂同源重组频率和RN在染色体上的分布的影响，。过表达或沉默一个或多个基因的影响、突变的影响以及染色体异常和不完全同源性的影响也可通过相同的方式来分析。非转基因方法和植物或者，可鉴别非转基因植物或植物细胞，所述植物或植物细胞含有附/Zl的非功能性等位基因或者内源性w/Z^基因的表达水平升高。本发明的另一个实施方案是使用非转基因方法，例如诱变系统，如TILLING(TargetingInducedLocalLesionsINGenomics;McCallumetal.，2000,NatBiotech18:455，和McCallumetal.2000,PlantPhysiol.123，439-442,两篇文献都通过引用纳入本文)和筛选，以生成本发明的一种或多种MLH1蛋白的产生水平降低或升高的植物系。在不限制本发明的范围的前提下，相信这样的植物可在基因中或在启动子中包括点突变/缺失突变。在启动子中的阻遏蛋白结合位点区域的突变可使宿主MLH1基因组成型表达或高度表达。TILLING使用常规的化学诱变(例如EMS诱变)，继之以对突变进行高通量筛选(例如采用突变体-野生型DNA异源双链的Cel1裂解，并使用测序凝胶系统进行检测)，参见例如Henikoffetal.PlantPhysiologyPreviewMay21，2004。戶斤以,本文还包括在一种或多种组织中附/W基因表达增强的非转基因植物、种子和组织，以及产生和鉴别这些植物的方法。在一个实施方案中，该方法包括下列步骤诱变处理植物种子(如EMS诱变)，收集植物个体或DNA,对感兴趣的区域进行PCR扩增，形成异源双链体并且进行高通量检测，鉴别突变植物，对突变体PCR产物进行测序。应该理解，其他诱变和筛选方法也可同样地用于产生这样的突变植物。例如可对种子进行辐射或化学处理，并筛选出重组频率改变的植物。在本发明的另一个实施方案中，植物材料为该物种或相关物种的天然群体，它们在MLH1直系同源的编码和/或调控序列的DNA序列中包含多态性或变异。MLH1基因靶标的变异可使用ECOTILLING方法(上述Henikoffeta12004)来筛选。在该方法中，育种品系或相关物种中的天然多态性可通过上述的TILLING方法来筛选，其中使用个体植物或成群植物进行MLH1靶标的PCR扩增，形成异源双链体并进行高通量分析。这之后即可选择具有所需突变的个体植物，这些植物可随后用于育种程序中以引入所需的MLH1直系同源性等位基因，以开发具有所需性状的栽培种。在另一个实施方案中提供了这样的非转基因突变植物，它们在一种或多种组织中产生较低水平的MLH1蛋白，或者它们在特定组织中完全缺少MLH1蛋白，或者它们在某些组织中产生非功能性MLH1蛋白，这些是由于例如一个或多个内源性MLH1等位基因的突变造成的。为实现该目的，也可使用例如TILLING的方法。可使用例如辐射或化学i秀变对种子进行诱变处理，可使用例如CELl裂解，通过检测DNA多态性来鉴别突变体。特别提供了在一个或多个附//^等位基因中含有突变的突变体。非功能性附/Z^等位基因可被分离并测序，或者可通过育种方法转移至其他植物中。可通过分子方法将突变植物与非突变体区分开来，例如在DNA中存在的突变、MLH1蛋白水平、mlhlRNA水平等，也可通过表型特征改变来区分。对于使内源性mlhl基因的表达增强的突变来说，或者对于突变体mlhl等位基因来说，所述的非转基因突变体可为纯合的或者杂合的。序列SEQIDNO1:番茄(野生型)mlhlcDNASEQIDNO2:mlhlcDNA(密码子优化的番茄序列)SEQIDNO3:番茄的MLH1氨基酸序列SEQIDNO4:用于诱导产生抗LeMLHl抗体的氨基酸序列SEQIDNO5:用于i秀导产生抗LeMLHl抗体的核酸序列SEQIDNO6:用于i秀导产生抗LeSMCl抗体的氨基酸序列SEQIDNO7:用于i秀导产生抗LeSMCl抗体的核酸序列SEQIDNO8:用于i秀导产生抗LeCENP-C抗体的氨基酸序列SEQIDNO9:用于i秀导产生抗LeCENP-C抗体的核酸序列SEQIDNO10:用于诱导产生抗LeSMC3抗体的氨基酸序列SEQIDNO11:用于诱导产生抗LeSMC3抗体的核酸序列SEQIDN012:含AtDMCl启动子的序列SEQIDNO13:拟南芥MLH1氨基酸序列(AtMLHl)SEQIDNO14:稻MLH1氨基酸序列(OsMLHl)SEQIDNO15-33其他(推测性)MLH1蛋白的氨基酸片段图1:通过免疫荧光(IF)观察到的每个核中MLH1焦点数目的频率分布图(峰形曲线)，并与各自预测的泊松分布相比较(平緩曲线)。图2:RN间距离对所述距离的相对频度作图；符号表示Sherman和Stack(1995)的表10中的现象，线条显示对Y分布的最佳拟合。如果RN间距离可拟合至Y分布，这表示RN之间有干扰。n是y分布^厶式中的参数。右边的表显示n取何值时可获得最佳拟合。如果RN沿染色体随机分布，则n等于l;如果11>1，则RN之间存在干扰，n越大，干扰越强。为进行进一步计算，我们假定番茄染色体上的晚RN显示低水平的干扰，n=3。图3:1号染色体的长臂上晚RN之间的距离(间隔大小)的频度分布。条柱表示来自ShermanandStack,1995中表10的数据；n=2.9时获得对Y分布的最佳拟合。间隔大小是以任意单位给出的。图4:RN间距离的预期频度分布。横轴按图3的横轴的比例绘制。条柱只代表1.4焦点/长臂和n=7的情况下，MLH1焦点之间的距离的预期分布。该分布与本发明人观察到的分布情况类似，与图3中的情况明显不同峰更偏向右侧，没有非常小的焦点间距离。在模拟过程中，本发明人发现，如果将干扰敏感性RN置于完全不受MLH1焦点影响的位置，总是会出现比所观察到的更多的微小间隔。一个实例通过褐色/黑色线条示出，它代表RN(MLH1阳性和阴性)之间距离的预期分布，条件是，平均每个染色体l的长臂上放置0.63个非干扰性、MLH1阴性的RN,并且平均每个长臂上放置1.4个MLH1焦点，这样MLH1阳性RN不会影响MLH1阴性RN的位置，反之亦然。这将产生比Sherman和Stack(ShermanandStack,1995)所，见察到的多得多的微小焦点间距离。然而，如果假定MLH1阳性、高干扰性RN和MLH1阴性RN不是位于完全独立的位置，而是来自同一群前体，且这些前体已经显示出较低水平的干扰性(n=2)，我们得到了与Sherman和Stack所获得的RN间距离分布类似的RN间距离分布(黄色/浅色线条)。图5:对照(画斜线)和10号MLH1过表达植物(填充)的每个核的MLH1焦点数目的相对频度分布。竖直的黑色条柱表示两个群中MLH1焦点的平均数目。该平均条柱旁的数值表示平均值。两个群之间的差异表示为双箭头之上的对照群的百分比。图6:对照(画斜线)和10号MLH1过表达植物(填充)的每个核的交叉数目的相对频度分布。竖直的黑色条柱表示两个群中交叉的平均数目。该平均条柱旁的数值表示平均值。两个群之间的差异在表示为双箭头之上的对照群的百分比。除非在实施例中另有说明，否则所有的重组DNA技术都根据标准规程来实施，这些规程记栽于Sambrooketal.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress，和SambrookandRussell(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual,ThirdEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY;以及Volumes1and2ofAusubeletal.(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols,USA.植物分子研究的标准材料和方法记载于PlantMolecularBiologyLabfax(1993)，R.D.D.Croy著，由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications,UK合作出版。实施例1.番茄mlhl基因和蛋白质编码MLH1的番茄cDNA克隆被分离并测序。该cDNA和氨基酸序列在SEQIDNO:1和SEQIDNO:3中示出。2.抗体产生将所分离的编码MLH1的番茄cDNA克隆用于产生抗MLH1抗体。C末端、中间和N末端的氨基酸链被用于在兔中诱导产生抗体。由MLH1C末端诱导产生的抗体显示出最佳信号，而由N末端部分诱导产生的抗体也显示出信号，但要弱一些。该蛋白质的中间部分似乎不太适于诱导产生抗体。在后续分析中使用的抗体是由SEQIDNO:4(由SEQIDNO:5编码)诱导产生的抗体，SEQIDNO:4包括番茄MLH1从443位氨基酸到601位氨基酸的C末端氨基酸。另外，将番茄凝集蛋白(cohesin)SMC1(LeSMCl)、SMC3(LeSMC3)和番茄动粒蛋白CENP-C(LeCENP-C)的氨基酸序列链用于制备可识别这些蛋白质的抗体。SEQIDNO:6(由SEQIDNO:7编码)用于在兔中诱导产生抗LeSMCl抗体。SEQIDNO:6包括LeSMCl从46到293位氨基酸的N末端氨基酸。SEQIDNO:8(由SEQIDNO:9编码)用于在兔中诱导产生抗LeCENP-C抗体。SEQIDNO:8包括LeCENP-C的C末端的173个氨基酸。SEQIDNO:10(由SEQIDNO:11编码)用于在兔中诱导产生抗LeSMC3抗体。SEQIDNO:10包括LeSMC3从37到318位氨基酸的N末端氨基酸。兔中抗体的诱导产生使用了标准的方法，参见EdHarlow&DavidLane,Antibodies-Alaboratorymanual(1988)ColdSpringHarborLaboratory-ISBN0-87969-314-2。抗SMC1和抗SMC3抗体标记SC的轴向元件，而抗MLH1标记粗线期SC上的浓缩的焦点。抗CENP-C抗体强烈标记粗线期番茄性母细胞的分散标本上的着丝粒区。这是第一次将抗MLH1抗体用于植物，标记植物MLH1蛋白以及测定RN在个体染色体上的频率以及位置/分布(参见下文)。3.细胞学分才斤樱桃番茄分散制备过程染色体分散过程根据ShermanandStack,1995(同上)改进得到。消化培养基1mL2.8mMKH2P04(Merk，MW136.09，38.1mg/100mL)1mL0.5mMPIPES酸(Merk，MW302.36，15.12mg/100mL)1mL1%>琉酸葡聚糖钾新鲜溶液，由粉末配制(Calbiochem，MW1500，10mg/mL)1mL2.5mMCaC12(Merk，MW147.02，36.75mg/100mLCaC12.2H20)1mLMilliQ水将所有溶液混合在一起，添加0.7M甘露醇(637.7mg/5mL)和1%PVP(MW44,000，50mg/5mL)。完全溶解，使用0.1NKOH调节pH至5.1。在1mL消化培养基中，加入酶混合物(enzymecocktail)，轻轻地4吏溶液混合，以l吏酶完全溶解。破裂培养基0.05%NonidetP-400.1%BSA0.001%硫酸葡聚糖钾使用下述分散过程在解剖显微镜下解剖花芽。采集一个花药，测量长度(粗线期为2.1mm)，在干净的载玻片上切下尖端。将PMC挤出花药，立即滴加一滴2%醋酸-地衣红溶液。盖上盖玻片。使用酒精灯烘烤几秒钟，这会使细胞变得松弛。在盖玻片上放上纸巾，使用解剖针的钝端轻敲盖玻片。在酒精灯上烘烤载玻片，用相差镜(phasecontrast)观察。若阶段合适，则收集4个余下的花药，将它们转移至含有200jiL消化培养基的凹玻片上。切下花药尖端，在消化培养基中小心地挤出花粉母细胞(PMC)(如果PMC分散在消化培养基中，那么它们可能处于晚于粗线期的阶段，则延长消化时间，直到PMC完全透明)。在湿室中室温下，在消化培养基中孵育lOmin以上(推荐15min)。使用硅化微量吸管(通过在火焰中拉制硼硅酸盐毛细管获得)，在尽可能少的体积的消化培养基(最多0.5jiL)中，收集多至4管细胞。通过悬挂于微量吸管尖端的10jiL破裂培养基液滴放出细胞。立即将含有细胞的破裂培养基液滴加入置于辉光放电载玻片(glow-dischargedslide)中心的4%PFA的PBS溶液(pH7.4)的10液滴中(载玻片上PFA的终浓度为2%)。使细胞膨胀并破裂，使载玻片完全风干。使用相差光镜检查分散是否合适。在0.4%Photoflo200的水溶液中洗涤载玻片5min。在MilliQ水中洗涤载玻片2次5min。使载玻片在试管架上风干。将载玻片包上铝箔，保存于-72。C下备用。MLH1焦点和SMC的免疫标i己过程将载玻片在室温下l吏用6003%BSA、0.1%TritonX-100的PBS无菌过滤溶液(添加有0.01%叠氮化纳，pH7.4)封闭30min。将载玻片在湿室中使用100fiLRabaLeMLHl的C末端(用封闭液以l:50稀释)在37n孵育1小时，在4匸孵育48小时，再在37'C孵育1小时。在孵育过程中，使用盖玻片将栽玻片盖上。将载玻片使用滤过的PBS在室温下洗涤3次5分钟。将载玻片在37°C的湿室中，使用100jiL/载玻片的GaRab-FITC-Fab(用封闭緩冲液以1:200稀释)赙育2小时以上。在孵育过程中，使用盖玻片将栽玻片盖上。将载玻片在室温下使用滤过的PBS洗涤3次5分钟。将载玻片在湿室中使用100jiL/栽玻片的兔抗LeSMCl的N末端(用封闭緩沖液以l:50稀释)在37t:下孵育1小时，在4t:下孵育过夜，再在37。C下孵育1小时。在孵育过程中，使用盖玻片将栽玻片盖上。将载玻片在室温下使用滤过的PBS洗涤3次5分钟。将载玻片在37X:的湿室中，使用100nL/载玻片的GaRab-TR(用封闭緩冲液以1:100稀释)孵育2小时。在孵育过程中，使用盖玻片将栽玻片盖上。将载玻片在室温下使用滤过的PBS洗涤3次5分钟。将载玻片用FITC緩沖液短暂冲洗。将载玻片在含ljig/mLDAPI的Vectashield中封固，使用透明指曱油密封。CENP-C的免疫标记过程将载玻片在PBS中浸泡约15min使指曱油软化。用小镊子除去指曱油。将载玻片进一步洗涤，直到盖玻片脱落。将载玻片在PBS中全面洗涤(3次以上，5分钟)。将载玻片使用600jiL/载玻片的封闭緩沖液封闭30min。将载玻片在湿室中使用100^L/载玻片的RabaLeCENP-C(用封闭液以1:100稀释)在37t:孵育1小时，在4i:孵育过夜，再在37C孵育1小时。将载玻片在滤过的PBS中洗涤3次5分钟。将载玻片使用100^L/栽玻片的GaRab-FITC-Fab(用封闭緩冲液以1:200稀释)孵育2小时以上。将栽玻片使用封闭緩冲液洗涤3次5分钟。将载玻片用FITC緩冲液快速冲洗。将载玻片在含lng/mLDAPI的Vectashield中封固，使用透明指曱油密封。后处理观察之后，使用AdobePhotoshop7和ImageJ.进行图像增强、处理和登记。使用我们自己为图像分析程序ObjectImage编写的宏进行测量。使用MicrosoftExcel2003、GraphPadPrism4、GenStat7和SigmaPlot9进行数据分析。4.抗MLH1抗体只检测干扰交换因为缺少合适的抗体，所以在植物中，免疫细胞化学方法一直没有跟进。然而对于番茄，基于联会复合体(SC)中晚RN的超微结构检测，已经构建了详细的重组图(上述ShermanandStack,1995)。为了使用免疫细胞学技术构建详细的番茄重组图，必须能够鉴别出番茄的12条染色体以及重组节(RN)的位置。基于SC的相对长度及其各自的臂长比，能够对番茄中的染色体进行鉴别。如上所述，我们已经分离了编码MLH1、凝集蛋白SMC1和SMC3以及动粒蛋白CENP-C的番茄cDNA克隆，并且制备了识别这些蛋白质的抗体。抗SMC1抗体标记SC的轴向元件，而抗MLH1抗体标记粗线期SC上的浓缩的焦点。抗CENP-C抗体强烈地标记粗线期番茄性母细胞的分散标本上的着丝粒区。对113个分散粗线期核的分析可用于构建详细的櫻桃番茄重组图，并将这些结果与先前公开的ShermanandStack(1995，上文)的电镜数据进行对比。番茄花粉母细胞的分散标本使用兔抗SMC1或兔抗SMC3抗体、兔抗MLHl抗体和兔抗CENP-C抗体进行标记。使用DAPI对DNA进行复染。将单个的免疫荧光图进行叠加。使用AdobePhotoshop7和ImageJ处理和组合图像。结果列于表l和图l中。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>1)数据来自ShermanandStack,Genetics141(1995)683-7082)P为Y模型中干扰参数v的最大可能估计值(带有估计的标准误差)3)该预测值的假定条件是晚RN和MLH1焦点数目之间的差异是由于使用抗MLH1标记晚RN时随机失效所导致表1显示了由免疫荧光(IF)检测的每个SC的MLH1焦点数目与电子显微镜(EM)检测的晚RN数目之间的对比(1)。后2列表示没有任何MLH1焦点的SC的观测百分比，以及基于如下条件的预测百分比RN和MLH1焦点之间的差异是由于检测MLH1时的随机失效所导致(标本假象)，或者由于MLH1在RN中的停留时间有限。来自113个番茄核的分散SC的长度、MLH1焦点的位置以及着丝粒的位置，使用为用于图像分析程序Object-Image而自己编写的宏半自动地观寸量。Object-Image是一款由N.Vischer(UniversityofAmsterdam)开发的7>用禾呈序，是NIHImage(由NationalInstitutesofHealth的WayneRasband开发)的扩充版本。Object-Image可从http:〃simon.bio.uva.nl获得。单个SC可基于它们的相对长度和它们的臂长比来进行鉴别(1)。表1总结了这些结果，并将该结果与ShermanandStack(1995，见上文)的结果相比较。在开始实验前，预期在番茄中，免疫细胞化学检测到的MLH1焦点的数目和位置将与超微结构分析检测到的晚RN相对应，并代表所有的交换。这种预期的理由如下1)超微结构检测的晚RN与遗传图密切对应，两者都与染色体位置和频率相关(ShermanandStack,1995)。因此，晚RN最有可能标记所有的交换。2)迄今在所有分析过的生物体中，MLHl都是减数分裂交换所必需的(综述文章有Hoffmann,E.R.andBorts，R.H.2004.Meioticrecombinationintermediatesandmismatchrepairproteins.CytogeneticandGenomeResearch107:232-248.)。3)因此在小鼠中，MLHl焦点在染色体上的位置与交换位置相对应(Froenicke,L.，Anderson,L.K.，Wienberg，J.,andAshley,T.2002.Malemouserecombinationmapsforeachautosomeidentifiedbychromosomepainting.Am.J.Hum.Genet.71:1353-1368.)，在小鼠中除去MLHl就除去了几乎所有的交换(Woods,L.M.，Hodges,C.A.，Baart，E.，Baker,S.M.，Liskay，M.，Hunt,P.A.1999.Chromosomalinfluenceonmeioticspindleassembly:abnormalmeiosisIinfemaleMLHlmutantmice.J.CellBiol.145:1395-1406)。因此，检测到的MLHl焦点比晚重组节少大约30%这一发现完全令人吃惊。MLHl焦点和晚RN之间的这30%的差异并不是由于在晚RN中检测MLHl的随机失效导致的，也不是由于在晚RN中MLHl的停留时间有限导致的，因为那样会导致具有零MLH1焦点的SC的频率大大增加(表l和下文的计算)。因此，MLHl焦点代表了另一类RN,它在染色体上的排布方式使得每条染色体可以获得至少一个MLHl焦占MLHl焦点和晚RN之间的另一个区别是MLHl焦点表现出比晚RN高得多的干扰水平。干扰水平可表示为干扰参数n(参见下文的计算)。对于染色体l的长臂，MLHl焦点的n等于7，而RN的只等于2.9(ShermanandStack,1995)。因此，本发明人还分析了Sherman等人(1995)所观察到的RN的分布是否是由高干扰性的、含MLH1的RN和低干扰性或无干扰性的、MLHl阴性RN的混合作用所导致。我们仅仅对于染色体1的长臂进行了充分的观察以对此进行验证。该分析的结论是Sherman等人(1995)所观察到的RN的分布很有可能是由含MLHl的、高干扰性RN与MLHl阴性RN混合作用所导致，MLHl阳性和MLHl阴性RN来自同一群显示低水平干扰的前体。本发明人还测试了推测的晚RN的前体(早RN)是否显示低水平干扰，证明确实如此(早RN的数据来自Andersonetal"2001，Genetics159:1259-1269)。既然观察到的无MLH1焦点的SC百分比远低于预测值(该预测值的假定条件是RN和MLH1焦点之间的差异是由于检测MLH1的随机失效，或者由于RN中MLH1的停留时间有限(表1)所导致的)，那么该差异一定另有原因。在拟南芥中有两类交换70-75%为干扰敏感性的，其余25-30%为干扰不敏感的(Chenetal.2005)。MLH1焦点表现出干扰性，既然抗MLH1抗体只检测到EM所，见察到的晚RN的大约70%，可推知番茄像拟南芥一样，具有两类交换，一类是干扰性交换，一类是非干扰性交换。另外，可以得出结论，只有代表干扰交换的RN包含MLHl。总而言之，抗MLHl抗体特异性地检测干扰性同源重组事件。该发现既可用于对干扰性减数分裂同源重组事件进行定量，也可用于测定代表干扰交换的RN在染色体上的位置。另外，还提供了一种工具，用于测量各种条件和遗传组成对不同途径的影响。计算具有零MLHl焦点的SC的预测频率，假定没有被抗MLHl标记的30%交换/晚RN是由于在晚RN中检测MLHl的随机失效，或者由于MLH1在晚RN中停留时间有限。为了进行计算，我们应该知道-晚RN的频率；这些数据来自ShermanandStack(1995)表5。-晚RN在各条染色体上如何分布。为此我们分析了Sherman和Stack的表10中的数据，这些数据表明了在12条番茄染色体的长臂的常染色质中晚RN的位置。对于染色体1到8，已经有充分的观察可用来分析RN是如何分布的。对于所有被分析的染色体，我们发现相邻RN之间的距离可拟合到Y分布(参见下文的解释)，干扰参数n的估计值在2.3和3.2之间，见图2。在图2中，RN间距离对所述距离的相对频度作图；符号表示Sherman和Stack的表10中的现象，线条显示对Y分布的最佳拟合。如果RN间距离可拟合至Y分布，这也许表示RN之间有干扰。n是Y分布公式中的参数。右边的表显示n取何值时可获得最佳拟合。如果RN沿染色体随机分布，则n等于l;如果11>1，则RN之间存在干扰，n越大，干扰越强。为进行进一步计算，我们假定番茄染色体上的晚RN显示低水平的干扰，n=3。然后我们计算具有零MLHl焦点的SC的预测频率，假定对MLHl进行免疫细胞化学检测时在30V。晚RN中随机失效。对于每条染色体，给定了该染色体上晚RN的平均频率(Sherman表5)并假定11=3，我们在至少5000个拷贝上模拟了晚RN的位置。随后，我们随机取走没有被抗MLH1标记的RN部分(例如，对于染色体l，该部分为0.76/2.48=0.31)，并测定具有零MLH1焦点的染色体的SC百分比。该百分比远高于我们的，见测值(表1)，因此我们可以得出结论，MLH1焦点和晚RN的频率之间的差异不是由于检测晚RN中的MLH1的随机失效导致的，MLH1焦点代表另一类RN(从而代表另一类交换)。计算2我们试图回答的问题是有没有可能通过将高干扰性MLH1阳性RN与MLH1阴性RN混合，从而获得Sherman和Stack(1995)所观察到的晚RN分布？如果可以，MLHl阴性RN在SC上是如何分布的？图3显示1号染色体的长臂上晚RN之间的距离(间隔大小)的频度分布。条柱表示来自ShermanandStack,1995中表10的数据，(线条表示对Y分布的最佳拟合；该拟合在n=2.9时获得)。间隔大小以任意单位给出。图4显示RN间距离的预期频度分布。横轴按图3的横轴的比例绘制。条柱只代表1.4焦点/长臂和n=7的情况下，MLHl焦点之间的距离的预期分布。该分布与本发明人观察到的分布情况类似，与图3中的情况明显不同峰更偏向右侧，没有非常小的焦点间距离。在模拟过程中，我们发现，如果将干扰阴性RN置于完全不受MLH1焦点影响的位置，总是会出现比Sherman和Stack所观察到的更多的微小间隔。一个实例通过褐色/黑色线条示出，它代表RN(MLH1阳性和阴性)之间距离的预期分布，条件是，平均每个染色体1的长臂上放置0.63个非干扰性、MLH1阴性的RN，并且平均每个长臂上放置1.4个MLH1焦点，这样使MLH1阳性RN不影响MLH1阴性RN的位置，反之亦然。这将产生比Sherman和Stack(ShermanandStack,1995)所观察到的多得多的孩史小焦点间距离。然而，如果我们假定MLH1阳性、高干扰性RN和MLH1阴性RN不是位于完全独立的位置，而是来自同一群前体，且这些前体已经显示出较低水平的干扰性(n=2)，我们得到了与Sherman和Stack所获得的RN间距离的分布类似的RN间距离的分布(黄色/浅色线条)。总之，我们从这些模拟中推得，MLH1代表了强干扰RN(因此也是强干扰交换)的一个亚群，我们认为MLH1阳性和MLH1阴性RN来自同一群已经表现出低水平干扰的前体。我们测试了该模型的一个方面，即晚RN的前体已经表现出低水平的干扰早RN是晚RN的候选前体，我们发现它们表现出低水平的干扰(n=2-3)(数据来自Andersonetal"2001，见上文)。该模型的另一个可测试的方面是超微结构检测到的晚RN中70%包含MLH1。这将使用抗MLH1抗体，通过免疫EM进行测试。5.丄g附狄7序列优化以用于在番茄中的表达在LMLHl基因的经完全测序的ORF中，存在许多常用的限制酶识别位点。在不改变氨基酸翻译的情况下除去下列位点(252位的ATG):251位的Ncol、604位的EcoRI、1004位的HindIII以及156和1356位的Sacl。除去Ncol位点以使新的Ncol位点可用于将来的克隆。除去EcoRI位点以使得可在nos终止子的末端使用EcoRI位点。除去HindIII位点以使得可在AtDMCl启动子的末端附近使用天然的HindIII位点。除去Sacl位点以便在nos终止子的5'端使用类似的位点。保留了一部分LeMLHl3'UTR。保持LeMLHIORF的终止密码子和nos终止子的polyA信号之间的序列长度与gusA表达构建体的相同。由于序列优化(参见下文)，使587位的BamHI位点消失，并使新的BamHI位点出现在1223位。随后，gusA序列;故下面的优化的Zem//^序列卩戈替。丄em//^核酸序列按下列方式优化4吏密码子选择适应番茄(丄j;c0/;era/c0/1"c"/eW"附)基因的密石马子偏好，并且尽可能避免非常高(>80%)或非常低(<30%)GC含量的区域。这通过GeneArt(Germany)完成。对LeMLHlORF进行优化的目标是达到大约50%的相对高的GC含量。天然状态下的GC含量通常在30%到40%，但预期较高的含量可增强转基因表达。ORF中的许多核苷酸被改变，但翻译后的预期氨基酸序列保持不变。而且，在密码子优化过程中，避免出现下列顺式作用序列基序-内部TATA盒、x-位点和核糖体进入位点；-富含AT或富含GC的序列链；-RNA不稳定性元件；-重复序列和RNA二级结构；-(隐含的)剪接供体和受体位点。优化的丄e附狄J核酸序列在SEQIDNO:2中示出，该序列与野生型cDNA编码相同的氨基酸序列，将其用于构建表达栽体(下文)。6.构建栽体和产生转基因番茄植物这项任务的目标是将LeMLHl克隆到AtDMCl启动子之后。根据"经典的"重组克隆方案，新的接头需要与LeMLHl和AtDMCl启动子相连以帮助定向克隆。然而，在对序列进行进一步分析之后，发现完成这项方案似乎非常困难，因为该启动子和LeMLHl包含许多限制位点。结果，若使用"经典的"克隆方法(如果可能)，则需要大量的不同的克隆步骤才能产生最终的AtDMCl::LeMLHl构建体。决定选择另一种方法，该方法是在计算机上设计最佳的AtDMCl::LeMLHl构建体，并订购人工合成的带有一些侧翼序列的LeMLHl。结果，制备出了AtDMCl::LeMLHl构建体，它的启动子或编码序列可以容易地与其他序列相交换。要合成的序列包括AtDMCl启动子的末端部分，gus的5，UTR，LeMLHl编码序列，LeMLHl的3，UTR，nos终止子和其他限制位点。使用该构建体转化番茄植物，产生了转基因植物。对这些植物进行了细胞学分析。7.在过表达MLH1基因的番茄植物(DMC1::MLH1)中，减数分裂同源重组(MHR)增加方法植物材料对照植物为Enza樱桃植物。转基因植物为10号DMC1::MLH1转化体。用于免疫荧光的染色体分散的制备消化培养基(TE)使用800mMTris-HCl、500mMEDTApH7.01100X储液。为了制备，称取适量Tris和EDTA，将它们溶于MilliQ水，使用HC1调节pH至7，加MilliQ至终体积。加入0.7M甘露醇(Sigma，MW182.17，637.7mg/5mL)和1%PVP(MW44，000，50mg/5mL)。完全溶解，即可使用(pH6.98)。在1mL消化培养基中加入5mg冻干的来自罗曼蜗牛(Helixpomatia)的脱盐胞旋酶(cytohelicase)(SigmaC-8274)、3mg纤维素酶onozuka(YakultHonshaCoLTD)和3mg来自日本曲霉(Aspergillusjaponicus)的果胶酶(pectolyase)(SigmaP-3026)。轻轻混合，使酶完全溶解。破裂培养基0.5%NP400.1%BSA新制备的2%PFA溶液将lgPFA与50mLMilliQ混合。加入1滴INNaOH。加热到60。C直到完全溶解。在冰上冷却。用0.2jim滤器过滤。将溶液放置在冰上。辉光放电载玻片在70%乙醇中对载玻片进行超声处理15分钟。将载玻片在MilliQ水中煮20-30分钟的沸腾时间。将热载玻片置于试管架上，使它们风干过夜。将干净的载玻片置于塑料盘中。在0.1托的真空度(使用氩气调节真空度)中，以3A对载玻片辉光放电5分钟。分散过程在解剖显微镜下解剖花芽。采集一个花药，测量长度(粗线期为2.1mm),在干净的载玻片上切下尖端。将PMC挤出花药，立即滴加一滴2%醋酸-地衣红溶液。盖上盖玻片。使用酒精灯烘烤几秒钟。在盖玻片上放上纸巾，使用解剖针的钝端轻敲盖玻片。在酒精灯上烘烤栽玻片，用相差镜观察。若阶段合适，则收集4个余下的花药，将它们转移至含有200pL消化培养基的凹玻片上。切下花药尖端，在消化培养基中小心地挤出PMC(如果PMC分散在消化培养基中，那么它们可能处于晚于粗线期的阶段，则延长消化时间，直到PMC完全透明)。在湿培养箱中25X:下，在消化培养基中孵育20min。使用硅化微量吸管，在尽可能少的体积的消化培养基(最多0.5nL)中，收集多至4管细胞。通过悬挂于微量吸管尖端的10jiL破裂培养基液滴放出细胞。将含有细胞的精母细胞裂解緩沖液液滴加入置于辉光放电载玻片中心的新制备的2%PFA的10pL液滴中(栽玻片上PFA的终浓度为1%)。在完全密闭的湿室中放置大约1小时到卯分钟，使细胞膨胀并破裂。使载玻片完全风千。使用相差光镜检查分散是否合适。在0.4%Photoflo200的水溶液中洗涤载玻片5min。在MilliQ水中洗涤载玻片1次，5min。将4禺数载玻片在PBS中洗涤,立即进4亍免疫才示卡己处理。免疫标记将偶数载玻片在1%BSA、0.1%TritonX100、0.05%NaN3的滤过PBS溶液(pH7.4)中，在室温下封闭30分钟。将栽玻片在黑暗的湿室中使用100jiL/载玻片的RabaLeMLHl(封闭液中1:100稀释)在37匸孵育l小时，在4C孵育48小时，再在37匸孵育1小时，在4"C离心30分钟。将载玻片使用滤过的PBS洗涤3次5分钟。将栽玻片在37。C的黑暗的湿室中，使用100jiL/载玻片的GaRab-FITC-Fab(用封闭緩冲液以1:200稀释)孵育2小时。将载玻片在暗处使用滤过的PBS洗涤3次。将载玻片在黑暗的湿室中使用100jiL/载玻片的RaLeSMCl(用封闭緩冲液以1:50稀释)在37C下孵育1小时，在4C下孵育过夜，再在37。C下孵育l小时，在4'C下离心30分钟。将载玻片使用滤过的PBS洗涤3次。将载玻片在的黑暗的湿室中，使用100pL/载玻片的GaRab-TR(用封闭緩冲液以1:200稀释)孵育2小时。将载玻片使用滤过的PBS洗涤3次。将载玻片在含lpg/mLDAPI的Vectashield中封固，使用透明指曱油密封。将载玻片保存于-20。C下直到观察(在-20。C下约4天)。制备用于交叉计数的染色体分散Zhongetal.ChromosomeResearch4:24-28(1996)从对照Enza樱桃番茄和10号番茄DMC1::MLH1转化体，收集不同阶段的花芽，保存于含有湿纸的试管中。切开花芽，通过在2%的醋酸-地衣红中压片，鉴别出终变期和晚双线期阶段。将余下的4个花药在Carnoy液(乙醇乙酸3:1)中固定20分钟。将花药在蒸馏水中洗涤两次，在2mL含0.3%果胶酶、0.3%纤维素酶、0.3%胞旋酶的30mM柠檬酸钠緩冲液(使用INHC1调节至pH4.5)中，在37。C下消化2小时。将花药在蒸馏水中洗涤3次，保存于水上备用。将一个花药转移到千净的载玻片上。加入5ftL蒸馏水，切下花药尖端，将PMC挤出花粉嚢。在细胞悬液中加入50pL(10倍体积)的50%乙酸，将栽玻片转移到热板U2X:)上，用细针在不接触载玻片的情况下(用针拉动液滴移动)混合大约60秒。在该步骤中，胞质应溶解，乙酸蒸发。在含有细胞的水滴周围加上1mL冰冷的Carnoys固定剂，仍然用针划圆拖动水，直到与Carnoy固定剂混合。在完全蒸发之前，再添加一些固定剂，并使其干燥。将载玻片在96。/。的乙醇中短暂地浸渍，使用吹风机干燥。可将载玻片在-20。C下保存数月。将栽玻片立即用10pg/pLDAPI的Vectashield溶液染色，保存于-20°C，直到观察。结果通过免疫荧光和交叉计数，分别分析了来自10号DMC1::MLH1转化体的38和93个核，以及来自对照植物的35和99个核。制得相对频度分布图，采用不成对的t检验，对各群进行统计学比较。结果在图5和6中示出。免疫荧光数据表明，10号MLH1过表达植物中的MLH1焦点的平均数目显著高于对照植物(分别为21.47和15.71，p<0.001)，这表明净增长了36.67%(图5)。交叉计数数据表明，IO号MLHI过表达植物中的交叉的平均数目显著高于对照植物(分别为21.77和19.56，pO.OOl)，这表明净增长了11.28%(图6)。权利要求1.一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物与非转基因植物相比，其染色体上减数分裂同源重组频率升高和/或减数分裂同源重组事件的位置改变，所述方法包括下列步骤(a)使用编码MLH1蛋白的核苷酸序列对植物或植物细胞进行转化，所述MLH1蛋白包括与SEQIDNO3的至少70％的氨基酸序列同一性，所述核苷酸序列与在植物细胞中具有活性的启动子有效连接，以及(b)再生一种植物。2.根据权利要求1的方法，其中所述核苷酸序列整合到所述植物的基因组中。3.根据权利要求1或2的方法，进一步包括步骤(c)使用所述植物产生另一种植物或一群植物，并且任选地，从所述一群植物中选择一种或多种植物。4.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述的减数分裂同源重组频率升高是减数分裂干扰交换频率升高。5.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述的减数分裂同源重组频率与非转基因植物相比升高至少10%。6.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述的启动子为减数分裂偏向性或减数分裂特异性启动子，或者为诱导型启动子。7.根据任一项前述权利要求的方法，其中编码所述MLH1蛋白的核苦酸序列的密码子选择已被改变得适合于转化的植物属或植物种的密码子选择。8.根据任一项前述权利要求的方法，其中在细胞学分析中，优选在权利要求11-15的分析中，使用抗MLH1抗体对所述植物的一条或多条染色体上的减数分裂同源重组频率和/或减数分裂同源重组事件的位置进行评估。9.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述植物属于茄科(5Wfl鼎"tfe),优选属于痴属(5W<mw)。10.—种转化的植物或植物种子，或者一种转化的植物的细胞，或者一群转化的植物或种子，它们可通过权利要求1-9任一项的方法获得。11.一种抗MLH1抗体在细胞学分析中用于测定植物细胞中干扰性减数分裂同源重组事件的频率的用途，所述方法包括(a)制备减数分裂粗线期细胞的样本，(b)使所述样本接触至少一种抗MLH1抗体，任选地接触可标记联会复合体的轴向元件的抗体和/或可标记着丝粒区的抗体，任选地，使用DAPI对染色体DNA进行复染，以及(c)测定每个细胞中标记的MLH1焦点的数目，优选使用光学显微镜或电子显微镜。12.—种抗MLH1抗体在细胞学分析中用于测定植物细胞中干扰性减数分裂同源重组事件的位置和分布的用途，所述方法包括(a)制备一种减数分裂粗线期细胞的样本，(b)使所述样本同时或先后接触至少一种抗MLH1抗体、一种可标记联会复合体的轴向元件的抗体和一种可标记着丝粒区的抗体，任选地，使用DAPI对染色体DNA进行复染，以及(c)测定每个细胞中标记的MLH1焦点的数目，优选4吏用光学显微镜或电子显微镜。13.根据权利要求11或12的用途，其中所述的可标记联会复合体的轴向元件的抗体为抗SMC1或抗SMC3抗体，并且所述的其中可标记着丝粒区的抗体为抗CENP-C抗体。14.根据权利要求11-13任一项的用途，其中所述的抗MLH1抗体由SEQIDNO:3的至少5个连续的氨基酸所诱导产生，或者由与SEQIDNO:3具有至少50%序列同一性的序列的至少5个连续的氨基酸所诱导产生。15.根据权利要求13或14的用途，其中所述的抗MLH1抗体、所述的抗SMC1抗体、所述的抗SMC3抗体和所述的抗CENP-C抗体分别由SEQIDNO:4、SEQIDNO6和SEQIDNO:8所诱导产生，或者由这些序列的片段所诱导产生，所述片段包含至少5个连续的氨基酸。16.—种MLH1蛋白，或者编码一种MLH1蛋白的核酸序列，或者一种由MLH1蛋白诱导产生的抗体，在检测植物细胞减数分裂同源重组事件，或者在改变植物减数分裂同源重组事件的频率和/或位置中的用途。17.—种多克隆或单克隆抗体，所述抗体由SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8所诱导产生，或者由这些序列的片段所诱导产生，所述片段包含至少5个连续的氨基酸。18.—种分离的蛋白质，包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，或者包含与SEQIDNO:3的至少60%的氨基酸同一性。19.一种分离的核酸序列，所述核酸序列编码权利要求18的MLH1蛋白。20.根据权利要求19的核酸序列，其中所述序列包含SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的核酸序列。21.—种分离的编码MLH1蛋白的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列的GC含量已被改变以使该GC含量与分离所述核酸序列的物种的GC含量相比至少相等或者更高，同时不改变所述MLHl蛋白的氨基酸序列，并且/或者特征在于，至少2个不同的限制酶的限制酶识别位点已被除去，同时不改变所述MLH1蛋白的氨基酸序列。全文摘要本发明涉及植物的减数分裂同源重组领域。提供了转基因植物、细胞学分析以及MLH1蛋白和核酸序列，以及抗MLH1抗体、抗SMC1、抗SMC3和抗CENP-C抗体。文档编号C12N15/01GK101300349SQ200680041296公开日2008年11月5日申请日期2006年9月6日优先权日2005年9月9日发明者C·海汀,F·G·P·休斯尔,H·H·奥芬柏格,I·M·布鲁吉曼,P·E·威蒂克申请人:关键基因公司