用于检测样品中靶细胞存在与否的方法

专利名称：：用于检测样品中靶细胞存在与否的方法用于检测样品中耙细胞存在与否的方法
技术领域：
：本发明涉及用于检测样品中靶细胞存在与否的方法，尤其是用于检测样品中靶细菌存在与否的方法，所述方法包括基于核酸的检测步骤。目前使用的许多检测样品中细胞类型或微生物的方法依赖于DNA或RNA的鉴定，例如诊断微生物感染、法医学、组织分型和血型分型、检测遗传变异等。目前，人们普遍认可将使用DNA或RNA鉴定作为一种手段，用于区分不同细胞或细胞类型，或者区分相同细胞类型中含有DNA突变的变体。因此，更普遍地通过使用抗体鉴定特征性表面抗原来进行的HLA分型也可以替代性地通过鉴定编码这些抗原的DNA来实现。微生物感染或污染可以通过检测靶生物的核酸分析来鉴定，而不是依赖于检测细胞或微生物的表现特征(例如通过形态学或生物化学标记来检测)。遗传变异也可通过相似的手段来鉴定。一般而言，通过在足以确保低水平非特异结合的条件下与一个或多个寡核苷酸杂交来鉴定DNA或RNA。通常，所述杂交的核苷酸成对使用，作为引物用于多种目前可用的体外扩增形式中，主要是聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)和链置换分析(StrandDisplacementAnalysis,SDA)，以及连接酶扩增反应(LigaseAmplificationReaction,LAR)、自持续序列复制(Self-SustainedSequenceReplication,3SR)和Q-p复制酶扩增体系。扩增后，可通过测序进一步表征DNA,例如使用Sanger法。扩增和测序可以组合在一起。基于核酸扩增的所有检测方法中的一致主题是存在最初的核酸分离步骤，用于将核酸从可干扰所使用的杂交和/或扩增技术的材料(例如蛋白质)中分离出来。已知一系列用于分离核酸的方法，但是一般而言，它们依赖于一系列复杂的提取和洗涤步骤，并且进行起来费时费力。用于从复杂的起始材料(如血或血液制品或组织)中分离核酸的经下进行)，然后对核酸用有机溶剂如苯酚和/或氯仿萃取数次、乙醇沉淀、离心和透析。这些方法不仅进行起来繁复费时，而且所需相对多的步骤提高了降解、样品损失或者在同时处理若干样品时样品交叉污染的风险。因此一直在寻求对核酸分离方法的改进。已经提出了依赖于4吏用固相的方法。例如在US-A-5，234，809中描述了一种方法，其中在离液剂如胍盐存在下，核酸与二氧化硅微粒形式的固相结合，由此与样品的其余部分分离。WO91/12079描述了一种方法，其中核酸通过沉淀停留在固相表面.一般而言，使用醇和盐作为沉淀剂。核酸所来源的细胞可通过过滤、离心或与附着在固相上的抗体亲和结合而首先从样品中分离。以这种方式浓缩细胞后，接着从浓缩的细胞中纯化DNA，这通常是通过上述经典酚/氯仿抽提法进行，也带有其附带的缺点。已经描述了其它方法(US-B1-6,255,477)，所述方法涉及细胞与第一固相结合、裂解这些细胞和随后将释放的核酸与第二固体支持物结合的连续步骤。这些方法已经被进一步开发，以使细胞和释放的核酸与相同的固体支持物结合(W098/51693和WO01/53525)。发明人已惊讶地发现，比WO98/51693中所述简单得多的方法也是有效的。尤其是不需要将释放的核酸与固体支持物结合的单独步骤，因而需要更少的试剂和更少的步骤，例如不需要核酸结合緩冲液。照这样，通过进行起来简单并快捷的程序来确定样品中靶细胞的存在与否，耗时可少于30分钟。因此，本发明第一方面提供了用于检测样品中耙细胞存在与否的方法，所述方法包括(a)将所述样品中的细胞与微粒状可混合固体支持物结合；(b)将细胞从该固体支持物上洗脱，而不使用竟争分子破坏细胞与固体支持物之间的相互作用；(c)裂解所述细胞后，检测所述靶细胞特征性的核酸存在与否，其中所述固体支持物上没有固定抗体或抗体片段。检测步骤(C)通常包括核酸扩增方法。术语"细胞"在本文中作为一种便利的方式使用，用于指代所有的原核(包括古细菌和支原体)和真核细胞以及其它活的实体如病毒，以及亚细胞区室如细胞器。因此，代表性的"细胞"包括所有类型的哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞、原生质体、细菌、原生动物和病毒。该术语的这种用法并不意味着能推出病毒特异性或细胞(即原核和真核)特异性检测方法的互换性。"靶细胞"也可以是具体的细胞类型或选定细胞的变体。例如，靶细胞可以与样品中其余细胞是相同的细胞类型和来自相同的生物，但是其与样品中其余细胞在至少一个方面不同，例如特定基因中的特定突变。优选地，所述细胞为原核细胞或真核细胞，更优选为原核细胞。最优选的原核细胞是革兰氏阴性菌(例如百日咳博德特氏菌(丑^&&//"pe"MSS/s)和淋病奈瑟氏菌(7V"'S5W/flg0W<WT/we"e))、柔膜细菌(支原体和尿素原体，众lj如肺炎支原体(聊co/;/as附fl/wew附ow/fle))和衣原体(例如沙眼衣原体(CA/fl附j;力Vifmc/^挑flf/s)和肺炎衣原体(C7^/fl/iy^ifl/meM附owi'"e))。因此，样品可以是含有这些细胞内的核酸的任何材料，包括例如食物和相关制品、临床和环境样品。因此，样品可以是生物样品，其可含有任何病毒或细胞材料，包括所有原核或真核细胞、病、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。因此这样的生物材料可包含所有类型的哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞、藻类包括蓝-绿藻类、真菌、细菌、原生动物等。因此代表性样品包括取自人或动物体的临床样品如全血和血衍生制品，如血浆或血沉棕黄层、尿、粪便、脑脊液或任何其它体液、组织、细胞培养物、细胞悬液等，以及例如通过体腔拭子获得的样品。其它的代表性样品包括环境样品，如水样(例如来自湖、河、污水处理厂和其它水处理中心)或土样或食物样品。优选的样品为尿、呼吸道样品以及血浆和其它血液制品組分。所述方法在食物样品分析以及一般健康和卫生应用(其中期望监测例如食物制备区域中的细菌水平)中也具有显著的效用。例如，可以分析乳制品中的李斯特菌属。已经证明，使用固定化抗体分离细菌的常规技术远不如我们使用非特异性配体分离李斯特菌属的方法有效，这可能是由于固定化抗体的疏水性质所致。当样品为水样时，配体优选为目的微生物的养分。可按如下分析食物样品首先在需要时(如果是固体样品)匀桨，然后与合适的孵育培养基(例如蛋白胨水)混合并在371C下孵育过夜。食物如乳酪、水激凌、蛋、人造黄油、鱼、虾、鸡、牛肉、猪排、面粉、燕麦片、米饭、胡椒、蔬菜(如番茄、花茎甘蓝、豆类、花生)和杏仁糖可以以此种方式进行分析。本发明的方法对分析食物样品特别有益，因为它们含有大量固体材料(凝块和脂肪颗粒)，这些固体材料很可能堵塞滤器并在离心后产生沉淀，在这些沉淀中细菌被包起来，不能被裂解或与抗体结合。样品还可包括相对纯净或被部分纯化的起始材料，例如通过其它细胞分离方法获得的半纯净制备物。本发明方法中使用的固体支持物为微粒状，并且是可混合的，即能够被混合。为了成为"可混合的"，样品组分和固体支持物组分可在混合步骤中均分散在另一组分之中，即两种组分均可移动。微粒状材料(例如珠子)由于其更大的结合容量因而是有利的。纤维被认为是可混合的微粒状固体支持物。优选显示用于细胞结合的高表面积的材料。这样的支持物一般会具有不规则的表面，并可例如是多孔的。支持物可以便利地由玻璃、二氧化硅、胶乳或聚合物材料制成。优选地，微粒由聚合物材料制成。根据本发明使用的微粒状固体支持物应便利地包含珠子，优选球形或基本为球形的珠子。珠子的尺寸不是关键性的，但是它们可例如具有至少lnm、优选为至少2jim级别的直径，并具有优选不大于10jim、更优选不大于6jim的最大直径。例如，直径2.8jun和4.5nm的珠子已经显示工作良好。单分散微粒，即尺寸基本均一(例如尺寸的直径标准差小于5%)的微粒具有下述优点它们提供非常均一的反应再现性.通过US-A-4336173中所述技术获得的单分散聚合物微粒是特别合适的。适用于本发明方法的非磁性聚合物珠子可得自DynoParticlesAS(Lillestr0m,Norway)以及Qiagen、Pharmacia和Serotec。然而，为了辅助操作和分离，优选磁性珠。本文使用术语"磁性"表示支持物在置于磁场中时能够被赋予磁矩，从而能在所述场的作用下移动。换言之，包含磁性微粒的支持物可通过磁性聚集而容易地取出，这提供了在细胞与核酸结合的步骤之后分离微粒的快速、简单和有效的方式，并且是比产生剪切力的传统技术(如离心)温和得多的一种方法，所述剪切力可破坏细胞或降解核酸。因此，使用本发明的方法，可以通过施加磁场(例如使用永磁体)将与细胞结合的磁性微粒移至合适的表面上。在含有样品混合物的管侧面施加磁体通常足以将微粒聚集在管壁上，并倒掉样品的其余部分。特别优选的是超顺磁性微粒，例如Sintef在EP-A-106873中所述的那些，因为能够避免反应时微粒的磁性聚集和结块，从而确保均一性和和实现核酸抽提。由DynalAS(Oslo,Norway)以DYNABEADS销售的公知磁性微粒尤其适用于本发明。可以根据US专利4,336,173、4,459,378和4,654,267使珠子改性来制备用于本发明的功能化包被微粒。因此，珠子或其它支持物可以制备为具有不同类型的功能化表面，例如带正电或带负电、亲水或疏水。不同的细胞对不同表面和支持物显示不同程度的非特异性结合，"滴定"每体积单位中固体支持物的量(例如微粒数)从而优化细胞结合条件并确定最佳支持物面积(例如给定体系中的微粒浓度)可能是有利的。细胞与固体支持物的结合可以以任何已知或便利的方式实现。例如，细胞与支持物的非特异结合可以通过适当地选择固体支持物和条件来实现，例如选择固体支持物表面的化学或物理性质(例如疏水性或电荷)、分离介质的pH或组成等。"非特异性结合"指就存在的所有细胞的比例以及该细胞类型中的比例而言，样品中存在的大部分细胞(例如细菌)均与固体支持物结合。因此，样品中优选至少30%、更优选至少50%、最优选至少70%或80%的细胞(包含多种细胞类型)会与固体支持物结合。当然，样品中结合细胞的百分比将取决于添加进样品中的固体支持物的量以及细胞结合配体(如果存在的话)与细胞的比例。对于上述百分比而言，假定混合物中存在过量的固体支持物(和细胞结合配体，如果适用的话)。优选地，固体支持物将是能够结合样品中大部分或所有原核细胞的固体支持物。更优选地，该固体支持物将是还能够优先结合原核细胞胜过真核细胞的固体支持物。尽管因此存在一定程度的选择性，但是仍然认为该结合是非特异性的。结合步骤中使用的条件可影响这些能力，因此结合步骤中使用的条件应当相应地进行选择。技术人员能够调整结合条件，以针对其需要进行优化。因此，非特异性结合步骤优选导致样品中大部分或所有原核细胞与固体支持物结合。更优选地，非特异性结合步骤导致样品中大部分或所有原核细胞结合，但是没有或几乎没有真核细胞结合.靶细胞的性质也可能起作用，例如已经显示，某些疏水细胞可容易地与疏水表面非特异性结合，而亲水细胞可与更亲水的表面结合。还已观察到，带负电的细胞(如B淋巴细胞)与带弱正电的表面具有高水平的非特异性结合。因此，可以使用这样的固体支持物，其具有带适当电荷的表面用于结合想要的细胞类型。可使用适当的緩冲液等作为细胞结合步骤的介质，以实现适合细胞结合的条件，因此简单地使固体支持物与样品在适当的介质中接触会导致结合。可在与固体支持物接触之前、同时或之后向样品中便利地添加具有适当电荷、渗透性等的緩冲液。有利地，可以根据本发明通过使用沉淀剂将细胞沉淀在支持物上来实现细胞的非特异性结合，例如将细胞与支持物在存在醇和盐时接触，例如向样品中添加含有醇和盐的緩沖液。醇和盐在分离和纯化方法(例如沉淀)中的用途是很普遍的，并且这类步骤中使用的任何合适的醇或盐均可根据本发明使用。因此，醇可以便利地为任何链烷醇，已经发现低级链烷醇如异丙醇和乙醇是合适的。其它合适的醇包括甲醇和正丁醇。盐可以通过任何便利的来源(例如钠或钾的氯化物或乙酸盐，或乙酸铵)提供。醇和盐的适当浓度可以根据所使用的确切体系和试剂来确定。一般而言，发现向样品中添加0,5到3倍体积(例如l倍体积)的醇是合适的。醇可以在50-100%(重量/体积)的浓度下便利地使用。发现使用例如0.1M到10.0M、更特别地0.1M到7.0M(例如0.1M到3.0M)的盐浓度是合适的，并且盐可便利地以上述浓度包含在醇溶液中。因此，可以使用含有期望的醇和盐浓度的所谓"细胞结合緩冲液"。或者，盐和醇可以单独添加。使用醇作为本发明细胞的沉淀剂对于该方法在临床诊断方案中的用途是有利的，因为使用醇保存临床样品非常普遍。因此，可以简单地将患者样品添加至含醇的细胞结合緩冲液中，由此保存样品并准备用于纯化核酸。作为用盐/醇沉淀的备选方案，其它沉淀剂也可以单独或与盐和/或醇组合使用，例如聚乙二醇(PEG)或其它具有类似特性的高分子量聚合物。这些聚合物的浓度可取决于确切的系统(例如聚合物和细胞类型)而变化，但是一般使用1%到50%(重量/体积)的浓度，例如2-30%。具有吞噬活性的细胞可以通过其"结合"或"吞噬"微粒状固相(例如珠子)的能力而被捕获，由此能够容易地进行收集。在这种情况下，含细胞的样品将简单地在合适的条件下与固相接触或孵育。这类细胞捕获不依赖于特异性结合。也可以提供带有帮助细胞非特异性结合的部分的固体支持物，所述部分为例如被细胞非特异性结合的碳水化合物、蛋白质或蛋白质片段或多肽。因此，例如用碳水化合物包被的固体支持物通过细胞表面上的受体与细胞非特异性结合。用于将碳水化合物和其它蛋白质或多肽固定在固体表面上的技术是本领域公知的.如果在支持物上使用配体来实现非特异性结合，则认为该配体是"非特异性配体"。"非特异性"配体应当是能够结合多于一种细胞类型、优选结合多于2或3种、更优选结合多于5或7种(例如多于IO或14种)不同细胞类型的配体。配体与细胞表面上负责结合的其结合配偶体之间存在相互作用，这不像细胞通过沉淀结合时可能的情况那样只是在细胞与固体支持物之间存在一般的吸引或结合。配体的非特异性特性不是指其能够与细胞表面上的部分无差别地结合或联合，而是其结合配偶体不对某种细胞或细胞类型具有特异性。因此，可以认为所述配体是一般结合配体。如上所述，尽管被认为是非特异性结合，但是优选优先结核细胞的配体，但是结合样品中大部分或所有原核细胞的配体是最优选的。优选地，非特异结合不涉及蛋白质-蛋白质相互作用。因此，如果所述非特异性配体是蛋白质或蛋白质片段或多肽，则主要结合配偶体不是蛋白质或蛋白质的部分。优选地，非特异性配体是非蛋白质性的。优选地，所述非特异性配体是碳水化合物。合适的碳水化合物包括单糖、寡糖(包括二糖和三糖)和多糖。合适的单糖包括己糖和戊糖(在适当时为吡喃糖和呋喃糖形式)，以及糖衍生物如醛糖酸(aldonicacid)和糖醛酸(uronicacid)和脱氧糖或氨基糖、脱水糖和糖醇。合适的单糖可以为以下示例甘露糖(例如D-甘露糖)、半乳糖(例如D-半乳糖)、葡萄糖(例如D-葡萄糖)、果糖、岩藻糖(L-岩藻糖)、N-乙酰基-葡糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺、鼠李糖、半乳糖胺、葡糖胺(例如D-葡糖胺)、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、N-乙酰神经氨酸、甲基D-甘露吡喃糖苷(甘露糖苷)、a-甲基-葡糖苷、半乳糖苷、核糖、木糖、阿拉伯糖、糖二酸盐、甘露醇、山梨醇、肌醇、甘油及这些单体的衍生物。其中优选甘露糖、半乳糖、脱水半乳糖和岩藻糖。特别优选的是寡糖和多糖，它们是单糖单体的多聚体，例如掺入上述单糖单体及其衍生物的多聚体。寡糖包含2到12个、优选4到8个共价连接的单糖单元，所述单元可以是相同或不同的，并可以是线性或分支的，优选是分支的，例如具有2到6个单位的寡聚甘露糖(oligomannosyl)、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖和水扬苷，尤其是麦芽糖。用于生产寡糖的方法描述于Pan等InfectionandImmunity(1997)，4199-4206。多糖包含13个或更多个共价连接的单糖单元，所述单糖单元可以是相同的或不同的，并可以是线性的或分支的，优选是分支的。合适的多糖应富含甘露糖、半乳糖、脱水半乳糖、葡萄糖和/或果糖，例如半乳甘露聚糖(本文中称作GUM1)(SigmaG-0753),人们认为它是甘露糖的直链多聚体，每四个甘露糖上带有一个半乳糖分支。其它多糖包括阿拉伯胶(SigmaG9752)(人们认为它是半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和葡糖醛酸的支链多聚体)和卡拉牙胶(GumKaraya)(SigmaG0503)(人们认为它是半乳糖、鼠李糖和葡糖醛酸的部分乙酰化的多聚体)。由甘露糖和半乳糖亚单元组成的多糖是优选的配体类型，另一实例是瓜尔胶(guar)(Sigma,G1429),它具有pi,4连接的线性甘露糖主链，约每隔一个单元带有在一个1，6a键连接的半乳糖侧单元。甘露糖与半乳糖的比例为约1.8:1到约2:1。另一优选的配体类型是由甘露糖、半乳糖和脱水半乳糖亚单元组成的多糖，如角叉菜胶。作为合适配体的糖衍生物包括肝素、硫酸类肝素和硫酸葡聚糖。硫酸化的糖是优选的糖衍生物类别。合适的蛋白质配体包括能够如上所述与细胞非特异结合的凝集素或其衍生物片段。抗体或抗体片段不认为是合适的蛋白质。基于作为微生物养分的分子的配体也是有用的配体。可以这样根据本发明方法用作非特异性配体的微生物养分包括维生素例如烟酸、核黄素、硫胺、吡喷醇、泛酸、叶酸、生物素和钴氨酰胺，以及铁螯合分子/化合物如氯高铁血红素、乳铁蛋白、转铁蛋白、血红蛋白和某些铁栽体如气菌素(aerobactin)、铁色素(SigmaF8014)、铁肠螯素(ferrienterochelin)、肠菌素(enterobactin)和ferrixanine。最后，如上所述，对具有带电、疏水或亲水表面的固体支持物的非特异性细胞结合可以通过使用緩冲液(常与盐组合)以达到适于结合的pH条件来实现。确切的緩冲液和条件将根据细胞类型、固体支持物等而变化。一般地，将多种成分混合并简单地使其静置合适的时间，以允许细胞与支持物结合。然后可以通过任何便利的手段将支持物从溶液中移出，所述手段当然应取决于支持物的性质，并包括将支持物从样品上清液中移出或将样品从支持物中移出的所有形式，例如离心、倾析、移液等。该过程中的条件不是关键性的，并且已经发现，例如分离前在固相存在下将样品与"细胞结合緩冲液"简单地混合，并允许其在室温下放置例如5到30分钟(例如20分钟)是^t利的。如上所述，反应时间不是关键性的，短至5分钟的时间通常就足够。然而，如果便利的话也可使用较长的时间，例如20分钟到3小时，或甚至过夜。混合可通过任何便利的手段完成，包括如通过搅拌、振荡、吸打、倒置或用交变磁场进行简单的搅动。另外，必要时可使用更高或更低的温度，但并不必需。"细胞结合"组合物中其它任选的成分包括高分子量聚合物例如PEG等，弱的不带电去污剂如TritonX-100、NP-40等，DNA酶和其他酶，只要它们使细胞保持完整即可。优选的"细胞结合"组合物是例如PBS、柠檬酸緩冲液和含有Ca2+和Mg2+的溶液。尽管本发明优选非特异性细胞结合，但是使用经修饰以允许选择性捕获含有核酸的期望细胞的固体支持物也是可能的。能够特异性结合细胞的配体实例包括某些铁载体和环状分子，例如类固醇分子和信号转导分子。"特异性"表示配体仅能够通过该配体的特异性结合区与单一细胞类型或单一种或属的细胞结合。这可在核酸分离中引入一定程度的选择性，因为复杂混合物中只有来自期望靶来源的核酸可以分离。因此，例如，这样的支持物可用于仅从样品中分离和取出所期望的把细胞类型等。这类选择性细胞捕获基质的制备是本领域公知的，并已描述在文献中。细胞与固体支持物结合，然后可通过移出结合有细胞的固体支持物或通过移出(例如通过倾倒)样品的其余部分而将细胞与样品的其余部分分离。当固体支持物有磁性时，对支持物/细胞复合物的操作特别方便。洗脱涉及破坏细胞与固体支持物之间的相互作用。如上所述，该相互作用可以经由与固体支持物结合的配体来实现。根据本发明，洗脱不涉及使用竟争分子实现这种破坏。竟争分子是以下述方式结合第二分子或第二分子区域的分子所述结合阻止或阻碍至少一个其它分子与第二分子或第二分子区域的结合。所述竟争分子和另一分子在第二分子或第二分子区域中的结合位点可以是相同的或重叠的。或者，它们可以是不同的，但具有立体限制，意即竟争分子的结合将排斥或部分排斥另一分子。例如，竟争分子和/或另一分子的巨大尺寸可以使得一个的结合阻止另一个接近其结合位点，即使这些位点彼此不显著接近。或者，两个结合区可以在它们所在分子的一级结构中彼此分离，但是由于该分子所采取的三级构象而彼此接近。当细胞借助于固定在固体支持物上的配体与该固体支持物结合时，细胞/固体支持物复合物可以被对应于该复合物组分的竟争分子破坏。例如，竟争分子可以与固体支持物上的配体或细胞上的结合配偶体相同，或者是其保留发挥竟争分子功能的能力的片段、类似物或同系物。竟争分子也可以与配体或结合配偶体中参与结合反应的区域相同，或者是其保留发挥竟争分子功能的能力的片段、类似物或同系物。竟争分子可以作为更大分子的一部分而存在。通常竟争分子或其所在分子在溶液中将是游离的。因此，如果结合在配体A与结合配偶体B之间发生，则竟争分子可以是A或其片段、类似物或同系物。或者竟争分子可以是B或其片段、类似物或同系物。通常竟争者应适当地过量于A或B。技术人员将能够设计不包括竟争分子的合适洗脱条件。通常会使用适用于要使用的细胞和固体支持物的洗脱液。洗脱液的优化将不会过分繁冗。合适的洗脱液的例子是水、弱碱性水、牛血清白蛋白(BSA)水溶液，以及水性盐溶液如氯化钠、氯化钟或氯化镁。洗脱液可以用常用的緩冲液如Tris和MOPS进行緩冲。洗脱液的选择可受到将使用的下游检测方法的影响。例如，如果PCR是选择的扩增技术，则洗脱液可包含适当水平的氯化镁用于PCR反应。事实上，已经显示，洗脱可以用适用于后续扩增反应的反应緩冲液来进行，并且这是本发明的一个优选实施方案。例如，如果SDA是选定的扩增反应，则洗脱液可以便利地是SDA反应緩冲液，这样，洗脱产物可以直接用于SDA反应。洗脱可以在室温下进行，但是可以通过在升高的温度(例如30-45x:)下进行洗脱步骤来帮助洗脱。如下文所述，细胞的裂解可以通过加热细胞来实现，因此存在一个能增强洗脱但又不发生裂解的温度窗口。该窗口的位置会取决于涉及的细胞。例如，病毒和适应力强的细菌如分枝杆菌和衣原体合理地是抗热的，因此所述窗口相对较大。对于更脆弱细胞如真核细胞而言，所述窗口将较小。然而如下文所述，可能期望在方法的这一步中裂解所分离的细胞。靶细胞的检测通过检测乾细胞的特征性序列来实现，其中使用通常基于核酸扩增的核酸检测技术。许多类型的扩增反应是本领域已知的，如上所述，PCR、SDA、LAR、3SR和Q-p复制酶扩增系统都是常见的例子。优选的扩增方法是PCR和SDA及其改良形式，例如使用嵌套引物和实时PCR(核酸扩增技术的综述参阅如Abramson和Myers，1993,CurrentOpinioninBiotechnology,4:41-47，SDA的描述参阅如Walker等1992NucleicAcidResearch，20:1691-1696)。可以通过本领域描述的许多手段对基于PCR的步骤或其它检测步骤的结果进行检测或显影。例如，可以在电泳凝胶(例如溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶)上使用已知技术对PCR或其它扩增产物进行电泳。或者，可使用DIANA系统，这是嵌套引物技术的改良形式。在DIANA(固定4t扩增核酸的检测(DetectionofImmobilisedAmplifiedNucleicAcids))系统(参阅Wahlberg等，Mol.CellProbes4:285(1990))中，内部的第二对引物分别带有用于固定以允许捕获扩增的DNA的手段，以及用于附着标签以允许识别的标签或手段。这提供了下述双重优点降低的背景信号以及用于检测扩增DNA的快速且简单的手段。任选地，可以向本发明的方法中引入一个或多个洗涤步骤。特别是与支持物结合的细胞在从样品中分离出来后可以经受至少一次洗涤步何溶液作为洗涤緩冲液。一般而言，优选低到中度离子强度的緩沖液，例如pH8.0的10mMTris-HCl/10mMNaCl。将BSA摻入洗涤緩冲液中也是一种选择。必要时也可以使用其它标准的洗涤介质(例如含醇的)，例如用70%乙醇洗涤。优选70%乙醇或PBS的洗涤溶液。便利地，洗涤溶液和结合溶液可以相同。裂解通过物理手段实现，即不需要裂解性化学品。这包括加热、渗透冲击(osmoticshock)、声裂法、冰冻和微波处理。可4吏用一种或多种这些处理，并优选通过将细胞在合适的温度下加热合适的时间和/或将细胞在低渗溶液中洗脱来实现裂解。优选将细胞加热至50*0至95"C，更优选55X:至85"C，最优选60t:至80"。加热的持续时间应取决于细胞将加热到的温度和涉及的细胞类型，但是通常通过加热至少5分钟、优选至少7分钟、最优选至少10分钟实现裂解。低渗溶液优选为水。这种简单方式的裂解是特别合适的，因为不需要将释放的核酸与固体支持物结合。被洗脱的细胞可直接用在核酸检测方法中，通常用于核酸扩增反应中。为了将核酸用于扩增，细胞的裂解是必需的，但是不需要单独的裂解步骤或者组合的洗脱和裂解步骤，扩增反应中设计成使核酸变性的初始加热步骤也可以用于裂解细胞。在这种情况下，优选通过将细胞加热至8on至ioox:、更优选卯ic至98x:、最优选卯k:至9sx:来进行裂解。因此，在本发明的一个优选实施方案中提供了用于检测样品中靶细胞存在与否的方法，所述方法包括(a)将所述样品中的细胞与微粒状并且可混合的固体支持物结合；(b)将细胞从该固体支持物上洗脱而不使用竟争分子破坏细胞与固体支持物之间的相互作用；(c)通过加热裂解被洗脱的细胞；和(d)检测所述靶细胞的特征性核酸存在与否，其中所述固体支持物上没有固定抗体或抗体片段。使用上述洗脱液的洗脱步骤可以完全或部分地在上述裂解温度下进行，从而洗脱和裂解可以在一个便利的步猓中实现。然后可以将得到的产物直接用于扩增反应。这使得检测方法非常简单和便利。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了用于检测样品中靶细胞存在与否的方法，所述方法包括(a)将所述样品中的细胞与微粒状并且可混合的固体支持物结合；(b)在足够高的温度下将细胞从固体支持物洗脱而不使用竟争分子破坏细胞与固体支持物之间的相互作用，以引起所述细胞的裂解；和(c)检测所述乾细胞的特征性核酸存在与否，其中所述固体支持物上没有固定抗体或抗体片段。实施本发明方法所需的多种试剂和成分可便利地以试剂盒形式提供。这样的试剂盒代表了本发明的另一方面。最简单而言，本发明的这一方面提供了用于检测样品中靶细胞存在与否的试剂盒，所述试剂盒包含(a)微粒状并且可混合的固体支持物，其中所述固体支持物上没有固定抗体或抗体片段；任选的(b)用于使细胞结合所述固体支持物的手段；任选的(c)洗脱液；和任选的(d)用于检测所述靶细胞的特征性核酸存在与否的手段。多种手段(b)、(c)和(d)和固体支持物可以如上文关于本发明方法的描述和讨论。典型的试剂盒可包含固体支持物(例如包被有多糖如角叉菜胶或者蛋白质如凝集素的磁性微粒)、结合/洗涤緩冲液(例如PBS)和洗脱液(例如SDA反应緩冲液)。任选的成分(d)可包括在基于扩增的检测技术中使用的适当的引物寡核苷酸序列。任选地，这样的试剂盒中还可包括緩冲液、盐、聚合物、酶等。使用该试剂盒的合适方案将为如下，所述方案假定选择磁性或可磁化的珠子作为固体支持物(a):-组合结合緩沖液(b)和珠子，添加尿样的等分试样并混合(例如在Eppendorf管中)，-置于磁体影响下，并允许细菌/珠子复合物移动至管的侧面，-吸出并弃去上清液，-洗涤珠子并移出上清液，-添加洗脱液(c)并在80"C下孵育，-使用磁体将珠子与上清液分离，移出上清液的等分试样并用作PCR反应中的模板，所述PCR反应使用对靶细胞特征性核酸具有特异性的引物，其任选地由组分(d)提供。在另一方面中，本发明提供了用于检测样品中靶细胞存在与否的方法，所述方法包括(a)将所述样品中的细胞与微粒状并且可混合的固体支持物结合；(b)用简单洗脱液将细胞从固体支持物上洗脱；(c)裂解所述细胞后，检测所述靶细胞的特征性核酸存在与否，其中所述固体支持物上没有固定抗体或抗体片段。细胞的洗脱使用简单洗脱液来实现。"简单洗脱液"表示实现洗脱而不使用竟争分子破坏细胞与固体支持物之间相互作用的任何溶液，所述相互作用可通过与固体支持物结合的配体来实现。上文讨论的洗脱液均被认为是合适的洗脱液。现在将在以下的非限制性实施例中参照附图更详细地描述本发明，在附图中图l是凝胶的照片，其显示来自从样品中分离的沙眼衣原体的PCR产物，所述样品先前根据实施例1的方法证实为沙眼衣原体阳性(通过链置换证实，BDProbeTec)。M:标记物；U1-U11:样品；(+)/(-):初始孵育时用/不用磁性混合。图2是来自两种不同样品的扩增产物的解链分析，所述样品在不同的洗涤条件下根据实施例2的方法分离，A:样品2;B:样品3。图3是不同扩增产物的解链分析，所述扩增产物来自在不同洗涤条件下根据实施例3的方法分离的样品(A)和根据BugsnBeads方案(GenpointAS，Norway)分离的样品(B)(Refseth等，2004,AmericanBiotechnologyLaboratory,June,p26-28)。图4是得自核酸逆转录的cDNA的实时PCR分析，所述核酸分离自人呼吸道合胞病毒(hRSV)的合并临床样品10-3稀释度的一式三份样品(a、b和c)。实施例1使用以下样品制备方案与PCR分析的组合来分析十一种尿样，所述尿样先前通过市售的检测系统(BDProbeTec,BectonDickinson)确定为沙眼衣原体阳性。手工向1.5ml样品管中添加700jil尿样(四个平行重复)，并装入TecanMiniprep75的样品架运栽体(samplerackcarrier)内。分离操作的其余部分自动进行。将BUGS'nBEADSTMBW緩冲液(GenpointAS，Norway)和300ng磁珠(U曙版，GenpointAS,Norway)加入样品中。赙育期间对一半样品进行磁混合。孵育15分钟后，使用磁性分离器将细菌/珠子复合物固定在管的侧面并去除上清液。用70%EtOH洗涤珠子一次，重悬于100nl水中并在80"C孵育10分钟，以去除残余的乙醇。孵育后通过磁性分离固定珠子，并将15jil上清液转移至预先装入PCR预混物(mastermix)的PCR板。将PCR板转移至MJOpticon实时机器上用于扩增。按如下进行PCR扩增。50fil的总体积使用15jil模板。使用20pmol置于沙眼衣原体隐蔽性质粒中的引物(正向5'GCAAAAATACACTTGTGGGAGAA3'和反向5'GGTGCTCAGACTCCGACATAAT3')、0.2mMdNTP、1.25UHotGoldStar(Eurogentec)、5mMMgCl2、lx反应緩冲液(Eurogentec)、用于检测的SYBR绿和0.02%BSA进行扩增。使用MJOpticon(MJResearch)应用以下的PCR程序首先在95"C激活和变性10分钟，然后是95"C变性15秒、651C退火45秒和721C合成30秒的42个循环。将10fil扩增产物上样到用溴化乙锭染色的2%琼脂糖凝胶上。结果显示于图l中。在测试的十一种尿样中，七种在所有的平行重复中均为阳性，一种(U9)使用磁混合时为阳性，两种在不使用磁混合样品的一个平行重复中为阳性，一种尿样(U1)在所有平行重复中均为阴性。结果显示，在初始孵育期间进行或不进行混合都可以进行分离。实施例2一式三份地用不同洗涤緩冲液测试三种尿样。所测试的洗涤液1.70%EtOH2.含0.05%BSA的sdH203.来自BUGS'nBEADS试剂盒的经稀释的BW-緩沖液4.来自BUGS'nBEADS试剂盒的BW-緩冲液5.含有0.05%BSA的来自BUGS'nBEADS试剂盒的BW-緩冲液使用以下样品制备方案与PCR分析组合来分析三种尿样，所述尿样先前通过市售的检测系统(BDProbeTec，BectonDickinson)确定为沙眼衣原体阳性。手工向1.5ml样品管中添加700jil每种尿样(四个平行重复)，并装入TecanMiniprep75的样品架运栽体内。分离操作的其余部分由自动系统进行。将BUGS'nBEADSTMBW緩冲液和300吗磁珠(U-形式)加入样品中。孵育期间对一半样品进行磁混合。孵育15分钟后，使用磁性分离器将细菌/珠子复合物固定在管的侧面并去除上清液。然后用洗涤溶液l到5之一将珠子洗涤一次，重悬于100jil水中并在80"C孵育10+5分钟，以去除残余的乙醇。孵育后通过磁性分离来固定珠子，将80nl上清液转移至PCR条并将15jil手工转移至预先装入PCR预混物的PCR板。将PCR板转移至MJOpticon实时机器上用于扩增。如下进行PCR扩增。在50jil总体积中使用15nl模板。使用20pmol置于沙眼衣原体隐蔽性质粒中的引物(正向5'GCAAAAATACACTTGTGGGAGAA3，和5，GGTGCTCAGACTCCGACATAAT3，、0,2mMdNTP、1.25UHotGoldStar(Eurogentec)、5mMMgCl2、1x反应緩冲液(Eurogentec)、用于检测的SYBR绿(Eurogentec)和0.02%BSA进行扩增。使用MJOpticon(MJResearch)应用以下的PCR程序首先在95"C激活和变性10分钟，然后是95n变性15秒、65匸退火45秒和721C合成30秒的45个循环。扩增后进行从60-95°C(0.2C/s)的解链曲线分析。结果显示在图2中。所有样品均存在解链曲线，这显示分离细菌细胞后可以使用不同的洗涤溶液，并产生成功的DNA分离。实施例3制备脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus)的连续稀释液(102到10-7),使用70%EtOH作为洗涤液在TecanMinipr印75上进行分离步骤，然后用PCR进行分析。为了比较，使用手工操作的完整BUGS，nBEADS方案分析样品。对于机器人分离，在PCR中使用30jil模板，而手工分离的样品则使用15nl。用于机器人分离的方案如下。平行地手工向1.5ml样品管中添加700nl每种样品。然后添加BUGS，nBEADSTMBW緩冲液和300fig磁珠(U-形式)。室温孵育15分钟后，使用磁性分离器将细菌/珠子复合物固定在管的侧面并去除上清液。用70%EtOH洗涤珠子一次，重悬于100nl水中并在80"C孵育10+5分钟，以去除残余的乙醇。孵育后通过磁性分离来固化珠子，并将80nl上清液转移至PCR条中。然后将自动分离的15fil模板和手工分离的30fil模板转移至PCR板。然后将PCR板转移至MJOpticon实时机器上用于扩增。如下进行PCR扩增。在50jil总体积中使用15nl/30jil模板。使用20pmol置于分枝杆菌特异性hsp56基因中的引物(正向5,ACCAACGATGGTGTGTCCAT3，和5，CTTGTCGAACCGCATACCCT3,、0.2mMdNTP、1.25UHotGoldStar(Eurogentec)、5mMMgCl2、lx反应緩冲液(Eurogentec)、用于检测的SYBR绿(Eurogentec)和0.02%BSA进行扩增。使用MJOpticon(MJResearch)应用以下的PCR程序首先在95"C激活和变性10分钟，然后是95"变性15秒、65C退火45秒和72匸合成30秒的45个循环。扩增后进行从60-95°C(0.2C/s)的解链曲线分析。结果显示在图3中。解链曲线的存在表明分离了来自分枝杆菌的DNA，因此这些数据是该分离方案可用于脓肺分枝杆菌的证据。解链曲线与使用完整BUGS'nBEADS步骤实现的解链曲线相当，因此本分离方案与完整的BUGS'nBEADS步骤相当。实施例4使用实施例1中所述方法在TecanMiniprep75移液机器人上与SDA—起分析尿样，所述尿样先前使用完整BUGS'nBEADS方案和链置换扩增(SDA)(BDProbetec，BectonDickinson)确定为阳性或阴性。测试了以下参数BUGS'nBEADS试剂盒的C和U形式珠子70%乙醇作为洗涤緩冲液来自BUGS，nBEADS试剂盒的BW緩冲液作为洗涤緩冲液含有0.05%BSA的来自BUGS'nBEADS试剂盒的BW緩冲液作为洗涤緩冲液通过与SDA反应緩冲液(BDProbeTec稀释液)在室温下孵育10分钟进行洗脱通过与SDA反应緩冲液(BDProbeTec稀释液)在80"C下孵育10分钟进行洗脱通过与SDA反应緩冲液(BDProbeTec稀释液)在80X:下孵育5分钟然后在室温下孵育5分钟进行洗脱所有样品均平行分离，一个用于测试沙眼衣原体(CT)，一个用于扩增对照(amplificationcontrol,AC)以使对链置换扩增的任何可能抑制可见。AC不包括在完整BUGS'nBEADs步骤中。DNA分离后，根据BDProbetec手册进行SDA。结果显示于下表l中。所有先前确定为阳性的沙眼衣原体样品使用实施例1中所述方法均显示为阳性。BUGS'nBEADS试剂盒(Genpoint)的C形式和U形式珠子均给出了阳性的结果，证明可使用不同的固体支持物。所有的AC均高于ProbeTec试剂盒制造商所定义的抑制样品取舍点(cut-off)。不管使用何种洗涤緩冲液和洗涤后的洗脱条件，对沙眼衣原体均获得阳性结果。这显示在室温下洗脱仍然是有效的。这显示裂解所分离的细胞不是必需的。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>CT:使用链置换扩增对沙眼衣原体的MOTA值AC:使用链置换扩增对扩增对照的MOTA值=:抑制GZ-灰区(grayzone)*来自BUGS'nBEADS试剂盒的C形式珠子实施例5使用以下的方案一式三份地分析人呼吸道合胞病毒(hRSV)的l(T3稀释样品。最初的10-3稀释液在Copan病毒转移培养基中从合并的临床痰样品产生，所述样品先前确定为hRSV阳性。手工向1.5ml样品管中添加100nl稀释的hRSV样品(三个平行重复)。然后添加150ng磁珠(U-形式)。在室温下孵育15分钟后，使用磁性分离器将细菌/珠子复合物固定在管的侧面并去除上清液。用10mMTris洗涤珠子一次，重悬于50[il水中并在80"C孵育10分钟。孵育后通过磁性分离来固定珠子，并将45fil上清液转移至已准备好用于逆转录反应的新管中。使用以下的反应条件和LightCycler480进行逆转录反应。在20fil的终体积中组合了9jil模板(来自上述步骤的上清液)、六聚体引物(0.02fig/jd)、包含RT酶(20U/jil;RevertAidTMM-MuLVRT，Fermentas)的反应混合物和核糖核酸酶如制剂(2U/nl;RiboLock,Fermentas)。然后将反应混合物在25"C孵育5分钟，然后在42"C孵育60分钟，之后在70匸孵育10分钟进行灭活。然后使用LightCycler480根据Whiley等J.Clin.Microbiol.2002，40(12):4418-4422进行FRETPCR检测。使用的引物是RSupp(5'-GCCAAAAAATTGTTTCCACAATA-3，)和RSlow(5'-TCTTCATCACCATACTTTTCTGTTA-3')。4吏用的探针是RSV-LCl(5'-GTTGTTCTATAAGCTGGTATTGATGCA-3，荧光素)和RSV-LC2(Cy5-GGAATTCACATGGTCTACTACTGACTGT-3，罅酸盐)。将18pl预混物(lx反应緩冲液、3.5mMMgCl2、200jiMdNTP和Taq聚合"(HotGoldStar)0.025U/fd、400nM每种引物和200nM每种探针)与2jil模板(逆转录反应的产物)一起使用，并首先在95X:孵育10分钟，然后是95"C10秒、45秒和72"C15秒的45个循环。结果示于图4。权利要求1.用于检测样品中靶细胞存在与否的方法，所述方法包括(a)将所述样品中的细胞与微粒状并且可混合的固体支持物结合；(b)将细胞从该固体支持物上洗脱，而不使用竞争分子破坏细胞与固体支持物之间的相互作用；(c)裂解所述细胞后，检测所述靶细胞的特征性核酸存在与否，其中所述固体支持物上没有固定抗体或抗体片段。2.权利要求l的方法，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。3.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞是革兰氏阴性菌、柔膜细菌或衣原体。4.权利要求3的方法，其中所述细胞选自百日咳博德特氏菌(丑0n/"e〃fl/leWwss/s)、淋病奈瑟氏菌(AWssw*/"g<fitfir/wee)、肺炎支原体(Afycop/fls附a/mewmo/fiVie)、沙目艮衣原体(C^/fl考W"加cAo附flris)和肺炎衣原体(C^/fl考fif/flr)。5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品是环境样品、临床样品或食物样品。6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述固体支持物包括珠子。7.权利要求6的方法，其中所述珠子是磁珠。8.前述权利要求中任一项的方法，其中样品中所述细胞与固体支持物的结合是非特异性结合。9.权利要求8的方法，其中将所述固体支持物在允许样品中的细胞与该固体支持物非特异结合的介质存在下与样品接触。10.权利要求9的方法，其中所述允许细胞与固体支持物非特异结合的介质含有沉淀剂。11.权利要求10的方法，其中所述沉淀剂是醇和/或盐和/或聚乙二醇。12.权利要求ll的方法，其中所述醇选自异丙醇、乙醇、曱醇和正丁醇。13.权利要求11或12的方法，其中所述盐选自乙酸钠、乙酸钾、氯化钠、氯化钾和乙酸铵。14.权利要求1至8中任一项的方法，其中细胞与固体支持物的所述结合借助于固定在该固体支持物上的非特异性细胞结合部分来进行。15.权利要求14的方法，其中所述非特异性细胞结合部分是多糖，包括甘露糖、半乳糖、脱水半乳糖、葡萄糖、果糖和/或其衍生物。16.权利要求14或15的方法，其中所述多糖选自GUM1、阿拉伯胶、梧桐胶、瓜尔胶、角叉菜胶、肝素、硫酸类肝素和硫酸葡聚糖。17.权利要求9以及14至16中任一项的方法，其中所述允许样品中细胞与固体支持物非特异性结合的介质是PBS、柠檬酸緩沖液、含有Ca^的溶液或含有Mg^的溶液。18.前述权利要求中任一项的方法，其还包括其他步骤，在所述步骤中通过将结合有细胞的固体支持物从样品其余部分中移出而将与固体支持物结合的细胞与样品的其余部分分离。19.前述权利要求中任一项的方法，其中所述洗脱在选自以下的洗脱液中进行水、弱碱性水、牛血清白蛋白水溶液以及氯化钠、氯化钾和/或氯化镁的水溶液。20.权利要求19的方法，其中所述洗脱液含有Tris或MOPS。21.前述权利要求中任一项的方法，其中所述耙细胞特征性核酸的存在与否通过基于核酸扩增的技术进行检测。22.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞的裂解通过加热和/或通过渗透休克进行。23.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞从固体支持物上的洗脱和裂解在单个步骤中完成。24.权利要求23的方法，其中所述裂解通过在低渗溶液中和/或升高的温度下洗脱来进行。25.权利要求1到22中任一项的方法，其中所述细胞直接用于核酸检测方法。26.前述权利要求中任一项的方法，还包括一个或多个洗涤步骤。27.用于检测样品中靶细胞存在与否的试剂盒，所述试剂盒包含(a)微粒状并且可混合的固体支持物，其中所述固体支持物上没有固定抗体或抗体片段；任选的(b)用于使细胞结合所述固体支持物的手段；任选的(c)洗脱液；和任选的(d)用于检测所述靶细胞的特征性核酸存在与否的手段。全文摘要本发明涉及用于检测样品中靶细胞存在与否的方法，所述方法包括(a)将所述样品中的细胞与微粒状可混合固体支持物结合；(b)将细胞从固体支持物上洗脱，而不使用竞争分子破坏细胞和固体支持物之间的相互作用；(c)裂解所述细胞后，检测所述靶细胞的特征性核酸存在与否，其中所述固体支持物上没有固定抗体或抗体片段。还提供了用于实施本发明方法的试剂盒。文档编号C12Q1/02GK101374960SQ200680046310公开日2009年2月25日申请日期2006年12月12日优先权日2005年12月12日发明者马克·安格莱斯迪奥里亚克申请人:简珀恩特联合股份有限公司