专利名称：通过转染由成体干细胞产生胰岛素分泌细胞的方法
技术领域：
本发明总体而言涉及用于产生胰岛素分泌细胞的方法，更特别地，涉 及借助电穿孔进行的转染由成体干细胞产生这样的细胞。
相关领域描述
干细胞是见于分化组织中的未分化细胞，它们可自我更新并且(具有 某些限制地)发生分化以获得其来源组织中的所有特化细胞类型。干细胞 具有使其区别于其它细胞类型的两个重要特征。首先，它们是非特化细胞， 通过细胞分裂长期自我更新。其次，在某些生理或实验条件下，它们可以
被诱导成为具有特殊功能的细胞，如心肌的博动细胞(beating cell)或胰 腺的胰岛素生成细胞。由此，科学家猜测在未来的某个时间，干细胞可以 成为治疗疾病如帕金森病、糖尿病和心脏病的基础，因为可将健康细胞移 植至疾病患者来替换受损的细胞。
科学家主要一吏用两种人类干细胞胚胎干细胞和成体干细胞。人胚胎 干细胞>^的胚胎获得，因此目前成为伦理和政治考虑的主题，这使得对 它们的利用出现了一些问题。然而，成体干细胞避免了这样的问题，因此 使用起来更为理想。然而，成体干细胞可能有其自身的问题。从一名患者 培养的干细胞可能被另一患者排斥，因此需要免疫抑制剂(最终仍可能被 排斥)。理想的是移植来自患者的自体细胞，避免对免疫抑制的需要。
直到最近，人们仍认为成体干细胞通常产生其所在组织中的细胞类型。 例如，骨髓中形成血的成体干细胞通常产生多种类型的血细胞，如红细胞、 白细胞和血小板。骨髓中形成血的细胞不能产生差异很大的组织中的细 胞，如脑中的神经细胞。然而，过去几年中的许多实验已经提出了这种可 能性，即来自一种组织的干细胞可能产生完全不同的组织中的细胞类型。 实例包括成为神经元的血细胞、可使其产生胰島素的肝细胞以及可发育成 心肌的造血干细胞。因此，探索在基于细胞的治疗中使用成体干细胞的可 能性已成为研究人员的一个非常活跃的研究领域。存在几种用于转染以刺激干细胞分化的已知方法。例如，病毒栽体可 有效地将目的基因转移至广泛的哺乳动物细胞类型。然而，尽管源自非病 原性病毒，这样的方法仍存在某些争议。化学转染的缺点是对用于插入该
基因的化学环境有不利影响。可以使用精细毛细管移液器(fine microcapillary pipette)利用显微注射来实现物理转染。另 一方法包括'i^p 的电穿孔技术。术语"电穿孔"是指使用电场脉冲来诱导细胞膜中称为"电 孔(electr叩ore)"的微孔。取决于电脉沖的M,经电穿孔的细胞可在 脉冲后存活或死亡。人们认为经电穿孔的细胞的死亡原因是由通过该孔与 细胞外环境的流体通讯所引起的化学不平衡。所形成电孔的数目和尺寸取 决于所述脉冲的幅度E和持续时间t的乘积。在某个界限以下，根本不会 诱导电孔。这一界限针对不同细胞而有所不同，并主要取决于它们的尺寸。 细胞越小，则诱导孔所必需的振幅和持续时间的乘积越大。在下限以上， 孔的数目及其有效直径随乘积Et的提高而提高。直至到达上限，细胞在脉 冲后存活并在之后恢复其生存力。在上限以上，孔径和数目变得太大以至 于细胞无法存活。它不能通过自发过程或生物过程进行自我修复，故而死 亡。应注意的是，细胞对于电场的易损性取决于其尺寸细胞越大，杀死 它所需的电场越低。
发表于《Tissue Engineering" 2001年4月号的文章显示，通过抽脂法 取出的脂肪细胞可作为千细胞的极佳来源。研究人员首先收集从抽脂患者 的髋部、膂部和胃排出的脂肪和液体。接着对称为抽脂物(lipoaspirate) 的这些材料进行洗涤、纯化，用酶处理以分解将所述细胞维系在一起的基 质，并与来自骨髓的干细胞进行比较。科学家发现半磅脂质得到了多达5 千万至1亿个未分化的千细胞样细胞。
Norbert Wiener在《Energy Medicine》的一篇题为《Scientific Basis》 的文献中提出了术语"控制论"，其定义为通讯和控制的科学。其基本理 论主张，在适当的位置和时间施加小能量场可以改变生物过程。这已成为
了一个高产的研究领域，因为所有的生命过程最终均通过细胞、通过分子 以及通过它们产生的能量场来进行。科学家正在研究，在细胞/分子/电磁 级联中哪些确切的步骤对外部能量场尤其敏感，那些则不然。他们还在探
索来自环境的微小信号如何放大从而产生大的细胞效应。细M大的重要 性为1994年诺贝尔生理和医学奖所认可，其授予了对G蛋白以及这些蛋 白在细胞信号转导中作用的发现。人们认为，细胞表面上的受体是低频电磁场的主要作用位点。正是在
受体位点处细胞应^c激素、生长因子、神经递质、光及其它电>^信号所
触发。与受体密切相关的膜蛋白(如腺苷酸环化酶和G蛋白)在细胞表面
将单个分子事件与大量钙离子的内向通量偶^t一起。这些钙离子进入细
胞并激活多种酶分子。这些酶继而发挥催化剂作用，并大大加速生物化学
过程。所述刺激的频率非常关键。用促分裂原刺激淋巴细胞的单独研究显
示，3Hz的弱脉冲磁场使钾的内向通量急剧降低，而在同样条件下60Hz
信号则提高钙的内向通量。最近的研究揭示了自由基(包括一氧化氮)如 何参与信号级联中的电磁场与化学事件的偶联。同样，该研究的医学重要
性也获得1998年诺贝尔生理和医学奖的认可，其授予了关于一氧化氮在心 血管系统中作为信号分子的发现。
人体通过特定的分化信号由干细胞产生特化细胞。例如，通过施加电 磁辐射在细胞中产生生化应答。给定的辐射频率或频率范围在每个细胞中 产生特定的应答。细胞镨系(软骨、神经、骨等)对特定的频率产生应答， 从而实现特定的结果。也就是说，细胞镨系对于理想的应答来说是频率特 异性的。可以用特定的频率处理或辐射多能干细胞，并诱导或^Mt4吏之分 化为预定的细胞系。这通过使用脉冲电能使刺激干细胞分化的蛋白质 (DNA、 RNA)序列发生改变来实现。例如，前脂肪细胞是在接收到特定 信号后分化为成熟脂肪细胞的细胞。
发明内容
因此，本发明的一个一般性目的是提供用于产生分泌胰岛素的前脂肪 细胞干细胞及其衍生细胞的方法。本发明的一个具体目的是提供用于产生 分泌胰島素的前脂肪细胞干细胞及其衍生细胞的方法，其包括以下步骤 从患者获得脂肪细胞；离心并洗涤所述脂肪干细胞，培养该脂肪干细胞并 将其与胰岛素基因一起悬浮在培养基中；以及通过电穿孔对该脂肪干细胞 进行转染。本发明的一个具体目的是提供用于产生分泌胰岛素的前脂肪细 胞干细胞及其衍生细胞的方法，所述方法通过借助低压脉冲电场进行的转 染来实现。
优选实施方案
提供以下描述以使本领域任何技术人员能够实施和使用本发明，并列出了发明人考虑到的实现其发明的最佳方式。然而，多种变化对于本领域 技术人员来说仍是非常显而易见的，因为本发明的一jfejf则已在本文中具 体定义，以提供用于产生分泌胰島素的前脂肪细胞干细胞及其衍生细胞的
改进方法。
更具体地，本发明A^目信，通过改变或控制对前脂肪细胞干细胞施加 的来自电穿孔装置的脉冲低压电场，可以暂时性地在干细胞膜中形成大至 足以插入胰島素基因的孔。所述低压脉冲必须强到足以打开膜，但不能强 到"杀死"细胞。所述低压脉冲还必须足够弱，以允许干细胞膜在转染胰 岛素基因后自我修复。
在一个目前优选的方法中，从患者获得待转染的脂肪细胞，然后对其 进行离心和洗涤。然后，培养脂肪干细胞并与胰岛素基因一起悬浮在培养 基中。然后，将培养基中的脂肪干细胞应用于简单的多用电穿孔仪，例如 来自Bio-Rad Laboratories, Inc. of Hercules. California的Gene Pulser⑧脉 沖发生器。这种电穿孔仪或脉冲发生器具有附带的电击槽(cuvette chamber)和简单的一键式脉冲递送，允许以10伏的增量精确控制约200 至3,000伏的宽电压范围，并以0.1 ms的增量在1.0至4.0 ms范围内精确 选择脉冲宽度。
通过使用脉冲发生器精确控制电穿孔，在附带的电击杯(cuvette)中 实现了安全且可再现的成体脂肪细胞转化。
在一个目前优选的实施方案中，从患者中取出脂肪干细胞，然后将其 培养并悬浮在培养基中，并置于电穿孔仪或脉沖发生器的电击槽中处于25 C的电击温度下。细胞密度应为约1~ 10x10.6个细胞/脉冲。细胞体积约 为500 nl，电击杯中电极的间多巨约为0.4 cm,电压约为0.320 kV，场强约 为0.8 kV/cm，电容器i殳置为约500 nF。
在脉冲发生器的电击杯中转化所述脂肪细胞后，以已知方式在培养基 中再次培养转化细胞，以备用于该患者。
本领域的技术人员会理解，可以对上述优选的实施方案进行多种调整 和改变，而不脱离本发明的范围和构思。因此应理解，在所附权利要求书 的范围内，可以不同于本文的具体描述来实施本发明。
权利要求
1. 用于产生分泌胰岛素的前脂肪细胞干细胞的方法，其包括从患者获得脂肪干细胞；离心并洗涤所述脂肪干细胞；培养该脂肪干细胞并将其与胰岛素基因一起悬浮在培养基中；以及通过电穿孔对该脂肪干细胞进行转染。
2. 权利要求l的方法，其中所述转染通过施加低压脉沖电场来实现。
3. 权利要求2的方法，其中所施加的电压为约200至3,000伏，并 以约1.0至4.0 ms的脉冲宽度施加。
4. 权利要求l、 2或3的方法，其中在约25'C将培养基中的培养脂 肪干细胞与胰岛素基因一起置于电穿孔装置的电击槽中。
5. 权利要求l、 2或3的方法，其中所述脂肪干细胞密度为约l至 10 x 10.6个细胞/脉冲。
6. 权利要求1、 2或3的方法，其中所述脂肪干细胞的体积为约500<formula>formula see original document page 2</formula>
7. 权利要求l的方法，其中所述转染通过以下方法来实现对所 述脂肪千细胞施加脉冲低压电场，该脉冲低压电场受到控制以暂时性地 在该脂肪干细胞的膜中形成大到足以插入胰岛素基因的孔。
8. 权利要求7的方法，其中所施加的脉冲低压电场足够强而可以 打开膜但又并非强到杀死所述脂肪干细胞，并允许该膜在转染胰岛素基 因后自我修复。
9. 权利要求7或8的方法，其中所施加的电压为约200至3,000 伏，并以约1.0至4.0 ms的脉冲宽度施加。
10. 权利要求7或8的方法，其中将所述脂肪干细胞培养并悬浮在 约25'C下置于电穿孔装置电击槽中的培养基中。
全文摘要
本发明提供了用于产生分泌胰岛素的前脂肪细胞干细胞及其衍生细胞的方法，其通过以下步骤来实现从患者获得脂肪干细胞；离心并洗涤所述脂肪干细胞；培养该脂肪干细胞并将其与胰岛素基因一起悬浮在培养基中；以及通过使用精确控制的低压脉冲电场进行的电穿孔来对该脂肪干细胞进行转染。
文档编号C12N15/01GK101432425SQ200680052196
公开日2009年5月13日 申请日期2006年12月12日 优先权日2006年1月4日
发明者凯文·斯莱特里, 维普·R·德夫 申请人:环球健康有限公司