专利名称：一种利用真菌生产石杉碱甲的方法
一种利用真菌生产石杉碱甲的方法1一种微生物(1) PDA固体培养基特征利用PDA培养基28'C培养4天，菌落直径为2.0nim， 7天菌落直径为3. 7mm， 7天菌落直径为6. Omm(2) 液体培养特征培养基PDA，摇瓶培养时间14天，培养温度28土2X:发酵培养特征培养第3夭，菌种有零星的白色培养菌丝点；培养培养4天长满白色菌丝；培养6天发酵菌丝密集，菌丝呈现灰黑色；培养第10天，发酵液菌丝体密集成块状。(3) 形态特征菌丝灰色有隔，分生孢子梗不分枝，顶端膨大从生小梗，其上链生分生孢子。(4) 18sRNA的DNA碱基序列TTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTATCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAGCCTGAG MACGGCTACCACATCCAAGGMGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAC TGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTMCGAGGAACMTTGGAGGGCAAGTACTGGGCGTGTTGGGGMCCGGM 其工艺过程为菌种——试管斜面——种子培养——发酵培养——发酵无提取——高速逆流色谱仪分离化合物——有 效成分其中，发酵原料为马铃薯培养基(PDA),发酵方式为液体培养发酵菌种斜面试管斜面菌种培养采用马 铃薯葡萄糖固体培养基(固体PDA);种子培养基为马铃薯培养基(液体PDA):发酵培养基为马铃薯液体 培养基(液体PDA), pH自然，发酵培养时间5天，培养温度试管斜面菌种培养温度28土1'C,种子摇床 培养28土rC，发酵培养温度为28土2'C;发酵完毕，收集发酵物，真空千燥制成发酵千粉。以如下步骤 进行石杉碱甲提取。1 .前处理采用常规方法将发酵十粉用1 . 2 %酒石酸液充分浸泡后用氨水调溶液的PH值至弱碱性， 用氯仿反复萃取，将萃取液浓缩蒸千后，得到石杉碱甲粗品.将粗品用适量固定相溶液溶解后过即可用丁-下 一步的进样.2. 制备型高速逆流色谱仪分离选取溶剂体系，采用制备型高速逆流色谱系统分离。溶剂体系由A、 B、 C 二个组分构成，A组分可选自正庚烷、正己垸、正戊烷等正构烷烃，B组分可选自甲醇、乙醇、正丁 醇、丙酮等脂肪醇及脂肪酮，C组分为水。三个组分的体积比依次为1 一 10 : 0 . 1 3 : 1 - 10 。 使用前将溶剂体系按上述体积比置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相和下相分开， 上相作为固定相使用，下相作为流动相使用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速，将流动 相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，根据检测器紫外图谱接收目标成分。3. 后处理将收集到的石杉碱甲的溶液减压浓缩至干，得到类白色固体，然后用适量丙兩溶解，亍0— 10 'C下结晶，将结晶干燥后得到白色粉末状固体。经HPLC检测，纯度在99 %以上。
具体实施方式
实施例1取菌种E.J.Wu，在无菌条件下，用接种针挑取少许菌种，接种于灭菌的固体培养基试管中，置于培养箱中 28士rc活化培养96小时。取出活化的菌种，在无菌条件下，以同样的方式介入活化的菌种到已经灭菌的种子液体PDA培养基中，在 28土1'C下摇床培养72小时，即为枝孢霉种子。发酵采用500毫升玻璃二角瓶，装入配制好的液体PDA培养基IOO毫升，15磅灭菌30分钟后，取出待冷 却至30'C在无菌条件下，取枝孢霉种子，接种于装有100毫升液体PDA培养基的500毫升玻璃三角瓶中， 种子接种.1为5% 1096(28±2'0转到通气培养5天。在发酵期间，注意发酵温度温度变化，检查有无染菌 现象。发酵完毕，收集发酵物，真空千燥制成发酵—F粉将发酵千粉用1. 2%酒石酸充分浸泡后用氨水调溶液的PH值至弱碱性，用氯仿反复萃取，将萃取液浓縮蒸 千后，得到石杉碱甲粗品；将粗品用适量固定相溶液溶解后即可用于进样，选取适当的溶剂体系，采用柱 容积为1000ml的高速逆流色谱系统分离。溶剂体系由A 、 B 、 C三个组分构成，A组分可选自正庚 烷、正己垸、正戊烷等正构垸烃，B组分可选自甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮等脂肪醇及脂肪酮，C组分 为水。二个组分的体积比依次为1 一 4 : 0.2 — 2 : 1 - 3 。使用前将溶剂体系按上述体积比置于 分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相和下相分开，上相作为固定相使用，下相作为流 动相使用。进样前，先用同定相存满整个柱子，调整主机转速，将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态 平衡后，由进样阀进样，根据检测器紫外图谱接收目标成分；将收集到的石杉碱甲的溶液置于圆底烧瓶中 减压浓縮至F-，得到类白色固体然后用丙酮溶解，于0 — l(TC下结晶，将结晶干燥后得到的白色粉粉末状固体即为成品。实施例2取菌种E..J.Wu，在无菌条件F，用接种针挑取少许菌种，接种于灭菌的固体培养基试管中，置于培养箱中 28士rC'活化培养96小时。取出活化的菌种，在无菌条件下，以同样的方式介入活化的菌种到已经灭菌的种于液体PDA培养基中，在 28士rC下摇床培养72小时，即为枝孢霉种子。发酵采用500毫升玻璃三角瓶，装入配制好的液体PDA培养基100毫升，15磅灭菌30分钟后，取出待冷 却至3(TC在无菌条件下，取枝孢霉种子，接种于装有100亳升液体PDA培养基的500毫升玻璃三角瓶中， 种子接种量为596 l(m(28士2t:)转到通气培养5天。在发酵期间，注意发酵温度温度变化，检査有无染菌 现象。发酵完毕，收集发酵物，真空干燥制成发酵干粉。将发酵干粉用L . 2 %酒石酸充分浸泡后用氨水调溶液的PH值至弱碱性，用氯仿反复萃取，将萃取液 浓缩干后得到石杉碱甲粗品；将粗品用适量固定相溶液溶解后即可用于进样；选取溶剂体系，采用柱容积 为5000ml的高速逆流色谱系统分离。溶剂体系由A 、 B 、 C三个组分构成，A组分可选自正庚烷、 正己烷、正戊垸等正构烷烃，B组分可选自甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮等脂肪醇及脂肪酮，C组分为水. 三个组分的体积比依次为1.2 — 3 :0.3 — 2 : 1.2 — 3 。使用前将溶剂体系按上述体积比置于分 液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相和下相分开，上相作为固定相使用，下相作为流动 相使用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速，将流动相泵入柱内待整个体系建立动态平 衡后，由进样阀进样，根据检測器紫外图谱接收目标成分；将收集到的石杉碱甲的溶液置于圆底烧瓶中减 压浓缩至干，得到类白色固体；然后将上述类白色固体用适量丙兩溶解，于0 —10TC下结晶，将结晶干燥后得到的白色粉末状固体即为成品。实施例3取菌种E.J.Wu,在无菌条件7，用接种针挑取少许菌种，接种于灭菌的固体培养基试管中，置于培养箱中 28士rC活化培养96小时。取出活化的菌种，在无菌条件下，以同样的方式介入活化的菌种到已经灭菌的种子液体PDA培养基中，在 28士1X:下摇床培养72小时，即为枝孢霉种子。发酵采用500毫升玻璃三角瓶，装入配制好的液体PDA培养基100毫升，15磅灭菌30分钟后，取出待冷 却至30'C在无菌条件下，取枝孢霉种子，接种于装有100毫升液体PDA培养基的500毫升玻璃三角瓶中， 种子接种量为5% 10%(28±2*0转到通气培养5天。在发酵期间，注意发酵温度温度变化，检査有无染菌 现象。发酵完毕，收集发酵物，真空干燥制成发酵干粉。将发酵干粉用1 ， 2 %酒石酸充分浸泡后用氨水调溶液的PH值至弱碱性，用氯仿反复萃取，将萃取液 浓縮蒸干后，得到石杉碱甲粗品；将粗品用适量固定相溶液溶解后即可用于进样；采用柱容积为500()ml的 高速逆流色谱系统分离。溶剂体系由正己垸、甲醇、水三个组分构成，体积比依次为2:1.5:4-使用前将溶剂体系按上述体积比置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相和下相分^， 上相作为固定相使用，下相作为流动相使用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速，将流动 相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，根据检测器紫外图谱接收目标成分将收集到 的石杉碱甲的溶液置于圆底烧瓶中减压浓缩至干，得到类白色固体，然后用适量丙围溶解，于()一 10C 下结晶，将结晶《后得到的白色粉末状固体即为成品。CTCTTGGTGATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCC
GGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACT
TTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTATCAACGGGTAACG
GGGAATTAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAGCCTGAG
AAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTA
CCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAC
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TAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGT
CTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATAT
TAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACC
TTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGTACTGGTCC
GGCCGGGCCTTTCCTTCTGGGGAACCTCATGCCCTTC
ACTGGGCGTGTTGGGGAACCGGAA
权利要求
1. 一种微生物及其发酵法制取高纯度石杉碱甲，发酵微生物所用PDA固体培养基特征利用PDA培养基28℃培养4天，菌落直径为2.0mm，7天菌落直径为3.7mm，7天菌落直径为6.0mm
2、 发酵微生物所用液体培养基特征 培养基PDA，摇瓶培养时间14天，培养温度28士2'C发酵培养特征培养第3天，菌种有零星的白色培养菌丝点；培养培养4天长满白色菌丝；培养6天发酵菌丝密集，菌丝呈现灰黑色培养第10天，发酵液菌丝体密集成块状。
3、微生物形态特征菌丝灰色有隔，分生孢子梗不分枝，顶端膨大丛生小梗，其上链生分生孢子。
4、发酵微生物的18sRNA的DNA碱基序列ACTGGGCGTGTTGGGGAACCGGAA
5、'种生产石杉碱甲的方法，其特征在于在培养基中培养权利要求l、 2、 3、 4所述微生物在以使在所 述微生物细胞内和所述培养基中产生和聚集石杉碱甲，以及从所述细胞内和培养基中回收并提取石杉碱甲。
6、 根据权利l、 2要求的方法，其特征在于所述培养基中含有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘油、淀粉、 乳糖、卞乳糖和其他有助于所述微生物生长的常规碳源中一种或一种以上的碳源物质，以及花生粉、黄豆 粉、玉米将、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸盐、氯化铵和其他有助亍所述微生物生长的 常规氮源物质。
7、 根据权利要求l、 2所述的方法，其特征在于所述的培养基还含有磷酸盐、镁盐、钠盐和其他有助于微 生物生长的常规无机盐或有机盐物质。
8、 一种高纯度石杉碱甲的生产方法，包括如下步骤 a前处理采用常规方法将发酵干粉用1.2M酒石酸液(0.15 0.25W盐酸水溶液)充分浸泡后用氨水调溶液的PH值 至弱碱性，用氯仿反复萃取，将萃取液浓縮蒸千后，得到石杉碱甲粗品将粗品用适量固定相溶液溶解后 即可用于进样b制备型高速逆流色谱仪分离选取溶剂体系，采用制备型高速逆流色谱系统分离 c后处理将收集到的石杉碱甲的溶液减压浓缩蒸千，得到类白色固体，，然后用适量丙酮溶解，于0 10'C下结晶，将结晶r燥后得到的白色粉末状固体即为成品。
9、 根据权利要求8所述的一种高纯度石杉碱甲的生产方法，其特征在于所述的溶剂体系由A 、 B 、 C三个组分构成，A组分是IH构烷烃，B组分是脂肪醇或脂肪酮，C组分是水。三个组分的体积比依 次为1 一 10 : 0. 1 — 3 : 1 — 10 。
10、 根据权利要求8所述的一种高纯度石杉碱甲的生产方法，其特征在于所述的溶剂体系由A 、 B、 C 二个组分构成，A组分是正构烷烃，B组分是脂肪醇或脂肪酮，C组分是水。三个组分的体积比依 次为l一4:0. 2 — 2:1 — 3。
11、 根据权利要求8所述的种高纯度石杉碱甲的生产方法，其特征在于所述的溶剂体系由A 、 B 、 C三个组分构成，A组分是正构烷烃，B组分是脂肪醇或脂肪酮，C组分是水。三个组分的体积比依 次为1.2 — 3 : 0.3 — 2 : 1.2 — 3。
12、 根据权利要求8所述的-种高纯度石杉碱甲的生产方法，其特征在于所述的溶剂体系由A 、 B 、 C三个组分构成，A组分是IE构垸烃，B组分是脂肪醇或脂肪酮，C组分是水。三个组分的体积比依次为1—5 : o. l—2 : l—5 ■>
13、 根据权利要求8所述的一种高纯度石杉碱甲的生产方法，其特征在于所述的溶剂体系由A、 B、 C 三个组分构成，A组分是正构垸烃，B组分是脂肪醇或脂肪酮，C组分是水。三个组分的体积比依次 为2 : 1.5 : 4或2 : 1 : l或5 : 1 : 5或4 : 1 :3或2: 1 : 4。
14、 根据权利要求9或10或11或12或13所述的--种高纯度石杉碱甲的生产方法，其特征在于所述 的正构垸烃是正庚垸、正己烷、或正戊烷，所述的脂肪醇是甲醇、乙醇或正丁醇，所述的脂肪酮是丙酮。
全文摘要
本发明设计一种生产石山碱甲的新菌种(枝孢霉CGMCC)，本发明还涉及了一种应用本发明还包括了一种应用本发明的新菌株(枝孢霉菌CGMCC)生产石杉碱甲的方法，其中包括在培养基中培养本发明菌株(枝孢霉菌CGMCC)以示在所述菌株细胞内和所述培养基中产生和积聚石杉碱甲，以及从所属细胞内和培养基中利用高速逆流色谱仪分离法回收石杉碱甲。本发明的周期短，成本低，产率高可应用于工业化生产。
文档编号C12N15/11GK101240304SQ200710003519
公开日2008年8月13日 申请日期2007年2月7日 优先权日2007年2月7日
发明者吴东才 申请人:吴东才