专利名称：一种低酸发酵加工用植物乳杆菌专用菌株及其发酵剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种低酸发酵肉制品加工专用植物乳杆菌及其发酵剂的制备技术方法。
背景技术：
植物乳杆菌是一种革兰氏染色阳性、不形成内生孢子、不能运动的常以单个或链状存在的杆状菌。其能进行糖类发酵代谢产生乳酸、不产气、不能还原硝酸盐，属于乳杆菌属细菌。大量研究表明其存在于大多数低酸发酵肉制品加工过程中，具有显著的发酵乳糖等糖类形成乳酸与抑菌素，提高肉类酸度、抑制腐败菌与常见致病菌等的发酵作用。有鉴于此，上世纪60年代以来，国际上已广泛开展了发酵植物源、发酵乳品源与发酵肉品源植物乳杆菌优良发酵菌株筛选及其发酵剂制备工艺研究工作。自1974年美国发布植物乳杆菌单独或与其他乳酸菌联合用于干香肠专利以来，在欧美等发达国家已有多株植物乳杆菌发酵剂商业化用于多种低酸发酵肉制品干发酵向肠制品加工方面。近些年来，我国学者亦从进口的发酵剂或一些种类干发酵香肠、腊肉加工过程与产品中分离筛选到一些植物乳杆菌菌株，但有关其发酵剂制备研究还处于一些制备方法优选方面，有关其系统制备工艺与辅剂研究，尤其是冷冻浓缩发酵剂系统制备工艺技术方面研究还少见研究报道，尚未形成具有自主知识产权科技成果，有关发酵肉制品加工用植物乳杆菌发酵剂还处于依赖进口状态。有关块状低酸发酵肉制品Bundnerfleisch发酵牛肉火腿中植物乳杆菌菌株及其发酵剂制备技术也尚未见报道。
Bundnerfleisch发酵牛肉火腿是上世纪80年代末期我国一些合资企业引进国外技术生产的低酸发酵牛肉制品。近二十年来，其生产加工已逐渐成为我国优质高档牛肉生产企业提高中低档牛肉加工附加值的重要方式之一，Bundnerfleisch发酵牛肉火腿生产企业已由最初1～2家发展到十余家企业，其产品市场已处于由高档宾馆饭店向超级市场转化阶段。但是，受引进消化的加工工艺一直处于自然发酵加工状态所致产品质量特征中式化程度低、质量稳定性、均一性差，加工周期长、加工成本高问题制约，其生产还处于标准化、规范化、规模化、大众化程度低下发展状态，如何实现其生产加工由自然发酵加工到人为控制发酵加工转变、提高其质量、缩短其加工周期、降低其生产成本一直是亟待解决的重要技术难题。针对这一技术难题，2001年以来，我们系统查阅了国际同类产品科学研究资料，并在确认意大利Bresaola、巴西Charqui、西班牙与墨西哥Cecina等产品生产加工过程中存在微生物区系变化、尤其是国际上已研究确认木糖葡萄球菌人为接种可提高Charqui感官质量、能够加快蛋白质降解，存在利用分离细菌实现该类产品加工由自然发酵加工转化到人为控制发酵加工、缩短其加工周期的可能性基础上，系统研究了Bundnerfleisch发酵牛肉火腿生产加工过程中发酵细菌区系变化、对优势细菌进行了分离鉴定，研究了分离筛选获得的植物乳杆菌接种对产品加工过程中蛋白质、脂肪降解、发酵特性与产品质量影响。我们在确认筛选获得植物乳杆菌菌株具有提高产品酸度、游离脂肪酸含量、提高产品甘氨酸含量，具有肉类发酵剂耐盐、耐亚硝酸盐等特性，具有抑制大肠杆菌、李斯特等菌提高产品微生物安全性，能够改进产品色泽、香气、滋味等感官质量的基础上，系统研究了培养基、增值培养基组成、培养条件、浓缩方法与冷冻真空干燥技术方法与工艺参数变化对分离筛选获得的植物乳杆菌存活状况的影响以及该发酵剂应用效果。在上述研究基础上，形成了本项低酸发酵肉制品加工用专用植物乳杆菌菌株及活菌数达到1010cfu/g数量级的冷冻浓缩发酵剂制备工艺方法发明。
低酸发酵肉制品是一类经过低温(≤22℃)发酵与干燥加工而成的，终产品pH值在5.5以上的发酵肉制品。该类产品不仅与高酸发酵肉制品一样具有营养丰富、食用安全性高、货架寿命长特点，而且因加工过程中碳水化合物降解率低、蛋白与脂肪酶解程度高，更具有口味柔和、风味浓郁等质量特点。其不仅是欧美发达国家备受青睐的高档肉类产品，而且因其起源于占我国肉制品产量30％以上的腌腊肉制品，风味较为适合我国人民饮食消费习惯且安全、营养、风味等商品质量优于腌腊肉制品，在国内也具有广阔的潜在市场。有鉴于此，近些年来，我国一些企业已在积极发展低酸发酵肉制品，积极探索将腌腊肉制品提升为低酸发酵肉制品得技术途径。但是受我国有关研究开展较迟、研究尚欠系统深入，低酸发酵肉制品发酵剂处于依赖进口状态影响，我国低酸发酵肉制品因质量特征中式化不足而发展步履艰难，腌腊肉制品生产因缺乏相应发酵剂与相应人工控制发酵技术还处于传统自然发酵加工状态，安全与质量事故迭出，现代化生产消费发展举步维艰。在此形势下，植物乳杆菌发酵剂及其制备技术发明无疑对于低酸发酵肉制品与腌腊肉制品发展而言具有广阔的开发价值与应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种能用于低酸发酵肉制品生产的专用菌株及发酵剂制备方法。
本发明所提供的所提供的低酸发酵肉制品生产的专用菌株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)菌株L1分离自北京华安肉类有限公司Bundnerfleisch发酵牛肉火腿加工过程中，微生物形态学与生理生化鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，该菌株已于2007年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.1924。此菌株除具有植物乳杆菌一般特性外，还具有耐受6％浓度食盐、0.15％亚硝酸钠等肉品发酵剂需求特性，且在20℃培养条件下具有较强蛋白酶活性与抑制大肠杆菌、李斯特菌特性，。
本发明所提供的低酸发酵肉制品加工用植物乳杆菌发酵剂制备方法为以培养、浓缩、真空冷冻干燥为基本工艺。培养时使用的适宜培养基为麦芽汁复合增值培养基，其组成为麦芽汁培养基中添加2％乳糖、1％牛肉蛋白胨、2.5％酵母膏、10％番茄汁(％指g/100ml)增殖因子；适宜培养条件为温度20℃，培养基起始pH值为6.5～7.0，适宜收获时间为摇床培养18～22h后离心收获菌体；适宜浓缩方法为离心富集法，离心条件为温度0～4℃，离心转速6000rpm，离心时间30min；真空冷冻干燥时悬浮介质为加入5％蔗糖、0.5％维生素C、4％甘油、3％CaCO3(％代表g/100ml)保化因子的12％的脱脂乳，真空冷冻干燥方法为将加有保护剂的和浓缩菌体的脱脂乳装于真空冷冻干燥器、在25冷冻2小时，然后将其放入真空冷冻干燥机中在冷阱温度-30，绝压4帕以下条件下干燥28~32小时，使含菌与冷冻保护剂脱脂乳水分含量达到2.5~3％是停止干燥，并将其盛放于密闭包装内。采用本植物乳杆菌发酵剂制备技术方法制备的发酵剂中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L1 CGMCC № 1924的含量达到1010cfu/g以上。
具体实施例方式
实施例1、低酸发酵制品加工用专用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株L1CGMCC № 1924)的筛选1.备选菌株获取过程从北京华安肉类有限公司Bundnerfleisch发酵牛肉火腿生产加工过程腌制阶段开始，第0，6，12，18(腌制阶段)，27，36，48(干燥阶段)天分别无菌获取肉样。从各时间取得的肉样中无菌称取25.0g样品，加入225mL无菌生理盐水中，均质30s，进行不同浓度稀释。然后将不同稀释度的菌悬液接种于MRS平板培养基中，在30℃二氧化碳培养箱中培养48h后，分别从最高稀释度的培养平板上随机挑取10个菌落，再移接到MRS与营养琼脂斜面培养基中，分别筛选得到乳酸菌70株，生理生化鉴定后获得26株植物乳杆菌。
2.备选菌株蛋白酶与脂肪酶活性测定菌株蛋白酶活性测定培养基组成为蛋白胨5g，干酪素10g，葡萄糖10g，牛肉膏10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。
菌株脂肪酶活性测定油脂培养基为蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化钠5g，香油或花生油10g，中性红(1.6％水溶液)约1mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL。
无菌吸取0.1ml所分离的26个植物乳杆菌菌株培养液，均匀涂布在菌株蛋白酶活性测定培养基与脂肪酶活性测定油脂培养基上。分别于15℃、20℃、25℃培养48h以透明圈直径与菌落直径的比值判断菌株蛋白酶活的大小。确定所选菌株在20℃以上条件下具有蛋白酶活性。
分别无菌吸取0.1mL以适当倍数稀释的26个植物乳杆菌菌株菌悬液滴加于油脂培养基上，涂布均匀，20℃培养48h，以菌落上或其周围出现红色斑点与否判断君主是否具有脂肪酶活性。测定发现该菌株无脂肪酶活性。
3.低酸发酵制品加工用专用植物乳杆菌L1菌株安全性测定采用GB4789.3-94～GB4789.14-94食品微生物学检验规定的沙门氏菌、志贺氏菌、致泻大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、小肠结肠耶森氏菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡状芽孢杆菌检验方法检验植物乳杆菌L1菌株安全性，确定所选菌株安全无害，不属于国内食品安全所限定的致病菌。
4.低酸发酵制品加工用专用植物乳杆菌L1菌株种属鉴定将植物乳杆菌L1菌株经过多次纯化，然后采用美国BIOLOG公司Microstation型全自动快速微生物鉴定仪进行鉴定，经鉴定该菌株应属于植物乳杆菌。
5.低酸发酵制品加工用专用植物乳杆菌L1菌株可用性测定对菌株进行了耐盐性、耐亚硝酸盐性、抑菌活性等特性测定，发现该菌株具备肉品发酵剂菌种应具备的耐盐、耐亚硝酸盐所需特性、具有显著抑制大肠杆菌、李斯特菌作用。
实施例2、植物乳杆菌L1的发酵培养1、发酵培养基的确定将所得植物乳杆菌L1分别在液体营养琼脂培养基、西红柿汁培养基、胡萝卜汁培养基、麦芽汁培养基中进行培养，观察其生长情况，确定出其基础培养基为麦芽汁培养基。(培养基配方均已公开)向基础培养基中添加牛肉蛋白胨、乳糖等增殖因子，观察植物乳杆菌L1菌株在其中的生长情况，通过测定菌株的增殖情况确定出有效的增殖因子，并以此设计正交试验，优化得到了植物乳杆菌L1菌株的复合增殖培养基的组成配方为麦芽汁基础培养基中添加2％乳糖、1％牛肉蛋白胨、2.5％酵母膏、10％番茄汁增殖因子。
2、培养条件的确定将菌株在不同温度(10～25℃)、不同培养基起始pH值(5.5～7.5)、不同溶氧的条件下恒温培养，定时取样测定菌株的活菌数，确定了植物乳杆菌L1的适宜培养温度、培养基适宜pH值、溶氧情况及最佳收获期等培养条件温度15～25℃，培养基pH值6.5～7.4，摇床培养18～22h后离心收获菌体。
实施例3、干粉发酵剂的制备将培养好的菌种离心，去除离心上清液，然后，加入冻干保护剂进行冷冻干燥，即可以得到干粉发酵剂。
冻干过程中的一些优化工艺条件确定过程如下1、离心条件的优化菌体富集培养后，研究了不同离心温度(0-25℃)、不同离心转速(3000-7500rpm)、不同离心时间(10～40min)等离心条件对菌株存活率影响，确定植物乳杆菌菌液的适宜离心条件为温度0～4℃，离心转速6000rpm，离心时间30min。
2、冻干保护剂配方研究了植物乳杆菌L1菌株在添加甘油、维生素C等单因子保护剂的情况下冻干存活率的变化；并以筛选出的单因子保护剂为因素项，通过正交试验开展了不同保护剂及其剂量对植物乳杆菌L1菌株冻干存活率的影响，优化筛选出了植物乳杆菌菌株冻干保护剂的配方浓度为12％的脱脂乳中添加蔗糖5％、维生素C0.5％、甘油4％、CaCO33％。(％代表g/100ml)
3、冻干工艺确定冻干过程中，离心浓缩菌体与冻干保护剂的质量比为0.1-10∶1，优选为等质量比，在冻干过程中，菌粉干燥至2～5％含水量时停止干燥，以利于保持菌种的活性。
一个具体的操作过程如下将植物乳杆菌菌L1株接种于pH值为7.0的复合增殖培养基中，接种量为1％，于20℃温度下摇床培养20h，然后经4℃、6000rpm、离心30min后，添加与浓缩菌体等质量的冻干保护剂，置于真空冷冻干燥机中，于-30℃，绝压4帕以下干燥24～26h，菌粉含水量降至2.5～3％时停止干燥，即得干粉发酵剂。
所得干粉发酵剂活菌的数量级可达1010cfu/g；在0～4℃贮存60天后，菌粉活菌数仍处于同一数量级，为2.09×1010cfu/g。
权利要求
1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株L1 CGMCC № 1924。
2.一种低酸发酵肉制品加工用的发酵剂，其活性成分为具有大肠杆菌、李斯特菌抑制活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株L1 CGMCC № 1924。
3.根据权利要求2所述的发酵剂，其特征在于所述发酵剂中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株L1 CGMCC № 1924的含量达到1010cfu/g数量级。
4.根据权利要求2或3所述的发酵剂，其培养工艺在于所述发酵剂是由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株L1 CGMCC № 1924中加入麦芽汁增殖培养基中在温度20℃，初始pH值6.5～7.4条件下摇床培养20h后离心收获菌体。麦芽汁增殖培养基为麦芽培养基中添加2％乳糖、1％牛肉蛋白胨、2.5％酵母膏、10％番茄汁。
5.根据权利要求2或3所述的发酵剂，其离心浓缩工艺条件特征为温度0～4℃，离心转速6000rpm，离心时间30min。
6.根据权利要求2或3所述的发酵剂，其真空冷冻浓缩工艺特征在于离心浓缩后菌体中加入冻干保护剂后，经真空冷冻干燥制得；真空冷冻干燥工艺体方法为冷阱-30℃，绝压4帕以下干燥24～26h至菌粉含水量降至2.5～3％时停止干燥，所述冻干保护剂包含有浓度为12％的脱脂乳中添加2～4％甘油、1～3％维生素c、3～5％蔗糖和3～5％碳酸钙(％代表g/100ml)保护因子。
7.根据权利要求6所述的发酵剂制备要求，其特征在于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)菌株L1 CGMCC № 1924培养后离心浓缩菌体与冻干保护剂的用量为近等质量。
全文摘要
本发明公开了一种低酸发酵肉制品加工用的发酵剂专用菌株及其培养、浓缩、真空冷冻干燥适宜工艺条件与复合增值培养基、冷冻保护剂配方。本发明所提供的低酸发酵肉制品加工用发酵剂，其活性成分为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株L1 CGMCC № 1924。本发明通过筛选、纯化分离出一株具有高大肠杆菌、李斯特菌抑制活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株L1 CGMCC № 1924，将该菌株经过复合增值培养基培养、离心浓缩、加入冻干保护剂真空冷冻干燥后可制备成活菌量达到10×10
文档编号C12R1/25GK101033455SQ20071000336
公开日2007年9月12日 申请日期2007年2月6日 优先权日2007年2月6日
发明者孙宝忠, 贾英民, 田洪涛, 高文霞, 李海鹏, 种京华, 马爱进, 杨军, 马菊, 张红梅 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所