专利名称：酶法水解黄芪皂苷糖基制备黄芪甲苷的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备低糖基黄芪皂苷的方法，尤其是一种用能水解黄芪皂 苷糖基的酶处理黄芪皂苷糖基，以提高黄芪甲苷含量的酶法水解黄芪皂苷糖基 制备黄芪甲苷的方法。
背景技术：
-黄芪是常用中药之一，具有提高人体免疫力、补气、降压、强心、消炎去 肿、抗病毒等功效。目前我国药用的主要品种是蒙古黄芪C^^^"^膨w6ra"acews [Fisch.] Bge var. wo"g/zo//cw1s)禾口膜荚黄甚(JWraga/ws 膨w6ra"acews [Fisch.] Bge [Phaca膨附Z)ra"ctcea Fisch.]。黄芪中的主要有效成分为黄芪皂苷(新鲜黄芪根中皂苷糖基上往往带有乙酰基，但在加工生晒过程 中将乙酰基去掉，但是黄芪中含量高的皂苷十三根和四个糖基的皂苷，药效显 著的恋歌糖基的黄贫甲苷含量却低《余瑛、杨胜华华西药学杂志，8 (3)， 165-166， 1993》)。黄芪甲苷其学名为3-0-(l3-D-木糖基)，6-0-(3-D-葡萄糖基黄 芪苷元，其化学分子结构为黄芪皂苷中大多是三个和四个糖基的皂苷即在黄芪甲苷3-O-Xyl (木糖 基)上结合葡萄糖基(Glc)或者鼠李糖基(Rha)，成为双糖3-O-Xyl-Glc或 3-OXyl-Rha，其化学分子结构为
或者在黄芪甲苷3-O-Xyl (木糖基)结合葡萄糖基(Glc)或者鼠礼糖基 (Rha)，或者第25碳的羟基上届和葡萄糖基(Glc)等，其化学分子结构如下:O-Glc本发明用酶法水解黄芪中含量高的三个和四个糖基的黄芪皂苷的部分糖 基，转化成药效高的黄芪甲苷，可制备高含黄芪甲苷的黄芪制品(黄芪片或者 粉末)、高含黄甚甲苷的总皂苷，或者由此提高黄贫甲苷的提取率。
发明内容
本发明是为了解决现有技术中所存在黄芪甲苷含量低的技术问题，提供一 种酶法水解黄芪中含量高的皂苷糖基(含三个和四个糖基)，制备黄芪甲苷的方 法，无污染、目的性强、转化率高。本发明的技术解决方案是 一种酶法水解黄芪中含量高的三个和四个糖基 的皂苷，转化成含两个糖基的黄芪甲苷的方法，其特征在于用酶水解黄芪皂 苷糖基转化成黄芪甲苷。所述的酶是以黄甚皂苷或黄酮或异黄酮为发酵产酶诱导物，由细菌、链霉 所述的酶是以黄芪皂苷或黄酮或异黄酮为发酵产酶诱导物，产出能水解黄芪皂 苷糖基的酶，并大大提高其产酶量。该酶由细菌、链霉菌、霉菌、酵母菌、担 子菌发酵方法制备；发酵方法可用液态发酵法或固态发酵法。固态发酵产酶之 后，用醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液等常规缓冲液提取酶，即成发酵 酶液；液体发酵产酶、除菌除杂、即成发酵酶液；将其发酵酶液中加入硫酸铵 或者乙醇沉淀酶蛋白，收集沉淀，用1A0体积的缓冲液溶解沉淀，除杂，即得 浓縮的粗酶液；该粗酶液经酶蛋白分离中常用的离子交换树脂柱，色谱主或者 电泳方法分离得到经黄芪皂苷转化为黄芪甲苷的纯酶。上述酶处理黄芪总皂苷，使3个和4个糖基的黄芪皂苷转化成黄芪甲苷而 提高黄芪总皂苷中的黄芪甲苷的含量4 6倍以上；上述酶液处理黄芪、黄芪片、 黄芪粉末，提高黄芪中的黄芪甲苷含量4 6倍以上的黄芪制品；由此从酶处理 的黄芪、黄芪总皂苷中分离提取黄芪皂苷，提高黄芪甲苷的提取率。其酶的反 应温度为4 60"C， PH值为3 10,反应时间为4 40小时。本发明同现有技术相比，最大的特点是在细菌、链霉菌、霉菌、酵母菌、 担子菌等微生物发酵中加入了黄芪皂苷或黄酮或异黄酮等产酶诱导物，大大提 高能水解黄芪皂苷糖基酶的产量。用产出的酶(粗制酶或纯化酶)处理黄芪， 使3个和4个糖基的黄甚皂苷转化成黄芪甲苷而提高了黄芪甲苷的含量，可制 备黄芪甲苷含量高的黄芪片、粉末等其他制品。用产出的酶(粗制酶或纯化酶) 处理黄芪总皂苷，使3个和4个糖基的黄芪皂苷转化成黄芪甲苷，而提高黄芪 总皂苷中的黄芪甲苷的含量，由此提高了黄芪甲苷的提取率；克服了酸碱法处 理糖基所存在的对皂甙破坏性大、污染严重、目的性差等缺点，具有无污染、 目的性强、转化率高的优点。
具体实施例方式实施例1:a. 黑曲霉菌(Ap^7/w "/gw)在含5%麦芽水浸出物、1%产酶诱导物一 一黄芪水浸出物的培养基中，在温度28~30°C条件下搅拌通风培养50~100小时， 离心除菌得上清液(含酶混合液)，在上清液中用60~75%饱和度的硫酸铵沉淀 酶蛋白、收集蛋白，溶于1/10发酵液体积的常用的醋酸缓冲液(0.02M，pH 5.0)、 或者磷酸缓冲液、Tris缓冲液中，透析除去硫酸铵，离心除渣，即为酶液；b. 用50毫升上述酶液、3克黄芪皂苷和100毫升醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0) 混合均匀，在温度20 55'C条件下反应6 24小时，再加入l/3体积的正丁醇萃取 皂甙三次，减压蒸干，得到黄芪皂苷粗品。用硅胶柱分离方法(文献3)得到 0.5 0.8克的黄芪甲苷，黄芪甲苷的转化率达到60 卯％，比从原3克黄芪皂苷中 直接提取黄芪甲苷提高了 6倍。上述酶液DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪 (文献5)分离提纯黄甚甲苷酶蛋白，用SDS电泳方法(文献6)测定分子量， 酶的分子量为5.0万。
实施例2:a. 米曲霉菌(^y/ eg/〃^ 07加e)在含5%麦麸水浸出物、0.02%产酶诱导物 一大豆异黄酮或者含黄酮类的芦丁、或者0.6%其黄酮类来源植物-槐花的水浸出 物的培养基中，在温度28 3(TC条件下搅拌通风培养50 100小时，离心除菌得 上清液(含酶混合液)，在上清液中用60~75%饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白、收 集蛋白，溶于1/10发酵液体积的的常用的醋酸缓冲液(0.02 M， pH5.0)、或者 磷酸缓冲液、Tris缓冲液中，透析除去硫酸铵，离心除渣，即为酶液；b. 用酶液按实施例l的方法处理黄芪皂苷，提纯和检测酶反应产物的结果 是产物主要是黄芪甲苷，黄芪皂苷中黄芪甲苷的转化率达到60%以上。上述酶液经DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪 (文献5)分离提纯黄芪甲苷酶蛋白，用SDS电泳方法(文献6)测定分子量， 酶的分子量为5.3万。 实施例3:用实施例1或实施例2的方法制备40毫升酶液，加入到10克黄芪片、或者粉 末中，在温度35 4(TC条件下浸泡黄芪片4 40小时，干燥黄芪片，用高效液相 色谱法(文献7)测定黄芪片中的黄芪甲苷含量，比原黄芪片、或者粉末中的黄 芪甲苷含量提高6倍以上。实施例4:细菌a. 以高温好氧菌&"7/w spJF2菌(文献l)在含1%大豆浸出物、1%可溶性 淀粉、产酶诱导物一O.l %黄芪水浸出物、0.0P/。MgSO4培养基中，在温度6(TC 条件下通风培养30 40小时，离心除菌得上清液(含酶混合液)，往上清液上加 入65%饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白，用0.02M、 pH5醋酸缓冲液透析，离心除杂，冻干，得到黄芪皂甙酶；b. 将3克上述黄芪皂苷酶、IO克黄芪皂苷、IOOO毫升醋酸缓冲液(0.2 M， pH5.0)和150毫升乙醇混合均匀，在温度40'C条件下搅拌反应12 24小时。反 应后加入6000毫升乙醇，过滤除去蛋白沉淀，滤液减压蒸干，得到10克黄芪甲 苷粗品，用薄层层析法(文献2)检测结果黄芪甲苷含量提高5倍。上述酶液DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪 (文献5)分离提纯黄芪皂苷酶蛋白，用SDS电泳方法测定分子量(文献6)，酶 的分子量为6.0万。
实施例5:酵母菌a.假丝酵母在含产酶诱导物一黄芪粉10%和3%槐花(含黄酮类的芦丁) 麦麸培养基(干物1000克)上接种，分装在茄子瓶中3(TC、培养3 6天，收 集培养物加入6000毫升的生理盐水，浸泡一小时，离心取上清，即得到含酶混 合液，加入饱和度60 75%的硫酸按，使酶蛋白沉淀，收集沉淀，用800毫升 的pH5、 0.02M醋酸钠缓冲液溶解，透析出去硫酸按，离心除渣，即得1000毫 升左右的酶液；b.将上述酶液按实施例1或实施例2或实施例3的方法处理黄芪皂苷、黄芪片 或者粉末，黄芪甲苷含量提高4倍。 实施例6:担子菌大肥蔬菌"gan'a^ Wtogi^)培养在含产酶诱导物一黄甚粉和稻皮各10% 的麦麸培养基上，在温度25'C条件下培养6-10天，按实施例5的方法提取酶 液，按实施例4的方法处理黄芪皂苷、黄芪片或者粉末，黄芪甲苷含量提高4.3倍。实施例7:将实施例l、 2得到的黑曲霉菌、米曲霉菌等微生物培养液(酶液)接种到 水分60 70%的黄芪或者黄甚片中，在温度3(TC条件下培养1 5天，用高效液相 色谱法(HPLC法，文献8)干燥测定，黄芪甲苷含量提高6倍以上。参考文献1. Fengxie Jin， et al(金凤燮等)J. Gen Appl. Bact.， 1990, 36, 415-424,2. 张彩霞等基层中药杂志2000， 14(2), 32-33。.3. 徐人生主编，天然物化学，科学出版社，1997， pl7-20.4. 韩秀文等，波谱学杂志，1999, 16 (6)， 533-539。5. Hongshan Yu, et al(鱼红山等)Chem. Pharm. Bull" 2002， 50(2)， 175-178。6. 张龙翔等升华实验方法和技术，高等教育出版社，1997， plOO-lll。7. 景冬樱等中国医院药学杂志，27 (3)， 248-250。
权利要求
1.一种酶法水解黄芪皂苷糖基，制备黄芪甲苷方法，其特征在于用酶处理黄芪或者黄芪总皂苷，使含量高的三个或者三个以上糖基的黄芪皂苷糖基水解，转化为含两个糖基的黄芪甲苷；制备高含黄芪甲苷的黄芪制品和高含黄芪甲苷的黄芪总皂苷、或者由此分离提取制备黄芪甲苷，提高黄芪甲苷的提取率。所述的酶是以黄芪皂苷或黄酮或异黄酮为发酵产酶诱导物，由细菌、链霉菌、霉菌、酵母菌、担子菌发酵方法制备；发酵方法可用液态发酵法或固态发酵法。固态发酵产酶之后，用醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液等常规缓冲液提取酶，即成发酵酶液；液体发酵产酶、除菌、即成发酵酶液；将其发酵酶液中加入硫酸铵或者乙醇沉淀酶蛋白，收集沉淀，用1/10体积的缓冲液溶解沉淀，除杂，即得浓缩的粗酶液；该粗酶液经酶蛋白分离中常用的离子交换树脂柱，色谱主或者电泳方法分离得到经黄芪皂苷转化为黄芪甲苷的纯酶。
2. 权利要求l所述霉菌为曲霉属C4^^^7/w)菌。
3. 权利要求1和2所述的酶法水解黄芪皂苷糖基制。备黄芪甲苷的特征是 上述酶处理黄芪总皂苷，使3个和4个糖基的黄芪皂苷转化成黄芪甲苷，制备 提高黄芪甲苷的含量4 6倍以上的黄芪总皂苷；上述酶液处理黄芪、黄芪片、 黄芪粉末，制备提高黄芪中的黄芪甲苷含量4 6倍以上的黄芪制品；由此从酶 处理的黄芪、黄芪总皂苷中分离提取制备黄芪皂苷，提高黄芪甲苷的提取率。 其酶的反应温度为4 6(TC， PH值为3 10，反应时间为4 40小时。
全文摘要
本发明公开一种酶法水解黄芪皂苷糖基制备黄芪甲苷的方法，其特征在于用酶水解黄芪皂苷糖基制备黄芪甲苷，所述的酶是以黄芪皂苷或黄酮或异黄酮为发酵产酶诱导物，由细菌、链霉菌、霉菌、酵母菌、担子菌发酵制备。用产出的酶(粗制酶或纯化酶)处理黄芪或者黄芪总皂苷，水解含糖基三个和四个的黄芪皂苷糖基，提高了黄芪甲苷的含量，可制备黄芪甲苷含量高的黄芪片、粉末等其他制品，可制备黄芪甲苷含量高的总皂苷，由此可提高黄芪甲苷的提取率。克服了酸碱法处理糖基所存在的对皂甙破坏性大、污染严重、目的性差等缺点，具有无污染、目的性强、转化率高的优点。
文档编号C12R1/66GK101130802SQ20071001229
公开日2008年2月27日 申请日期2007年7月30日 优先权日2007年7月30日
发明者金凤燮, 鱼红闪 申请人:金凤燮