专利名称：单克隆抗体spa红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的方法
技术领域：
本发明涉及医学免疫学，尤其涉及一种单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的方法。
背景技术：
随着分子免疫学的发展，根据淋巴细胞膜表面分化抗原群(cluster ofdifferentiation，CD)的不同，可将T、B、NK淋巴细胞分成若干亚群，临床实验室通过抗分化抗原CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD56、CD16等的单克隆抗体(McAb)，对外周血淋巴细胞进行检测，依据其阳性率判定总T细胞、T辅助性细胞(TH)、T抑制/杀伤性细胞(TS/Tc)亚群、B淋巴细胞、NK细胞等的分布和变化，从而判断人体的免疫功能，达到预防保健和疾病的诊断、治疗、预后(根据检测结果医生预计，估计某病的将来发展情况)的目的。
目前，常用的检测方法有流式细胞仪法、免疫荧光法、AP-AAP桥联酶免疫法和SPA(金黄色葡萄球菌A蛋白)花环法，其中SPA花环法分红细胞花环法和菌花环法，而红细胞花环法和菌花环法又分直接法和间接法。
SPA红细胞花环法的直接法因为应用单克隆抗体(McAb)而又叫单克隆抗体SPA红细胞花环法直接法，简称McAb-A-E直接法。该法在《全国临床检验操作规程》(中华人民共和国卫生部医政司编，第二版，东南大学出版社，1997381-384和第一版1991320-322)中有摘要性论述，但无详尽操作方法，实际工作中按“冻干抗体致敏红细胞花环试剂使用说明书”规定的方法进行具体操作(1)在冻干抗体致敏红细胞花环试剂中加入pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液(简称无钙、镁Hank’S液)或磷酸盐缓冲液溶解；(2)按常规法用淋巴细胞分离液分离出外周血淋巴细胞(分离细胞以2000～2500rpm的转速离心20～30min；用无钙、镁Hank’S液洗涤2次，每次以1000～2000rpm的转速离心5～10min；)，最后用pH值为7.0～7.4的含20％新生小牛血清无钙、镁Hank’S液配成500万/mL；(3)将试管呈20度角斜放，于37℃孵育45min，将细胞悬液取出置另一试管中，离心去上清并恢复原量备用；(4)根据待检样品数取一定量致敏红细胞悬液，离心去上清，用含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮，恢复至原量；(5)淋巴细胞悬液与致敏红细胞悬液等量混合(各25μL)，室温(22～25℃)下放置10min，500rpm离心10min，室温下继续放置1小时，并在4℃放置2小时或过夜；(6)轻轻悬浮后加入25μL梅-格氏染液(May-Gruenwaid)室温染色10min后，离心去上清，再加50μL的姬姆萨染液(Glemsa液)染色30min(或单用Glemsa液染色)，当天或第二天看结果均可；(7)结果检查及判定混匀后取一滴悬液于玻片上并加盖薄片，用高倍镜检查；淋巴细胞周围黏附有三个以上红细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞者即除掉不计，共计数100～200个淋巴细胞，算出花环形成细胞的百分率。
虽然McAb-A-E直接法所采用的冻干抗体致敏红细胞花环试剂本身具有特异性强、敏感、稳定性好、有效期长、使用方便、仅需普通光学显微镜即可进行检测的特点，且实验结果可保存两周左右，十几年来被临床实验室和相关研究单位广泛应用，但是McAb-A-E直接法作为一种临床检测方法却由于存在检测步骤多、所需标本量相对较多、周期长、易造成被测细胞损伤和丢失、个别重要步骤无量化控制指标、非特异花环鉴别困难而影响计数结果等缺陷，无法适应临床上快速、准确的要求，使很多实验室，特别是临床实验室接受困难，限制了该方法的推广应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是提供一种检测过程简化、检测周期短、能够进行量化控制、满足临床检测要求的单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的方法，包括下述步骤(1)在冻干抗体致敏红细胞花环试剂中加入0.5mL pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液，溶解成致敏红细胞保存液； (2)抽取静脉血，以1∶1～3的体积比加入pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液，混匀后，加在淋巴细胞分离液上，淋巴细胞分离液的量与稀释血液的体积比为1∶2～3，在18～28℃温度下，以800～1200rpm的转速离心15～25min；取出单个核细胞，并对单个核细胞用无钙、镁汉克氏平衡盐溶液洗涤后离心，每次以400～600rpm的转速离心6～10min，弃上清；然后用pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液配成400～600万/mL淋巴细胞悬液； (3)取致敏红细胞保存液，以400～600rpm转速离心6～10min后去上清，用pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液悬浮，形成与所取致敏红细胞保存液等量的致敏红细胞应用液； (4)淋巴细胞悬液与致敏红细胞应用液以1∶1的体积比混合成混合悬液，在18～28℃温度下放置10min；以300～500rpm转速离心5min后在4℃静置15～45min； (5)用20μL或25μL容积的带吸头的移液器吹吸混合悬液20或15次；取混合悬液推制细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，然后用高倍镜计数淋巴细胞周围黏附有三个以上红细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞者除掉不计；计数时，选取细胞涂片从头至尾的2/6～4/6之间至少两处区域共计数200个细胞，算出花环形成细胞的百分率。
所述步骤(2)中的静脉血采用肝素或乙二胺四乙酸二钠盐抗凝剂抽取。
本发明与现有技术相比具有以下优点 1、本发明通过改变分离、处理细胞的相关参数、简化处理步骤，降低了细胞损伤，保证了处理后的细胞形态结构与自然形态结构基本一致；再通过改变细胞涂片和染色计数方法，在显微镜下可直接辨认细胞的形态结构，识别和鉴别细胞，不需要对淋巴细胞进行纯化处理，从而取消了原方法中纯化淋巴细胞的操作步骤，避免了原方法费时复杂的操作、被测细胞易损伤和丢失、标本量相对较多、非特异细胞花环难以鉴别的缺陷。
2、本发明在保证检测结果稳定不变的前提下，取消原方法中抗原-抗体反应的不必要条件和步骤，从而缩短了抗原-抗体反应的时间。免疫学抗原-抗体反应所需时间一般的在一小时左右即可完成。
3、由于原方法中对操作过程中的“轻轻悬浮”未进行量化控制悬浮时用力过大，会使花环红细胞散落；用力不足，则花环细胞分散不均匀，出现团块，从而影响计数，加大检测误差；而本发明则通过对该步骤规定了普通实验室普遍能够应用的量化指标，使不同操作者和同一操作者在每一次试验中无论采用何种反应管都能按照量化后的控制标准进行操作，从而减小了系统误差和偶然误差，增加了检测的稳定性、准确性和可比性。
4、由于本发明通过改变细胞染色、计数方法，对计数时选取的区域和方法进行了规范，从而保证了计数的代表性，减少了人为因素所引起的检测结果差异；同时改用细胞涂片法后，可以发现本检测项目以外的某些异常情况如外周血中出现原始、幼稚细胞等，可为被检者和临床医生提供诊疗建议。另外，染色的细胞涂片具有易于存放复查、携带交流、便于拍照存档等优点。
5、由于原方法是利用黏附细胞在光滑玻璃、塑料表面具有运动黏附的特性，用培养贴壁法除去黏附细胞，从而达到不影响特异细胞花环的识别和计数的目的。而本发明则利用黏附细胞本身的形态结构特征，在改变分离处理细胞的离心速度参数后，在尽可能不影响黏附细胞原有的细胞形态的条件下，选用最佳的固定方法、染色液和染色方法，在显微镜下直接显示黏附细胞本身的形态结构特征，从而达到鉴别、区别细胞的目的。
6、由于本发明增加了目前临床广泛应用的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na2)抗凝剂，扩展了原方法采集标本时所用抗凝剂的范围，更加适用于临床。
7、本发明通过减少检测步骤，将检测周期由原来的7～8小时(完成1～3份标本的CD3、CD4、CD8检测到开始计数前的时间计算，不包括计数时间)减少到2～3小时，缩短时间达5～6小时，满足了临床快速检测的要求；同时由于简化了操作步骤，使标本、试剂、器材用量等相对减少，从而在降低成本的基础上提高了检测的稳定性，因而易于在各级、各类医院、研究单位的实验室进行临床检测的推广应用。
具体实施例方式 实施例1 在冻干抗体致敏红细胞花环试剂WuT3、WuT4、WuT8(冻干品是少量固体结晶，加液后溶解，不影响体积)中分别加入0.5mL pH值为7.0的无钙.镁Hank’S液，溶解成致敏红细胞保存液。溶解后的细胞悬液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封，在4～6℃可保存2～4周。
用肝素抗凝，抽取患者空腹静脉血1mL，加1mL pH值为7.0的无钙、镁Hank’S液混匀后，用滴管缓缓加在2mL淋巴细胞分离液上，在28℃下，用半径为22cm的离心机以800rpm的转速离心20min。
用滴管吸出单个核细胞放入加有4～6倍量pH值为7.0的无钙、镁Hank’S液的另一离心管中，尽量少吸淋巴细胞分离液；混匀，离心机转速为400rpm，离心10min，弃上清，再用pH值为7.0的无钙、镁Hank’S液洗一次。最后用pH值为7.0的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液配成400万/mL淋巴细胞悬液备用。
取15μL致敏红细胞保存液于0.5mL爱频道夫离心管中，以400rpm转速离心10min后去上清，用pH值为7.0的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮，形成致敏红细胞应用液并恢复至15μL。
取20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮的淋巴细胞悬液15μL加入含有15μL 20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮的致敏红细胞应用液的0.5mL爱频道夫离心管中，充分混匀，在28℃下放置10min，以300rpm转速离心5min后在4℃静置15min。
用带吸头的移液器25μL容积吹吸混合悬液15次；取10μL混合悬液按血片法推制面积8～10cm2的细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，高倍镜计数。其中改良姬姆萨染色法是指将染色液3～5滴完全覆盖细胞涂片，染色约1min，加pH值为6.4～6.8的PBS(磷酸盐缓冲液)6～10滴染色2～5min，用水冲洗即可。
判定方法淋巴细胞周围黏附有三个以上红细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞者除掉不计；计数时，选取细胞涂片从头至尾的2/6～4/6之间的至少两处区域共计数200个细胞，算出花环形成细胞的百分率。
检测结果CD3+为80％、CD4+为38％、CD8+为46％、CD4+/CD8+为0.83。
实施例2 在冻干抗体致敏红细胞花环试剂WuT3、WuT4、WuT8中分别加入0.5mL pH值为7.2的无钙、镁Hank’S液，溶解成致敏红细胞保存液。溶解后的细胞悬液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封，在4～6℃可保存2～4周。
用乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na2)抗凝，抽取患者空腹静脉血1.5mL，加3mL pH值为7.2的无钙、镁Hank’S液混匀后，用滴管缓缓加在2.5mL淋巴细胞分离液上，在22℃下，用半径为22cm的离心机以1000rpm的转速离心18min。
用滴管吸出单个核细胞，放入加有4～6倍量pH值为7.2的无钙、镁Hank’S液的另一离心管中，尽量少吸淋巴细胞分离液。混匀，离心机转速为500rpm，离心8min，弃上清，再用pH值为7.2的无钙、镁Hank’S液洗一次。最后用pH值为7.2的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液配成600万/mL淋巴细胞悬液备用。
取25μL致敏红细胞保存液于0.5mL爱频道夫离心管中，以600rpm转速离心6min后去上清，用pH值为7.2的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮，形成致敏红细胞应用液并恢复至25μL。
取20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮的淋巴细胞悬液15μL加入含有15μL 20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮的抗体致敏红细胞悬液的0.5mL爱频道夫离心管中，充分混匀，在22℃下放置10min，以400rpm转速离心5min后在4℃静置30min。
用带吸头的移液器20μL容积吹吸混合悬液20次；取10μL混合悬液按血片法推制面积8～10cm2细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，高倍镜计数。
改良姬姆萨染色法和判定方法同实施例1。
检测结果CD3+为64％、CD4+为43％、CD8+为33％、CD4+/CD8+为1.30。
实施例3 在冻干抗体致敏红细胞花环试剂WuT3、WuT4、WuT8中分别加入0.5mL pH值为7.4的无钙、镁Hank’S液，溶解成致敏红细胞保存液。溶解后的细胞悬液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封，在4～6℃可保存2～4周。
用肝素抗凝，抽取患者空腹静脉血2mL，加4mL pH值为7.4的无钙、镁Hank’S液混匀后，用滴管缓缓加在3mL淋巴细胞分离液上，在18℃下，用半径为22cm的离心机以1200rpm的转速离心25min。
用滴管吸出单个核细胞，放入加有4～6倍量pH值为7.4的无钙、镁Hank’S液的另一离心管中，尽量少吸淋巴细胞分离液。混匀，离心机转速为600rpm，离心6min，弃上清，再用pH值为7.4的无钙、镁Hank’S液洗一次。最后用pH值为7.4的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液配成500万/mL淋巴细胞悬液备用。
取20μL致敏红细胞保存液于0.5mL爱频道夫离心管中，以500rpm转速离心10min后去上清，用pH值为7.4的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮，形成致敏红细胞应用液并恢复至20μL。
取20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮的淋巴细胞悬液20μL加入含有20μL 20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮的致敏红细胞应用液的0.5mL爱频道夫离心管中，充分混匀，在18℃下放置10min，以500rpm转速离心5min后在4℃静置45min。
用带吸头的移液器25μL容积吹吸混合悬液15次；取10μL混合悬液按血片法推制面积8～10cm2细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，高倍镜计数。
改良姬姆萨染色法和判定方法同实施例1。
检测结果CD3+为77％、CD4+为40％、CD8+为30％、CD4+/CD8+为1.33。
实施例4 在冻干抗体致敏红细胞花环试剂WuT3、WuT4、WuT8中分别加入0.5mL pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，溶解成致敏红细胞保存液。溶解后的细胞悬液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封，在4～6℃可保存2～4周。
用EDTA-Na2抗凝，抽取患者空腹静脉血1.5mL，加2mL pH值为7.0的无钙、镁Hank’S液混匀后，用滴管缓缓加在2.5mL淋巴细胞分离液上，在20℃下，用半径为22cm的离心机以1200rpm的转速离心15min。
用滴管吸出单个核细胞，放入加有4～6倍量pH值为7.0的无钙、镁Hank’S液的另一离心管中，尽量少吸淋巴细胞分离液。混匀，离心机转速为400rpm，离心10min，弃上清，再用pH值为7.0的无钙、镁Hank’S液洗一次。最后用pH值为7.0的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液配成450万/mL淋巴细胞悬液备用。
取25μL致敏红细胞保存液于0.5mL爱频道夫离心管中，以600rpm转速离心6min后去上清，用pH值为7.0的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮，形成致敏红细胞应用液并恢复至25μL。
取20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮的淋巴细胞悬液25μL加入含有25μL 20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮的致敏红细胞应用液的0.5mL爱频道夫离心管中，充分混匀，在20℃下放置10min，以300rpm转速离心5min后在4℃静置40min。
用带吸头的移液器20μL容积吹吸混合悬液20次；取10μL混合悬液按血片法推制面积8～10cm2细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，高倍镜计数。
改良姬姆萨染色法和判定方法同实施例1。
检测结果CD3+为55％、CD4+为38％、CD8+为14％、CD4+/CD8+为2.79。
实施例5 在冻干抗体致敏红细胞花环试剂WuT3、WuT4、WuT8中分别加入0.5mL pH值为7.2的磷酸盐缓冲液，溶解成致敏红细胞保存液。溶解后的细胞悬液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封，在4～6℃可保存2～4周。
用肝素抗凝，抽取患者空腹静脉血2mL，加3mL pH值为7.2的无钙、镁Hank’S液混匀后，用滴管缓缓加在3mL淋巴细胞分离液上，在28℃下，用半径为22cm的离心机以900rpm的转速离心20min。
用滴管吸出单个核细胞，放入加有4～6倍量pH值为7.2的无钙、镁Hank’S液的另一离心管中，尽量少吸淋巴细胞分离液。混匀，离心机转速为600rpm，离心8min，弃上清，再用pH值为7.2的无钙、镁Hank’S液洗一次。最后用pH值为7.2的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液配成450万/mL淋巴细胞悬液备用。
取25μL致敏红细胞保存液于0.5mL爱频道夫离心管中，以600rpm转速离心8min后去上清，用pH值为7.2的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮，形成致敏红细胞应用液并恢复至25μL。
取20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮的淋巴细胞悬液25μL加入含有25μL 20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮的致敏红细胞应用液的0.5mL爱频道夫离心管中，充分混匀，在28℃下放置10min，以400rpm转速离心5min后在4℃静置20min。
用带吸头的移液器25μL容积吹吸混合悬液15次；取10μL混合悬液按血片法推制面积8～10cm2细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，高倍镜计数。
改良姬姆萨染色法和判定方法同实施例1。
检测结果CD3+为45％、CD4+为14％、CD8+为38％、CD4+/CD8+为0.37。
实施例6 在冻干抗体致敏红细胞花环试剂WuB中加入0.5mL pH值为7.0的磷酸盐缓冲液，溶解成致敏红细胞保存液；溶解后的细胞悬液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封，在4～6℃可保存2～4周。
用肝素抗凝，抽取患者空腹静脉血2mL，加2.5mL pH值为7.4的无钙、镁Hank’S液混匀后，用滴管缓缓加在3mL淋巴细胞分离液上，在26℃下，用半径为22cm的离心机以1000rpm的转速离心15min。
用滴管吸出单个核细胞，放入加有4～6倍量pH值为7.4的无钙、镁Hank’S液的另一离心管中，尽量少吸淋巴细胞分离液。混匀，离心机转速为600rpm，离心8min，弃上清，再用pH值为7.4的无钙、镁Hank’S液洗一次。最后用pH值为7.4的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液配成550万/mL淋巴细胞悬液备用。
取25μL致敏红细胞保存液于0.5mL爱频道夫离心管中，以600rpm转速离心8min后去上清，用pH值为7.4的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮，形成致敏红细胞应用液并恢复至25μL。
取20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮的淋巴细胞悬液25μL加入含有25μL 20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮的抗体致敏红细胞悬液的0.5mL爱频道夫离心管中，充分混匀，在26℃下放置10min，以500rpm转速离心5min后在4℃静置45min。
用带吸头的移液器20μL容积吹吸混合悬液20次；取10μL混合悬液按血片法推制面积8～10cm2细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，高倍镜计数。
改良姬姆萨染色法和判定方法同实施例1。
检测结果B细胞为9％ 实施例7 在冻干抗体致敏红细胞花环试剂WuB、WuT3、WuT4、WuT8中分别加入0.5mL pH值为7.0的磷酸盐缓冲液，溶解成致敏红细胞保存液；溶解后的细胞悬液如用不完，可加入0.1％NaN3，密封，在4～6℃可保存2～4周。
用肝素抗凝，抽取患者空腹静脉血1mL，加3mL pH值为7.4的无钙、镁Hank’S液混匀后，用滴管缓缓加在3mL淋巴细胞分离液上，在26℃下，用半径为22cm的离心机以1000rpm的转速离心15min。
用滴管吸出单个核细胞，放入加有4～6倍量pH值为7.4的无钙、镁Hank’S液的另一离心管中，尽量少吸淋巴细胞分离液。混匀，离心机转速为600rpm，离心8min，弃上清，再用pH值为7.4的无钙、镁Hank’S液洗一次。最后用pH值为7.4的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液配成550万/mL淋巴细胞悬液备用。
取25μL致敏红细胞保存液于0.5mL爱频道夫离心管中，以600rpm转速离心8min后去上清，用pH值为7.4的含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮，形成致敏红细胞应用液并恢复至25μL。
取20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮的淋巴细胞悬液25μL加入含有25μL 20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮的抗体致敏红细胞悬液的0.5mL爱频道夫离心管中，充分混匀，在26℃下放置10min，以300rpm转速离心5min后在4℃静置45min。
用带吸头的移液器20μL容积吹吸混合悬液20次；取10μL混合悬液按血片法推制面积8～10cm2细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，高倍镜计数。
改良姬姆萨染色法和判定方法同实施例1。
检测结果B细胞为9％、CD3+为55％、CD4+为44％、CD8+为30％、CD4+/CD8+为1.47。
实施例8 取30例标本，分别采用本发明的方法和原McAb-A-E直接法进行对比试验，检测结果如下 用SPSS10.0版统计软件经配对t检验法统计学分析，其结果如下 两组CD3比较t＝-0.672，P＝0.507 两组CD4比较t＝0.793，P＝0.434 两组CD8比较t＝-0.192，P＝0.849 两组CD4/CD8比较t＝0.753，P＝0.458 四组结果的P值均大于0.05(P＞0.05)，差异无显著性。即本发明的方法与原McAb-A-E直接法检测结果差异无显著性。
权利要求
1.单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的方法，包括下述步骤
(1)在冻干抗体致敏红细胞花环试剂中加入0.5mL pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液，溶解成致敏红细胞保存液；
(2)抽取静脉血，以1∶1～3的体积比加入pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液，混匀后，加在淋巴细胞分离液上，淋巴细胞分离液的量与稀释血液的体积比为1∶2～3，在18～28℃温度下，以800～1200rpm的转速离心15～25min；取出单个核细胞，并对单个核细胞用无钙、镁汉克氏平衡盐溶液洗涤后离心，每次以400～600rpm的转速离心6～10min，弃上清；然后用pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液配成400～600万/mL淋巴细胞悬液；
(3)取致敏红细胞保存液，以400～600rpm转速离心6～10min后去上清，用pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液悬浮，形成与所取致敏红细胞保存液等量的致敏红细胞应用液；
(4)淋巴细胞悬液与致敏红细胞应用液以1∶1的体积比混合成混合悬液，在18～28℃温度下放置10min；以300～500rpm转速离心5min后在4℃静置15～45min；
(5)用20μL或25μL容积的带吸头的移液器吹吸混合悬液20或15次；取混合悬液推制细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，然后用高倍镜计数淋巴细胞周围黏附有三个以上红细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞者除掉不计；计数时，选取细胞涂片从头至尾的2/6～4/6之间至少两处区域共计数200个细胞，算出花环形成细胞的百分率。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的方法，其特征在于所述步骤(2)中的静脉血采用肝素或乙二胺四乙酸二钠盐抗凝剂抽取。
全文摘要
本发明涉及一种单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的方法。该方法首先将红细胞花环试剂溶解，其次分离外周血淋巴细胞，用含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液配成淋巴细胞悬液，同时将致敏红细胞悬液用含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液悬浮得致敏红细胞应用液；然后将淋巴细胞悬液与致敏红细胞应用液以1∶1的体积比混合成混合悬液，18～28℃下静置后离心，再在4℃静置15～45min；最后用带吸头的移液器吹吸混合悬液15或20次后推制成细胞涂片，经自然干燥、染色后用高倍镜计数。本发明与原McAb-A-E法相比具有检测过程简化、周期短、可量化控制、满足临床检测要求的特点。
文档编号C12Q1/02GK101109752SQ20071001852
公开日2008年1月23日 申请日期2007年8月1日 优先权日2007年8月1日
发明者姚伯程 申请人:甘肃省医学科学研究院