专利名称：利用费氏丙酸杆菌nx－4制备丙酸及联产维生素b的制作方法
技术领域：
本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种高产丙酸(Propionic Acid)的微生物菌株费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)NX-4，以及将它用于丙酸及联产维生素B12的生产。
背景技术：
丙酸是一种重要精细化工产品和基本化工原料，广泛应用于食品、饲料、橡胶、塑料、油漆、涂料、香料、医药、农药、印刷等领域。
目前丙酸的工业化生产方法采用的是化学合成法。近年来，石油资源日趋紧张，价格不断上扬，化学合成法生产丙酸的成本上升，同时化学合成法本身操作条件苛刻，加上消费者对天然有机产品的青睐，生物法合成丙酸的研究重新活跃起来。美国、德国、法国、印度、墨西哥等国有大量有关微生物生产丙酸的论文和专利，2000年至今检索到的论文达50多篇。国内对丙酸的研究也有一些，但菌株产量普遍不高，其中最高发酵水平为天津科技大学的梁惠珍等人用菌株Propionic bacterium sp TQ-10发酵生产丙酸得24g/L。
维生素B12(氰钴胺)是一种含钴的水溶性维生素，为深红色结晶或结晶粉末。维生素B12具有广泛的生理作用，它参与体内甲基转换及叶酸代谢，促进神经髓鞘中脂蛋白的形成，保持中枢神经和外周有髓鞘神经纤维的功能完整，参与广泛的蛋白质及脂肪代谢等。近年来，国内外市场对维生素B12的需求日益增长，我国生产和出口连年大幅增加。维生素B12及其衍生物的市场前景十分广阔。人们在丙酸生产研究时往往忽略了这一有价值副产物，只有德国Scharif等人考虑丙酸和维生素B12的耦联生产，令人遗憾的是丙酸产量和VB12产量均不高，分别为17.7g/l和49mg/L(EP 0668359)。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产丙酸的微生物新菌株，将其用于制备丙酸及联产维生素B12。
本发明人实验室选育并保藏的微生物菌株费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)NX-4，目前该菌株保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，登记入册的编号是CCTCC No.M 207015，保藏日期是2007年2月7日。以此菌作为生产菌株。
CCTCC No.M 207015菌株具有下述性质1、菌落形态学特征在营养琼脂上，33℃培养48h出现黄色小菌落(＝0.8～1mm)，菌落呈圆形，表面光滑，粘状，中央凸起，不透明。适当延长培养，菌落增大，细胞的尺寸和形状变化很小。
2、生理与生化特性a.培养温度28～37℃，最适温度为33℃；b.在pH5.5～7.2范围内生长；c.色素产生产黄色素；d.耐NaCl浓度在5％浓度可以生长。
3、16S rDNA序列分析测得16S rDNA大部分序列976bp，具体如下5′-CAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGCGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTCATCCATGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGTGGGAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTGATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTTGTAGGCGGTTGATCACGTCGGAAGTGAAATTCCAGGGCTTAACTCTGGGCTTGCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAATGTAGGGGAGAATGGAACTCTCGGTGGAGCGGTGGAATGCGCAGATATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGACATTTCCTGACGCTGAGAAGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTCCCTTCCACGGGGTCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGCCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTG
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4、营养特征费氏丙酸杆菌NX-4的培养基中不需要添加生长因子，可以利用多种化合物作为碳源，这些物质既可以单独使用，也可以适当的比例复配充当碳源。有机氮或无机氮都可以作为氮源使用。培养基中各组分用量配比按各组分与培养基重量体积百分比计为碳源用量为培养基的2～10％，氮源用量为培养基的2～4％，无机盐用量为培养基的0.01～1％，其余为水。碳源一般采用葡萄糖、木糖、果糖、乳酸或甘油等，氮源可采用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、豆饼粉、棉子饼粉、尿素以及(NH4)2SO4、NH4Cl等，培养基中还包括钾盐、钴盐、钠盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、盐酸盐等常用的无机盐类。
利用费氏丙酸杆菌制备丙酸的方法，该方法的步骤为将保藏号为CCTCC M 207015的菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中，在合适生长的条件下静止培养，能够生成丙酸及联产维生素B12。
所述的方法，其中培养基的碳源用量为培养基总重量的2～10％，氮源用量为培养基总重量的2～4％，无机盐用量为培养基总重量的0.01～1％，其余为水。
所述的方法，其中培养基的碳源为葡萄糖、木糖、果糖、乳酸或甘油中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4或NH4Cl中的一种或多种；无机盐为钾盐、钴盐、钠盐、磷酸盐、磷酸二氢盐或盐酸盐中的一种或多种。
所述的方法，其中合适生长的条件是初始pH为6.0～7.0、培养温度为28～37℃、培养时间为48～150小时。
所述的方法，其中发酵液中的菌体破碎可提取维生素B12；除去菌体后的发酵液可提取丙酸。
优选的制备丙酸及联产维生素B12的方法将保藏号CCTCC No.M 207015的费氏丙酸杆菌NX-4菌株斜面活化一天后(斜面培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基)，在含有碳源、氮源和无机盐的培养基上培养48～150小时，可以生成10～53.5g/L丙酸，通常发酵条件还包括培养基为葡萄糖或乳酸2～10％，玉米浆2～4％，(NH4)2SO40.01～0.5％，K2HPO40.01～0.5％，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml，以下同。发酵温度28～37℃，较佳的为32～35℃；培养基的初始pH范围为6.0～7.0，较佳的为6.8～7.0；静止培养。
本发明的有益效果(1)本发明筛选到一株丙酸生产菌，该菌能利用多种碳源和氮源发酵生产丙酸，操作方便简单，培养条件十分粗放。
(2)可以使用纤维素水解糖液(替代葡萄糖或木糖)和豆饼粉(替代酵母膏或蛋白胨)作为丙酸发酵培养基的碳源和氮源，使发酵原料成本大幅下降。
(3)本发明筛选到的丙酸生产菌还能副产高价值的维生素B12，提高了产品生产利率。
具体实施例方式
实施例1斜面培养基葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L，pH6.9。
种子培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，NaCl5g/L，pH6.9。
发酵培养基葡萄糖50g/L，玉米浆20g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9；25×200mm试管中装发酵培养液(即发酵培养基)30ml，CaCO30.5g/试管，121℃灭菌15分钟。
将保藏号为CCTCC No.M 207015的费氏丙酸杆菌NX-4接两环于种子培养基中，33℃培养36h得种子液，将种子液按发酵液体积10％的接种量接入冷却后的发酵液中，35℃培养42h后，加入1g二甲基苯并咪唑，继续培养60h，最后得到的发酵液中丙酸的含量为25.3g/L；发酵菌体中含维生素B1222mg/L。
实施例2发酵培养基葡萄糖60g/L，玉米浆20g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9；500ml容积的三角瓶中装发酵培养液300ml，CaCO35g/三角瓶，121℃灭菌15分钟。
配制种子培养基，配方与培养方法同实施例1，将种子液按发酵液体积10％的接种量接入冷却后的发酵液中，35℃培养48h后，加入1g二甲基苯并咪唑，继续培养68h，最后得到的发酵液中丙酸的含量为28.8g/L；发酵菌体中含维生素B1231mg/L。
实施例3发酵培养基葡萄糖20g/L，乳酸80g/L，玉米浆40g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9。25×200mm试管中装发酵培养液30ml、CaCO31g/试管，121℃灭菌15分钟。
配制种子培养基，配方与培养方法同实施例1，将种子液按发酵液体积10％的接种量接入冷却后的发酵液中，35℃培养140小时，发酵液中含丙酸38.5g/L。
实施例4发酵培养基葡萄糖20g/L，乳酸120g/L，玉米浆40g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9。250ml容积的三角瓶中装发酵培养液140ml、CaCO36g/三角瓶，121℃灭菌15分钟。
配制种子培养基，配方与培养方法同实施例1，将种子液按发酵液体积10％的接种量接入冷却后的发酵液中，35℃培养150小时，发酵液中含丙酸53.5g/L。
实施例5发酵培养基甘油80g/L，玉米浆40g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9。250ml容积的三角瓶中装发酵培养液140ml、CaCO33.5g/三角瓶，121℃灭菌15分钟。
配制种子培养基，配方与培养方法同实施例1，将种子液按发酵液体积10％的接种量接入冷却后的发酵液中，35℃培养80小时，发酵液中含丙酸38.5g/L。
实施例6发酵培养基木糖20g/L，玉米浆20g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9；25×200mm试管中装发酵培养液30ml、CaCO31g/试管，121℃灭菌15分钟。
配制种子培养基，配方与培养方法同实施例1，将种子液按发酵液体积10％的接种量接入冷却后的发酵液中，35℃培养72h，最后得到的发酵液中丙酸的含量为10.8g/L。
<110>南京工业大学<120>利用费氏丙酸杆菌NX-4制备丙酸及联产维生素B12的方法<160>1<210>1<211>976<212>DNA<213>费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)<400>1cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg cagcaacgcc gcgtgcggga 60tgacggcctt cgggttgtaa accgctttca tccatgacga agcgcaagtg acggtagtgg 120gagaagaagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt gatacgtagg gtgcgagcgt 180tgtccggaat tattgggcgt aaagagcttg taggcggttg atcacgtcgg aagtgaaatt 240ccagggctta actctgggct tgctttcgat acgggttgac ttgaggaatg taggggagaa 300tggaactctc ggtggagcgg tggaatgcgc agatatcggg aagaacacca gtggcgaagg 360cggttctctg gacatttcct gacgctgaga agcgaaagcg tggggagcaa acaggcttag 420ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg ggtactaggt gtgggtccct tccacggggt 480ccgtgccgta gctaacgcat taagtacccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac 540tcaaaggaat tgacggggcc ccgcacaagc ggcggagcat gcggattaat tcgatgcaac 600gcgaagaacc ttacctgggt ttgacatgta ctggaagcgt tcagagatgg gcgtgccttt 660ttggctggta cacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 720agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgtccaa tgttgccagc agttcggctg gggactcatt 780ggagaccgcc ggggccaact cggaggaagg tggggatgag gtcaagtcat catgcccctt 840atgtccaggg cttcacgcat gctacaatgg ccggtacaaa gagttgcgag cctgtgaggg 900tgagcgaatc tcagaaagcc ggtctcagtt cggattgggg tctgcaactc gaccccatga 960agtcggagtc gctagt 97权利要求
1.一种费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)NX-4，其在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号是CCTCC No.M 207015。
2.利用费氏丙酸杆菌NX-4制备丙酸及联产维生素B12的方法，其特征在于将保藏号为CCTCC M 207015的菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的培养基中，进行静态培养，可制得丙酸或联产丙酸与维生素B12。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的培养基中，各组分用量按重量体积百分比计为碳源用量为培养基的2～10％，氮源用量为培养基的2～4％，无机盐用量为培养基的0.01～1％，其余为水。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的培养基中，碳源为葡萄糖、木糖、果糖、乳酸或甘油中的一种或多种，氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4或NH4Cl中的一种或多种，无机盐为钾盐、钴盐、钠盐、磷酸盐、磷酸二氢盐或盐酸盐中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于静态培养的条件为初始pH为6.0～7.0，培养温度为28～37℃，培养时间为48～150小时。
全文摘要
本发明公开了一种费氏丙酸杆菌NX－4及利用该菌生产丙酸和维生素B
文档编号C12P19/42GK101045910SQ200710020579
公开日2007年10月3日 申请日期2007年3月13日 优先权日2007年3月13日
发明者徐虹, 洪厚胜, 李莎, 杨丽, 熊强, 欧阳平凯 申请人:南京工业大学