专利名称：四区模拟移动床分离纯化发酵液中的谷氨酰胺的方法
技术领域：
本发明属于生物制品加工领域，涉及一种四区模拟移动床分离纯化发酵液中的谷氨酰胺的方法。
背景技术：
L-谷氨酰胺是L-谷氨酸的γ-羧基酰胺化的一种氨基酸，化学名2，5-二氨基-5-氧代戊酸，作为20种构成蛋白质的基本氨基酸之一，谷氨酰胺是人体血液中最丰富的氨基酸，亦是骨骼肌细胞内最丰富的氨基酸，约占全身游离氨基酸的一半以上，在生物体代谢中起着举足轻重的作用，是一种“条件性必需氨基酸”。自1952年用X光衍射确定了其分子结构后，对它的应用就日益引起人们的关注，被认为是目前所知道的最重要的氨基酸之一，也是一种极有发展前途的新药。目前谷氨酰胺生产主要使用发酵法，发酵法生产谷氨酰胺得以工业化生产还依赖于谷氨酰胺分离提取技术。目前国内外谷氨酰胺的分离提取几乎都采用以离子交换树脂为填料的柱层析法，虽然可以进行大规模制备，但是分离的效率低，流动相浪费严重，固定相利用效率低，产量低，成本高。
70年代以来，美国UOP公司开发了模拟移动床(SMB)原理的色谱技术，该技术使吸附剂颗粒装填后不在移动，由原料进出口和产品液流进出口不断切换的方法，形成吸附剂颗粒和液流相对逆流运动来模拟固定相的移动。20世纪90年代模拟移动床色谱应用范围也不断扩大，遍及石油、精细化工、生物发酵、医药、食品等很多生产领域，尤其在同系化合物、手性异构体药物、糖类、有机酸和氨基酸等混合物的分离中显示出其独特性能。美国的一些专利文献报道了模拟移动床色谱分离手性药物如光学异构体、外消旋物质和对映体以及石油化学品的分离。日本Daicel化学工业公司也开发了使用模拟移动床色谱分离手性异构体的方法。但是，对于使用模拟移动床色谱分离提纯谷氨酰胺的方法仍未见公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种四区模拟移动床分离纯化发酵液中的谷氨酰胺的方法，工业化连续生产，提高产品的纯度、收率和产量。
本发明的技术解决方案包括以下步骤a、谷氨酰胺酵母发酵液装入PES超滤膜的超滤设备中，在不超过0.25MPa的氮气下进行超滤除去酵母细胞菌体、固形物及蛋白质，降低料液的粘度；b、将超滤过的发酵液通过活性炭脱色；c、将脱色后的发酵液通过减压浓缩、结晶脱盐；d、将脱盐后的粗晶配成浓度为10-80g/l的进样液装入装有阳离子交换树脂的模拟移动床系统SMB中进行吸附，由pH10-14的去离子水进行洗脱，控制各功能区样品的迁移速度，将谷氨酰胺和谷氨酸分别从提取液和提余液出口收集；e、模拟移动床的萃取液经旋转蒸发仪浓缩至无水，由甲醇洗脱后在真空干燥箱烘干得成品。
本发明方法中的模拟移动床系统由多根相同的阳离子交换树脂柱串联，即通过离子交换过程中的强弱吸附组分的吸附、精制、解吸、树脂再生不同功能区之间的按顺序切换，根据强弱吸附组分在分离介质上迁移速度不同的原理进行分离，通过组合阀门的切换来改变进料口、提余液出口、流动相入口、提取液出口的位置得到目标产物；其中，切换时间的标准是通过调整各功能区洗脱液的流速和离子交换柱的根数来控制目标物的迁移速度；各功能区离子交换柱的数量根据所需要洗脱的目标物在此切换时间被洗脱的迁移长度决定，切换时按功能区进行切换。
本发明方法中的模拟移动床色谱(SMBC)分离系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、色谱柱、电磁阀、信号采集器、系统控制器及计算机连接组成，洗脱泵流量200-800ml/min，压力1-10Mpa；进样泵流量10-50ml/min，压力1-10Mpa；萃取泵流量100-500ml/min，压力1-10Mpa；提余泵流量100-500ml/min，压力1-10Mpa；阀切换时间为18-24min；整个模拟移动床的温度为25-35℃，进料液、洗脱液温度25-35℃，二者温度保持一致。
本发明方法中的模拟移动床系统由4-16根离子交换柱串联，模拟移动床系统按照四个口的位置分四区，每区由1-4根相同的离子交换柱，一区位于洗脱液入口处与提取液出口处之间，在此区内，实现谷氨酰胺发酵液粗提取物中强吸附组分的解吸；二区位于提取液出口处与进料口之间，其作用相当于精馏塔，使谷氨酰胺粗提取物中强吸附组分反复吸附、解吸而浓缩，从提取液出口得到谷氨酸；三区位于进料口与提余液出口之间，其作用是尽可能地将谷氨酰胺和谷氨酸吸附在固定相上，从提余液出口得到含谷氨酰胺；四区位于洗脱液入口与提余液出口之间，一方面，液相中的谷氨酰胺和谷氨酸被固定相吸附，其洗脱液与新鲜的洗脱液一起进入一区，从而达到循环利用的目的；另一方面将三区与一区隔开，以免提余液中的谷氨酰胺和谷氨酸进入一区而污染提取液，起到一定的缓冲作用。
本发明的方法采用模拟移动床系统分离纯化发酵液中的谷氨酰胺，连续化工业化生产，产品纯度好、效率高、产量大、生产成本低。
具体实施例方式
实例1选用谷氨酰胺发酵液，在江苏汉邦科技有限公司的模拟移动床上实现谷氨酰胺的纯化a、取谷氨酰胺酵母发酵液装入PES超滤膜的超滤设备中，在不超过0.25MPa的氮气下进行超滤除去酵母细胞菌体、固形物及蛋白质，降低料液的粘度；b、将超滤过的发酵液通过活性炭脱色；c、将脱色后的发酵液通过减压浓缩、结晶脱盐；d、将脱盐后的粗晶配成浓度为10g/l的进样液进入模拟移动床系统由pH10的去离子水进行洗脱；e、将模拟移动床的萃取液经旋转蒸发仪浓缩至无水，由甲醇洗脱后在真空干燥箱烘干得成品。
本发明方法中的模拟移动床色谱(SMBC)分离系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、色谱柱、电磁阀、信号采集器、系统控制器及计算机连接组成，洗脱液流速为200ml/min，萃取液流速为100ml/min，提余液流速为100ml/min阀切换时间为18min；进料液流速为10ml/min；各泵工作压力1Mpa；整个模拟移动床的温度为25℃，进料液、洗脱液温度25℃。
本发明方法中的模拟移动床系统SMB的由4根相同的离子交换柱串联，按照四个口的位置分4区一区位于洗脱液入口处与提取液出口处之间，在此区内，实现谷氨酰胺发酵液粗提取物中强吸附组分的解吸；二区位于提取液出口处与进料口之间，其作用相当于精馏塔，使谷氨酰胺粗提取物中强吸附组分反复吸附、解吸而浓缩，从提取液出口得到谷氨酸；三区位于进料口与提余液出口之间，其作用是尽可能地将谷氨酰胺和谷氨酸吸附在固定相上，从提余液出口得到含谷氨酰胺；四区位于洗脱液入口与提余液出口之间，一方面，液相中的谷氨酰胺和谷氨酸被固定相吸附，其洗脱液与新鲜的洗脱液一起进入一区，从而达到循环利用的目的；另一方面将三区与一区隔开，以免提余液中的谷氨酰胺和谷氨酸进入一区而污染提取液，起到一定的缓冲作用。
成品柱前衍生反相高效液相色谱(HPLC)法检测PerkinElmer Series 200高效液相色谱系统；紫外检测器，检测波长254nm；Hedera ODS-24.6mm×250mm分析柱，填料粒径5μm；1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液作为衍生剂，取样品9.86mg置10ml棕色量瓶中，加0.5mol/L pH＝9.0NaHCO3溶液1ml，加1％2，4-二硝基氟苯乙腈溶液1ml，置60摄氏度水浴中暗处加热1小时后取出，放冷，加pH＝7.0磷酸盐缓冲液至刻度；洗脱液由A、B双组分组成梯度洗脱，A为CH3CN∶H2O＝1∶1，B为0.03mol/l NaAC-HAC，流速1ml/min，进样浓度1mg/ml，进样量20μl，检测温度25℃；依以下表格中参数使用外标法测定成品谷氨酰胺含量98％。
实例2选用谷氨酰胺发酵液，在江苏汉邦科技有限公司的模拟移动床上实现谷氨酰胺的纯化a、取谷氨酰胺酵母发酵液装入PES超滤膜的超滤设备中，在不超过0.25MPa的氮气下进行超滤除去酵母细胞菌体、固形物及蛋白质，降低料液的粘度；b、将超滤过的发酵液通过活性炭脱色；c、将脱色后的发酵液通过减压浓缩、结晶脱盐；d、将脱盐后的粗晶配成浓度为45g/l的进样液进入模拟移动床系统由pH12的去离子水进行洗脱；e、将模拟移动床的萃取液经旋转蒸发仪浓缩至无不，由甲醇洗脱后在真空干燥箱烘干得成品。
本发明方法中的模拟移动床色谱(SMBC)分离系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、色谱柱、电磁阀、信号采集器、系统控制器及计算机连接组成，洗脱液流速为500ml/min，压力5Mpa；进样液流速为30ml/min，压力5Mpa，萃取液流速为300ml/min，压力5Mpa；提余液流速为300ml/min；阀切换时间为21min工作温度30℃，进料液、洗脱液温度30℃。
本发明方法中的模拟移动床系统SMB由12根相同的离子交换柱串联，按照四个口的位置分4区，每区由3根交换柱，一区位于洗脱液入口处与提取液出口处之间，在此区内，实现谷氨酰胺发酵液粗提取物中强吸附组分的解吸；二区位于提取液出口处与进料口之间，其作用相当于精馏塔，使谷氨酰胺粗提取物中强吸附组分反复吸附、解吸而浓缩，从提取液出口得到谷氨酸；三区位于进料口与提余液出口之间，其作用是尽可能地将谷氨酰胺和谷氨酸吸附在固定相上，从提余液出口得到含谷氨酰胺；四区位于洗脱液入口与提余液出口之间，一方面，液相中的谷氨酰胺和谷氨酸被固定相吸附，其洗脱液与新鲜的洗脱液一起进入一区，从而达到循环利用的目的；另一方面将三区与一区隔开，以免提余液中的谷氨酰胺和谷氨酸进入一区而污染提取液，起到一定的缓冲作用。
成品柱前衍生反相高效液相色谱(HPLC)法检测PerkinElmer Series 200高效液相色谱系统；紫外检测器，检测波长254nm；Hedera ODS-24.6mm×250mm分析柱，填料粒径5μm；1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液作为衍生剂，取样品9.86mg置10ml棕色量瓶中，加0.5mol/L pH＝9.0NaHCO3溶液1ml，加1％2，4-二硝基氟苯乙腈溶液1ml，置60摄氏度水浴中暗处加热1小时后取出，放冷，加pH＝7.0磷酸盐缓冲液至刻度；洗脱液由A、B双组分组成梯度洗脱，A为CH3CN∶H2O＝1∶1，B为0.03mol/l NaAC-HAC，流速1ml/min，进样浓度1mg/ml，进样量20μl，检测温度25℃；依以下表格中参数使用外标法测定成品谷氨酰胺含量98.68％。
实例3选用谷氨酰胺发酵液，在江苏汉邦科技有限公司的模拟移动床上实现谷氨酰胺的纯化a、取谷氨酰胺酵母发酵液装入PES超滤膜的超滤设备中，在不超过0.25MPa的氮气下进行超滤除去酵母细胞菌体、固形物及蛋白质，降低料液的粘度b、将超滤过的发酵液通过活性炭脱色；c、将脱色后的发酵液通过减压浓缩、结晶脱盐；d、将脱盐后的粗晶配成浓度为80g/l的进样液进入模拟移动床系统由pH14的去离子水进行洗脱；e、将模拟移动床的萃取液经旋转蒸发仪浓缩至无不，由甲醇洗脱后在真空干燥箱烘干得成品。
本发明方法中的模拟移动床色谱(SMBC)分离系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、色谱柱、电磁阀、信号采集器、系统控制器及计算机连接组成，洗脱液流速为800ml/min，压力10Mpa；进样液流速为50ml/min，压力10Mpa，萃取液流速为500ml/min，压力10Mpa；提余液流速500ml/min；阀切换时间为24min；工作温度35℃，进料液、洗脱液温度35℃。
本发明方法中的模拟移动床系统SMB由16根相同的离子交换柱串联，按照四个口的位置分4区，每区4根交换柱，一区位于洗脱液入口处与提取液出口处之间，在此区内，实现谷氨酰胺发酵液粗提取物中强吸附组分的解吸；二区位于提取液出口处与进料口之间，其作用相当于精馏塔，使谷氨酰胺粗提取物中强吸附组分反复吸附、解吸而浓缩，从提取液出口得到谷氨酸；三区位于进料口与提余液出口之间，其作用是尽可能地将谷氨酰胺和谷氨酸吸附在固定相上，从提余液出口得到含谷氨酰胺；四区位于洗脱液入口与提余液出口之间，一方面，液相中的谷氨酰胺和谷氨酸被固定相吸附，其洗脱液与新鲜的洗脱液一起进入一区，从而达到循环利用的目的；另一方面将三区与一区隔开，以免提余液中的谷氨酰胺和谷氨酸进入一区而污染提取液，起到一定的缓冲作用。
成品柱前衍生反相高效液相色谱(HPLC)法检测PerkinElmer Series 200高效液相色谱系统；紫外检测器，检测波长254nm；Hedera ODS-24.6mm×250mm分析柱，填料粒径5μm；1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液作为衍生剂，取样品9.86mg置10ml棕色量瓶中，加0.5mol/L pH＝9.0NaHCO3溶液1ml，加1％2，4-二硝基氟苯乙腈溶液1ml，置60摄氏度水浴中暗处加热1小时后取出，放冷，加pH＝7.0磷酸盐缓冲液至刻度；流动相由A、B双组分组成梯度洗脱，A为CH3CN∶H2O＝1∶1，B为0.03mol/l NaAC-HAC，流速1ml/min，进样浓度1mg/ml，进样量20μl，检测温度25℃；依以下表格参数方式使用外标法测定成品谷氨酰胺含量99.10％。
权利要求
1.四区模拟移动床分离纯化发酵液中谷氨酰胺的方法，其特征在于a、谷氨酰胺酵母发酵液装入PES超滤膜的超滤设备中，在不超过0.25MPa的氮气下进行超滤除去酵母细胞菌体、固形物及蛋白质，降低料液的粘度；b、将超滤过的发酵液通过活性炭脱色；c、将脱色后的发酵液通过减压浓缩、结晶脱盐； d、将脱盐后的粗晶配成浓度为10-80g/l的进样液装入装有阳离子交换树脂的模拟移动床系统SMB中由pH 10-14的去离子水进行洗脱，控制各功能区样品的迁移速度，将谷氨酰胺和谷氨酸分别从提取液和提余液出口收集；e、模拟移动床的萃取液经旋转蒸发仪浓缩至无水，由甲醇洗脱后在真空干燥箱烘干得成品。
2.根据权利要求1所述的四区模拟移动床分离纯化发酵液中谷氨酰胺的方法，其特征在于模拟移动床色谱(SMBC)分离系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、色谱柱、电磁阀、信号采集器、系统控制器及计算机连接组成，洗脱泵流量200-800ml/min，压力1-10Mpa；进样泵流量10-50ml/min，压力1-10Mpa；萃取泵流量100-500ml/min，压力1-10Mpa；提余泵流量100-500ml/min，压力1-10MPa；阀切换时间为18-24min；整个模拟移动动的温度25-35℃，进料液、洗脱液温度25-35℃。
3.根据权利要求1所述的四区模拟移动床分离纯化发酵液中谷氨酰胺的方法，其特征在于模拟移动床系统由4-16根相同的离子交换柱串联，模拟移动床系统按照四个口的位置分四区，每区1-4根交换柱，一区位于洗脱液入口处与提取液出口处之间；二区位于提取液出口处与进料口之间；三区位于进料口与提余液出口之间；四区位于洗脱液入口与提余液出口之间。
全文摘要
本发明公开了四区模拟移动床分离纯化发酵液中谷氨酰胺的方法，谷氨酰胺发酵液装入PES超滤膜的超滤设备中，在不超过0.25MPa的氮气下进行超滤除去酵母细胞菌体、固形物及蛋白质；将超滤过的发酵液通过活性炭脱色；将脱色后的发酵液通过减压浓缩、结晶脱盐；将脱盐后的粗晶配成浓度为10－80g/l的进样液装入模拟移动床，由pH 10－14的去离子水进行洗脱，将谷氨酰胺和谷氨酸分别从提取液和提余液出口收集；萃取液旋转蒸发仪浓缩至无水，由甲醇洗脱后在真空干燥箱烘干得成品。本发明的方法采用模拟移动床分离纯化发酵液中谷氨酰胺，连续化工业生产，产品纯度好、效率高、产量大、生产成本低。
文档编号C12P13/14GK101085748SQ200710022900
公开日2007年12月12日 申请日期2007年5月24日 优先权日2007年5月24日
发明者张大兵, 王亚辉, 孟强, 王艳 申请人:江苏汉邦科技有限公司