专利名称：一种肌母细胞的制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及一种细胞处理技术，特别是涉及一种从 肌肉组织提取分离及扩增肌母细胞的技术。
背景技术：
经对近年美国、德国、中国、日本等国家的科技文献检索，肌母细胞(也 称为成肌细胞或肌肉组织干细胞)处理和应用的技术已逐渐成为国际医学界 关心的热点课题。这些文献中，较大部分介绍了肌母细胞移植到心脏用于心 肌细胞缺损的治疗，也有一些对其它疾病临床治疗方法的探讨和研究。有些 试验发现用特殊的细胞因子对细胞进行刺激，能促进肌肉组织在活体内的生 存，但刺激后的肌肉组织仍发生细胞死亡，说明肌母细胞的移植技术和治疗 效果仍有待进一步研究。有些专利文献介绍了肌母细胞培养基的制备和细胞 的培养，但并未提供完整的肌母细胞制备技术和方法。有些文献涉及肌母细 胞的分离技术，但困惑于尚不清楚肌母细胞有何表面标志物特征。
然而，作为细胞治疗方法，提取和获得高纯度的肌母细胞乃是先决条件， 不能获得高度纯化的肌母细胞将阻碍其在临床上的进一步应用和推广。在骨
骼肌的细胞培养中真正的肌母细胞只占有20-50%，因此，如何获得高纯度的 肌母细胞仍是医学界探究的难题，目前各国都在进行这一问题的研究。
综观研究现状，肌母细胞的提取和纯化目前有克隆法和贴壁粘连两种方法。
克隆法可以得到高度纯化的肌母细胞.，但要得到108的细胞必须传30代 以上，并且已有资料表明传30代以上的细胞癌变机会明显升高，不利于临床 治疗。
贴壁粘连法很难得到高度纯化的肌母细胞。肌细胞的原代培养中存在大 量的纤维母细胞。采用贴壁粘连法难以去除培养产物中的纤维母细胞，细胞移植后这些纤维母细胞会形成组织疤痕，同样不利于临床治疗。本发明者通过筛选，确定了 CD56是肌母细胞的特有标志物，经过潜心研 究，用磁性分离法解决了快速、高纯度分离肌母细胞的方法，从而完成了本 发明。因此，本发明的目的是提供一种肌母细胞的制备方法，该方法有别于上 述克隆法和贴壁粘连法，能稳定地获得高纯度肌母细胞。发明内容本发明提供的肌母细胞的制备方法系将骨骼肌细胞培养物用50-200nm 直径的CD56免疫磁珠、在MACS分离磁板上进行分离，得到CD56阳性细胞。免疫磁珠分离法是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相 结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中， 无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁 性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。本发明者应用流式细胞仪测定CD25、 CD34、 CD64、 CD86、 CDllc等细胞 表面标志物，发现只有CD56在骨骼肌细胞培养物中有阴性和阳性二群细胞。 本发明者进一步用肌母细胞的特有细胞内标志物Desmin来验证阳性肌母细 胞。在用CD56免疫磁珠分离CD56阴性和阳性细胞后，发现只有CD56阳性的 细胞才是Desmin阳性的，从而确定了 CD56作为肌母细胞的特有表面标志物。 CD56免疫磁珠能与CD56阳性的细胞特异性地结合，从而能在MACS分离磁板 上分离出CD56阳性的肌母细胞。本发明提供的肌母细胞制取方法的主要步骤是由骨骼肌母细胞的培养 物一CD56表型的测定一CD56免疫磁珠分离纯化肌母细胞一CD56阳性细胞的培养。具体地说，本发明的制备方法可包括如下步骤肌肉组织单细胞悬液一 贴壁粘连2小时一悬浮细胞一经过两周扩增至107个细胞一细胞表面标志物 的确定一发现CD56阳性和CD56阴性两群细胞一在MACS分离磁板上分离出与 CD56免疫磁珠结合的CD56阳性细胞一鉴定Desmin阳性的肌母细胞，纯度为 95%—进一步扩增到108个细胞。本发明的一个优选实施方案中，骨骼肌细胞培养物是骨骼肌母细胞的原代培养物。所述骨骼肌细胞原代培养物是按如下方法制备的将骨骼肌细胞
悬液在含有20%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100ug/ml的F-10培 养基中，5% C02、 37-C条件下培养瓶中培养，控制细胞生长密度在80%以下。 经过两周培养，细胞数增至107个细胞。
本发明的肌母细胞制备方法中采用的免疫磁珠分离包括以下步骤
(1) 安装分离柱，用缓冲液预洗以去除分离柱中的气泡；
(2) 加CD56抗体结合磁珠，6-12"C反应15分钟至l小时;
(3) 加入肌母细胞悬液；
(4) 用缓冲液洗脱CD56阴性细胞；
(5) 取下分离柱，加1 ml的缓冲液洗柱，收集阳性细胞。 所述免疫磁珠分离中所用的缓冲液pH为7. 2，每100ml的PBS中含有2mM
EDTA; 0.5%BSA。
一个优选的实施方案是免疫磁珠分离中所用的缓冲液在使用前经超声抽 滤去除气泡，以提高磁珠和磁珠分离器之间的结合效率。
一个优选的实施方案是免疫磁珠分离中所用的细胞悬液中细胞含量为
1()7个细胞/io(Ha。细胞悬液的制备是用0.1%胰蛋白酶将原代培养的骨骼肌
细胞从培养瓶中收集起来，用PBS洗三次后将细胞小块悬浮于上面的缓冲液 里，并调整细胞浓度为107个细胞/100!_11。
一个优选的实施方案是免疫磁珠分离前后用流式细胞仪测定细胞CD56 的表达水平，以便于检测CD56阳性细胞的纯度。
一个优选的实施方案是将磁珠分离获得的CD56阳性细胞进一步用含20% 胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml的F-IO培养基，于5% C02、 37。C条件下培养至细胞含量增至108个细胞/ml。
本发明方法制备的肌母细胞纯度达95%，而且培养周期短。制得的肌母 细胞可直接用于移植或经转基因后进行移植。
在一项实验治疗研究中，将基因重组的人CD56阳性肌母细胞移植到不 同的免疫缺损的小鼠肌组织中，测定小鼠血中的人第九因子，可以发现人第 九因子能在这些小鼠体内持续表达五周以上，表明人CD56阳性肌母细胞可 以用来作为基因治疗的载体。
用本发明方法制备的高纯度肌母细胞瑋用于临床治疗多种疾病，如心肌损害时的细胞治疗和以细胞为基础的基因治疗，缺损骨、肌肉组织的修复， 括约肌松弛的修复，肌无力症细胞移植治疗等。由于纯度高，临床治疗效果 好，具有良好的应用推广前景。
图1显示人肌母细胞原代培养物的细胞表面标志。其中至少有两群细胞，
即CD56阴性和CD56阳性细胞。
图2显示人CD56阳性细胞的纯化效果。上图是纯化前的人肌细胞的原 代培养物；下图是纯化后的CD56阳性细胞。
图3显示CD56阳性细胞的特征(Desmin染色)。纯化后的CD56阳性 细胞均是Desmin阳性细胞。Desmin是一种肌细胞的特异性标志物，说明本 发明从肌组织原代培养中纯化的CD56阳性细胞是肌母细胞。
图4显示纯化后的CD56阳性肌母细胞的形态特征。上图是CD56阳性 肌母细胞的形态特征；下图是CD56阳性肌母细胞能表达转入的基因产物 (LacZ)o
具体实施例方式
本发明的方法可从以下具体实施方式
了解得更清楚。然而应理解以下具 体实施例虽然表明了本发明的优选实施方式，但只是阐述性的，因为本领域 技术人员明白，依据这些实施例的详细描述所作出的各种变化和修改都在本 发明的构思和范围内。
实施例l骨骼肌母细胞的原代培养.
手术过程中取活检正常骨骼肌2g，无菌条件下放入含5ml F10的培养液 培养瓶中，用不含Ca、 Mg"的dHanks液5ml冲洗2-3次，去除标本上的血 污，剔除结缔组织和血管组织，用眼科剪剪成lmm3大小，加入0.25%胰蛋白 酶和0. 1%胶原酶消化3-10分钟，用吸管吹打，使细胞分散为单个细胞，用 100^im细胞滤膜去除未消化的组织，再用5ml dHanks液洗涤细胞，用含有 20%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100吗/ml的F-10培养基调节细 胞浓度，于5% C02、 37'C条件下培养瓶中培养，每日观察细胞生长情况，将细胞生长密度维持在80%以下，以防止肌管的形成。经过两周培养后，细胞 数增至107个细胞/1111。
实施例2 CD56表型的测定
去除培养液后用dHank液冲洗贴壁细胞，再用0. 25%胰酶消化细胞1分 钟，加入培养液终止消化，用吸管吹打收集细胞，用5mlPBS洗涤2次，以含 0. 1%BSA的PBS制成1. 0X K)6个/ml的细胞悬液备用。
将细胞悬液300xg离心5分钟，去上清，将细胞调整到100 u 1，加20 pl CD56-PE抗体(BD Pharmingen, USA) 4。C避光反应30分钟，加3 ml PBS漂 洗三遍，用流式细胞仪测定细胞CD56的表达水平(未能及时测定的标本应加 0. 5ml的1%戊二醛固定)。细胞悬液加IgGl-PE标记作为同型对照，在同样条 件下进行测定。
实施例3 CD56免疫磁珠分离纯化肌母细胞
本实施例所用的CD56免疫磁珠购自Miltenyi Biotech公司 (#130-050-401)。 MACS分离磁板(MACS S印arator)也购自Miltenyi Biotech
公司购得。
1. 缓冲液(pH7.2)的配制 100 ml的缓冲液中含有
PBS 99. 5 ml
EDTA 2 mM
10%BSA 0. 5 ml 用负压抽滤15分钟，去除缓冲液中的气泡。因为分离柱中的气泡会影响 磁珠和磁珠分离器之间的结合。
2. 细胞悬液的准备
(1) 用10-20倍体积的缓冲液洗涤肌母细胞；
(2) 300xg离心10分钟，弃去上清液；
(3) 用上述缓冲液500n 1悬浮细胞，并将将肌母细胞浓度调整为108 个细胞/80ul。
(4) 加20y 1的CD56抗体结合磁珠，6-12'C反应15分钟。(5)用3 ml缓冲液分别洗三次。最后将肌母细胞团悬浮于缓冲液中， 并调整为108个细胞/50011 1备用。3. 分离柱的准备-(1) 将MiniMACS分离柱装于MACS MultiStand分离磁板上；(2) 用500 pl缓冲液将分离柱预洗一次，去除其中的气泡备用；4. 肌母细胞的分离-(1) 将上述细胞悬液500 Ul加在柱上；(2) 用500 lal缓冲液洗3遍，收集缓冲洗液中的阴性细胞；(3) 取下分离柱，加l ml的缓冲液洗柱，收集阳性细胞。 在分离中同时分别用试管收集取样分离前的细胞和分离后的细胞即阴性细胞及阳性细胞，离心后，用上面的CD56表型测定的方法，标记CD56-PE 并进行流式测定分析CD56的阳性细胞作为纯度的指标。图2为用流式测定分析人CD56阳性细胞的纯化效果。上图是纯化前的 人肌细胞的原代培养物；下图是纯化后的CD56阳性细胞。结果显示，用本 发明方法得到的肌母细胞纯度>95% 。实施例4 CD56阳性细胞的扩增将实施例4分离获得的CD56阳性细胞加培养液继续培养，用20%胎牛血 清、青霉素IOO U/ml、链霉素IOO吗/ml'的F-10培养基调节细胞浓度，5% C02、 37'C条件下培养瓶中培养，每日观察细胞生长情况，细胞生长密度维持 在80%以下，以防止肌管的形成，经5天扩增至108个细胞。
权利要求
1. 肌母细胞的制备方法，其特征在于将骨骼肌细胞培养物用50-200nm直径的CD56免疫磁珠、在MACS分离磁板上进行分离，得到CD56阳性细胞。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述骨骼肌细胞培养物是骨骼肌母细 胞的原代培养物。
3. 如权利要求2所述的方法，其中所述骨骼肌细胞原代培养物是按如下 方法制备的将骨骼肌细胞悬液在含有20%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链 霉素100ug/ml的F-IO培养基中，5%C02、 37'C条件下培养瓶中培养，控制 细胞生长密度在80%以下。
4. 如权利要求l所述的方法，其中所述免疫磁珠的分离包括以下步骤(1) 安装分离柱，用缓冲液预洗以去除分离柱中的气泡；(2) 加CD56抗体结合磁珠，6-12"反应15分钟至1小时；(3) 加入肌母细胞悬液；(4) 用缓冲液洗脱CD56阴性细胞；(5) 取下分离柱，加l ml的缓冲液洗柱，收集阳性细胞。
5. 如权利要求4所述的方法，其中所述缓冲液为PBS缓冲液(pH 7. 2)， 每100mlPBS中含有2mM EDTA; 0. 5%BSA。
6. 如权利要求4所述的方法，其中所述缓冲液在使用前经超声抽滤去除 气泡。
7. 如权利要求4所述的方法，其中所述细胞悬液中的细胞含量为107个 细胞/100u 1。
8. 如权利要求1所述的方法，其中所述免疫磁珠分离前后用流式细胞仪 测定细胞CD56的表达水平。
9. 如权利要求l所述的方法，其中还包括将磁珠分离获得的CD56阳性 细胞用含20%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100u g/ml的F-10培养 基，于5% C02、 37"C条件下培养至细胞含量增至108个细胞。
全文摘要
提供一种肌母细胞的制备方法，包括将骨骼肌细胞培养物用50-200nm直径的CD56免疫磁珠、在分离磁板上进行分离，得到CD56阳性细胞。本方法基于肌母细胞特有标志物CD56的发现，采用CD56免疫磁珠与CD56阳性的细胞特异性的结合，在MACS分离磁板上分离出CD56阳性的肌母细胞，从而稳定地获得高纯度肌母细胞。
文档编号C12N5/077GK101225372SQ20071003662
公开日2008年7月23日 申请日期2007年1月19日 优先权日2007年1月19日
发明者刘中民, 吴燕灵, 陈炳官 申请人:上海市东方医院