专利名称：靶向表皮生长因子受体的小干扰rna重组腺病毒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及重组腺病毒，具体涉及耙向表皮生长因子受体 的小干扰RNA重组腺病毒及其在抑制人肺腺癌细胞体内生长中的作用。
技术背景表皮生长因子受体(印idermal growth factor rec印tor， EGFR)通过与配 体结合形成复合物，引起一系列的生物效应，促进上皮再生、刺激体内多种细胞 的分裂。EGFR基因的扩增及产物的过度表达与人体肿瘤的发生密切相关，人类 多种肿瘤存在EGFR的过度表达。EGFR过表达与肺癌的恶性程度、转移、放化疗 敏感性及预后密切相关，阻滞EGFR通路能有效地抑制肿瘤生长，说明EGFR是 一个非常有前途的肺癌靶向治疗的靶点，以此靶点开发有效的药物可望使目前效 果不甚理想的肺癌治疗有所突破。目前以EGFR为靶点的肿瘤生物治疗手段存在有效率低、在延长患者生存期 方面无优越性、价格昂贵、转染效率低、表达不稳定等问题，使得调控EGFR的 肿瘤治疗研究尚未有突破性进展。RNA干扰是由双链RNA引发的一种高效基因表达抑制途径，是转录后基因沉 默的重要机制。近年来这一技术发展迅速，目前已经在基因组功能研究和疾病的 基因治疗研究中取得了巨大进展。RNA干扰技术阻断基因表达具有高效率和高特 异的特点，且RNA干扰具有级联放大效应，甚至其效应可传递至子代细胞，是适 合肿瘤基因治疗的新手段。目前RNA干扰应用于临床治疗的主要难题就是如何增 加小干扰RNA稳定性并提高导入效率，以提高RNA干扰的效率并延长RNA干扰效 应时间。 发明内容本发明的目的是提供一种靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒。 本发明的进一步目的是提供上述重组腺病毒在抑制人肺腺癌细胞体内生长 中的用途。本发明针对肺癌治疗和基因调节技术的难点，实现动物体内核酸导入，产生 RNA干扰效应，下调EGFR表达，抑制肿瘤生长。本发明使用pSilencer adeno 1. 0-CMV腺病毒载体系统(美国Ambion公 司)，构建shuttle vector —穿梭载体(图1)，其中，修饰的CMV启动子驱动小 发夹RNA表达，由修饰的SV40 polyA signal作为终止子，和backbone vector 一骨架载体在包装细胞293细胞中发生同源重组，得到预期的复制缺陷型重组 腺病毒。本发明的重组腺病毒通过下述方法制备根据EGFR基因在GenBank中的序列(NM一005228)设计对应的小干扰RNA。 设计原则是从启动子下游75碱基处寻找到第一个AA二聚体；记录AA下游19 个碱基序列为目的序列；计算目的序列中嘌呤和嘧啶的含量百分比(G/C)。 G/C 比值接近50%为较理想，标准是大于30%小于70%;如果选择的序列中G/C含量 不能达到要求，继续搜寻下一个AA二聚体，直到获得满意结果；在GenBank表 达序列标签数据库中用BLAST检索，确认所设计小干扰RNA序列的唯一性。设计 的针对EGFR基因的小干扰RNA序列，正义链5'-GGAGCUGCCCAUGAGAAAU-3'; 反义链5'-AUUUCUCAUGGGCAGCUCC-3';化学合成小干扰RNA初步验证了其抑 制EGFR基因表达的效应；以此序列为基础，设计靶向EGFR的小干扰RNA DNA表达模板 5' -TCGAGGGAGCTGCCCATGAGAAATTTCAAGAGAATTTCTCATGGGCAGCTCCTT A-3'3' -CCCTCGACGGGTACTCTTTAAAGTTCTCTT嵐GAGTACCCGTCGAGGAA TGATC-5， 序列进行酶切分析保证其中无PacI ， EcoRI， HindIII酶切位点；使用pSilencer adeno 1.0-CMV腺病毒载体系统(美国Ambion公司)，以 穿梭载体的多克隆位点中Xho I和Spe I为插入位点，将上述耙向EGFR的小干扰 RNA DNA表达模板与穿梭载体连接，即构建了靶向EGFR基因的小干扰RNA穿梭 载体，其中，修饰的CMV启动子驱动小干扰RNA表达，由修饰的SV40 polyA signal 作为终止子(图1);将上述构建的靶向EGFR基因的小干扰RNA穿梭载体和骨架载体在293细胞 中同源重组，得到靶向EGFR的小干扰RNA重组腺病毒Adv-shEGFR。将所得的重组腺病毒扩增、纯化、鉴定后，测定病毒滴度和感染效率，分析重组腺病毒抑制EGFR表达的效率。以插入无关序列表达模板的重组腺病毒Adv-shNEG作为研究对照。
最后通过体内实验验证靶向EGFR的小干扰RNA重组腺病毒的抗肿瘤活性。 以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照〈分子克隆实验指南〉。 本发明构建的小干扰RNA病毒表达载体，不仅可提高小干扰RNA导入效率，还可延长RNA干扰效应的时间。
图1是pSilencer adeno 1.0-CMV腺病毒载体系统的穿梭载体结构图。以 穿梭载体的多克隆位点中XhoI和SpeI为插入位点，插入DNA表达模版；修饰 的CMV启动子驱动小干扰RNA表达，由修饰的SV40 polyA signal作为终止子。
图2是免疫荧光染色检测感染Adv-shEGFR 3天(d3)和6天(d6)后细胞 EGFR表达变化，其中，control:未处理组，AShEGFR:感染Adv-shEGFR组。
图3是免疫印迹检测感染Adv-shEGFR 3天(d3)和6天(d6)后，细胞中 EGFR蛋白水平的抑制，其中，A: A549细胞，B: SPC-A1细胞，control:未处理组，AShNEG:感染 Adv-shNEG组，AShEGFR:感染Adv-shEGFR组。
图4是免疫组织化学法检测A549细胞肿瘤组织中EGFR、 PCNA表达， 其中，A: EGFR， B: PCNA， control:注射3W蔗糖/PBS对照组，AShNEG:注 射Adv-shNEG组，AShEGFR:注射Adv-shEGFR组。
图5是免疫组织化学法检测SPC-A1细胞肿瘤组织中EGFR、 PCNA表达， 其中，A: EGFR， B: PCNA, control:注射3M庶糖/PBS对照组，AShNEG:注 射Adv-shNEG组，AShEGFR:注射Adv-shEGFR组。
图6是免疫印迹检测肿瘤组织中EGFR表达，其中，AShNEG:注射Adv-shNEG组，AShEGFR:注射Adv-shEGFR组。
图7是裸鼠皮下移植瘤内注射重组腺病毒，测量肿瘤体积，其中，AShNEG:注射Adv-shNEG组，AShEGFR:注射Adv-shEGFR组。
具体实施方式
实施例1耙向EGFR的小干扰RNA穿梭载体的构建和鉴定 设计及合成小干扰RNA DNA表达模板5' -TCGAGGGAGCTGCCCATGAGAAATTTCAAGAGAATTTCTCATGGGCAGCTCCTT A-3' 3， -CCCTCGACGGGTACTCTTTMAGTTCTCTT磁GAGTACCCGTCGAGGAA TGATC-5' 上述寡核苷酸退火形成双链结构，建立退火反应体系如下 正义链 2 ul反义链 2 Ul1XDNA拟和液 46 ul95'C孵育5分钟，72'C孵育10分钟，缓慢降至37t:孵育l小时； 取上步退火溶液5ul加入45 Ul去离子水，终浓度8 ng/ul; 表达模板与穿梭载体连接反应pShEGFR反应体系 加入量 去离子水 11.25 ulEGFR表达模板 1.25 ul10XT4 DNA缓冲液 1.5 u 1穿梭载体 0.5 ulT4 DNA连接酶(5U/u 1) 0. 5 w 1 22t:孵育过夜；65'C变性10分钟；穿梭载体的转化A、 感受态细菌(JM109)放置于冰水浴，使之解冻；B、 取50 ul JM109，加3 ul连接液搅匀后冰育30分钟；C、 42°C 90秒，冰水中冷却5分钟，使质粒导入细菌；D、 预温SOC培养基400 u 1加入上述离心管中，250rpm 37'C振摇菌液2小时；E、 1000rpm离心5分钟，弃去上清，取上述转化菌菌液50 n l涂布于含 100 ug/ml氨苄青霉素的LB平板上，37。C过夜；F、 根据形成细菌克隆的数量初步判定连接反应是否成功； 穿梭载体的测序鉴定挑取阳性克隆，接种于含100ug/ml氨苄青霉素的10mlLB培养液中，37'C振 荡培养过夜。次日取lml菌液，采用下列测序引物进行测序鉴定-上游弓l物5'-ggatttccaagtctccac-3' 下游弓l物5'-agcaccttccagatctgc-3' 公i干扰RNA穿梭载体c使用QIAGEN公司质粒抽提试剂盒大量提取穿梭载体，得到靶向EGFR的小实施例2腺病毒的重组及鉴定 穿梭载体和骨架载体的线性化反应体系穿梭载体Pac IIOX缓冲液 IOX牛血清白蛋白 去离子水 37'C水浴1. 5小时； 反应体系 Lac Z骨架载体 Pac IIOX缓冲液 IOX牛血清白蛋白去离子水 37'C水浴1.5小时； 采用磷酸钙法将线性化的穿梭载体和骨架载体共转染至293细胞中，并发 生同源重组，得到靶向EGFR的小干扰RNA重组腺病毒。 重组腺病毒的扩增A、 10ml 1(^胎牛血清/DMEM培养5X 106 293细胞；B、 取0.5iU病毒保存液，加入l(^胎牛血清/DMEM至lml，混匀；C、 移去步骤a的培养液，小心加入病毒混合液，十字形慢慢晃动3次;D、 37°C 596C02孵箱中培养120分钟，加入9ml 1(m胎牛血清/DMEM;加入量U1) 1.0 2. 0 5.0 5.0补足体积至50.0 ul加入量(ul) 8.0 2.0 2.0 2.0补足体积至20.0 ulE、 再培养72小时，收集细胞，600g离心5分钟沉淀细胞；F、 病毒保存溶液重悬细胞，-2(TC和37'C冻融3次；G、 台式离心机上以最大速率离心20分钟去除细胞碎片，收集上清；H、 反复扩增至需要病毒量。 重组腺病毒的纯化A、 收集细胞，4'C， 12500g离心30分钟；B、 弃上清，沉淀充分重悬于5mlCsCl (1.1 g/ml);C、 4°C， 8000g离心5分钟，取上清；D、 在超速离心管中缓慢加入2mlCsCl (1.4g/ml)， 3mlCsCl (1.3g/ml);E、 4°C， 60000g离心12h，吸出病毒带；F、 10mM Tris pH8. O稀释备用。 50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度A、 收集一瓶293细胞，计数；用2M胎牛血清/DMEM准备20ml、 1。7ml细胞；B、 在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液；C、 准备稀释病毒液第1管中加入0.9ml2M胎牛血清/DMEM,其余加入 1.8ml;第l管中再加入O. lml病毒保存液，上下吸打5次混匀；换用新吸头， 从第1管中吸取0.2ml加入第2管中，反复稀释至最高稀释度；用同一管病毒 保存液进行第2轮稀释；最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释 度10孔，2孔为阴性对照，37t:培养10天；10天后倒置显微镜下观察，计算 每一排中出现细胞病变效应(CPE)的孔数；D、 Karbers公式计算病毒滴度(T=101+d(s—Q'5)—a7pfU/ml， c^稀释倍数的 对数；S4日性率之和)。重组腺病毒的鉴定采用Qiagen基因组DNA抽提试剂盒提取重组腺病毒DNA， PCR反应鉴定。A、 PCR反应引物上游弓l物5'-ggatttccaagtctccac-3' 下游弓l物5'-agcaccttccagatctgc-3'B、 PCR反应体系c、Adv-shEGFR 上游引物(20pm/"l) 下游引物(20pm/y 1) IOX缓冲液10mM dNTPTaq DNA聚合酶(5U/u 1) 去离子水 PCR反应条件95°C， 3分钟 95°C， 40秒 58°C， 40秒 72。C， 60秒 72°C， 30秒2. 0 1 0. 5 u 1 0. 5 u 1 2.0 u 1 0. 5 ul 0.5 ul 补足体积至20l个循环35个循环 l个循环实施例3重组腺病毒感染效率的测定1. 细胞准备以5X10V孔的密度将人肺腺癌细胞A549接种至6孔板，次 日汇合率达50%左右；2. 使用感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别为10、 20、 30、 50、 100的重组腺病毒(使用含2%胎牛血清的培养基稀释)和细胞共培养；3. 37°C、 5% C02细胞培养箱中培养4-8小时，去上清，加入常规培养基继 续培养48-72小时；4. 去除培养基，PBS漂洗；5. 去除PBS， 0.25%戊二醛室温固定15分钟；6. 去固定液，PBS漂洗3X5分钟；7. 使用e -半乳糖苷酶原位染色试剂盒进行X-gal染色。 a.染色工作液配制e -半乳糖苷酶染色液A 10. 0 u 1 e-半乳糖苷酶染色液B 10.0 ul e-半乳糖苷酶染色液C 930.0 ulX-gal 50.0 ulb.将上述工作液lml加入上述固定好的细胞中，37'C孵育20分钟甚至 更长时间，直至部分细胞颜色变蓝，孵育时间不超过24小时。使用腺病毒通过不同MOI值感染细胞，X-gal染色后发现感染A549、 SPC-Al， MOI值分别为IO， 30时，约90%以上细胞呈蓝色，而随着MOI值的 增加，细胞蓝染数无明显增加，细胞死亡数增加。实施例4重组腺病毒阻断EGFR基因表达效率分析重组腺病毒体外转染人肺腺癌细胞A549和SPC-Al，分别在转染3天、6天 进行EGFR mRNA、蛋白水平的检测。Adv-shEGFR体外感染肺腺癌细胞A549和SPC-Al。定量PCR检测EGFR基因 mRNA表达变化感染Adv-shEGFR 3天后，对A549, SPC-Al细胞中EGFR mRNA 水平的抑制率分别达81. 2%和79. 8%。免疫荧光染色检测感染Adv-shEGFR前后细 胞EGFR表达变化(图2)。免疫印迹检测，感染Adv-shEGFR 3天和6天后，与 感染Adv-shNEG组相比，A549细胞EGFR蛋白水平抑制率分别为52. 3%和80. 2%， SPC-A1细胞EGFR蛋白水平抑制率分别为45. 5%和85. 8% (图3)。实施例5体内实验验证靶向EGFR的小干扰RNA重组腺病毒的抗肿瘤活性 收集对数生长期细胞A549, SPC-Al细胞，PBS调整细胞浓度至1 X 107ml。 消毒裸小鼠右下肢皮肤，细胞悬液200iU注射入右下肢皮下。待成瘤鼠局部瘤 体生长至5mm时，隔日于瘤体内多点注射重组腺病毒10 fu/瘤体(病毒使用 3M蔗糖/PBS稀释)。隔日测量肿瘤的最长径(a)和最短径(b)，按公式求出肿 瘤体积V-ab2/2。根据公式计算抑瘤率=U-实验组肿瘤平均体积/对照组肿瘤 体积)X100%。实验结束后，处死小鼠，取出肿瘤组织，部分组织中性甲醛固定， 石蜡包埋，制备切片，免疫组织化学法检测A549肿瘤组织(图4)和SPC-Al肿 瘤组织(图5)中EGFR、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表达；部分组织以免疫印迹检测肿瘤组织中EGFR表达。免疫印迹测定A549、 SPC-A1肿瘤组织EGFR蛋白表达的抑制率分别为51. 5% 和44. 8% (图6)。测量肿瘤体积，计算肿瘤抑制率分别达62. 8%和52. 4% (图7)。
权利要求
1. 靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒，其特征是在腺病毒载体中，插入了靶向表皮生长因子受体的下述小干扰RNA表达模板5’-TCGAGGGAGCTGCCCATGAGAAATTTCAAGAGAATTTCTCATGGGCAGCTCCTT A-3’3’CCCTCGACGGGTACTCTTTAAAGTTCTCTTAAAGAGTACCCGTCGAGGAA TGATC-5’。
2、 根据权利要求1所述的靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒，其特征是所述的腺病毒载体是pSilencer adeno 1. 0-CMV腺病毒载体系统。
3、 根据权利要求1所述的靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒的制 备方法，其特征是包括下述步骤1) 构建和鉴定靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA穿梭载体， 包括设计及合成小干扰RNA DNA表达模板5' -TCGAGGGAGCTGCCCATGAGAAATTTCAAGAGAATTTCTCATGGGCAGCTCCTT A-3' 3， -CCCTCGACGGGTACTCTTTMAGTTCTCTTAAAGAGTACCCGTCGAGGAA TGATC-5' 所述寡核苷酸退火形成双链结构； 表达模板与穿梭载体连接；穿梭载体转化，测序鉴定，提取穿梭载体，得靶向表皮生长因子受体的小干 扰RNA穿梭载体；2) 重组及鉴定腺病毒包括穿梭载体和骨架载体线性化；釆用磷酸钙法将线性化的穿梭载体和骨 架载体共转染293细胞，发生同源重组，得靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA 重组腺病毒。
4、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征是所述的步骤1的测序鉴定引物为上游弓l物5'-ggatttccaagtctccac-3' 下游弓l物5'-agcaccttccagatctgc-3'。
5、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征是所述的步骤1的靶向表皮生长因 子受体的小干扰RNA穿梭载体，其中，修饰的CMV启动子驱动小干扰RNA表达， 由修饰的SV40 polyA signal作为终止子。2
6、权利要求1的靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒在制备抑制肿 瘤生长药物中的用途。
全文摘要
本发明属生物技术领域，具体涉及靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒及其在抑制人肺腺癌细胞体内生长中的作用。本发明使用腺病毒载体系统构建shuttle vector-穿梭载体和backbone vector-骨架载体在包装细胞293细胞中发生同源重组，得到预期的复制缺陷型重组腺病毒。本发明针对肺癌治疗和基因调节技术的难点，构建小干扰RNA病毒表达载体，不仅可提高小干扰RNA导入效率，还可延长RNA干扰效应的时间。通过动物体内实验验证了小干扰RNA重组腺病毒能产生RNA干扰效应，下调EGFR表达，抑制肿瘤生长。
文档编号C12N15/861GK101225403SQ20071003658
公开日2008年7月23日 申请日期2007年1月17日 优先权日2007年1月17日
发明者新 张, 莉 白, 白春学, 蓉 祝 申请人:复旦大学附属中山医院