专利名称：新生猪胰岛细胞分离、纯化和培养方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞生物学技术领域，特别是指一种新生猪胰岛细胞分离、纯化和培养方法。
背景技术：
糖尿病是由某种原因引起的胰岛功能减退或衰竭胰岛素分泌减少或缺乏，引起机体糖代谢紊乱及其后期全身血管病变，产生多器官损害，严重威胁患者生命，内科药物治疗不能避免其产生严重的并发症。全球糖尿病患者目前已超过2亿，预计2020年将高达3.5亿，糖尿病从2004年起成为中国的第一大常见病，现有患者500余万。其中I型糖尿病患者终生需要依赖胰岛素治疗，给患者生活带来极大的不便，大约10％的糖尿病患者为I型糖尿病。约30％的II型糖尿病患者至中、晚期(病程20年以上)也会发展成为胰岛素依赖型。这两种病人都需要进行胰岛细胞移植手术治疗，因此，可以说中国共约有2000万糖尿病人需要做移植手术。
虽然胰岛细胞移植技术的近期发展已经可以使4/5接受了移植的I型糖尿病患者不再需要每天注射胰岛素，但问题的关键却转移到如何才能找到足够的胰岛细胞供体。
为了解决供体问题，国际上早就开始了异种胰岛移植的研究，这种移植可以彻底解决供体不足的矛盾，特别是猪胰岛素，具有与人胰岛素相同的生理功能，结构上仅一个氨基酸的差别。相对人与人之间的移植，用猪胰岛救人的手术更简便、快捷、微创、安全，不受血型限制。猪胰岛作为异种胰岛组织供体来源日益受到重视，实验研究已证明，猪胰岛不仅能逆转糖尿病动物的高血糖状态，而且能防止糖尿病慢性并发症的发生与发展。目前猪胰岛移植的临床应用研究已成为移植界的一个研究热点，但由于成年猪胰岛的分离纯化比较复杂，比其他动物困难，至今未能确立能够稳定地获得大量胰岛细胞的分离方法。
相对来说，新生猪或胎儿猪来源广、价格低，，其胰岛的分离纯化更简易，更适用于作为异种胰岛细胞移植手术的供体。特别是胎猪和新生猪胰岛细胞经短期体外培养以后，抗原性很弱，是胰岛移植最有前途的供体来源。其意义不仅可解决供体短缺的问题，Mandel等[Mandel TE，Watt PC，Mullen Y，et al.Islet grafts in NOD micea comparison of aso，allo，and pig Xenotransplantation.Transplant Proc，1989，213813-3817.]认为在I型糖尿病中移植猪胰岛细胞可能将避免移植人胰岛而招致的自身免疫攻击。
由于猪的胰岛细胞分化和发育成熟需到胚胎后期，甚至出生数月后才得以完成[Korsgen O，Sandler S，Landatron AS，et al.Large-caleproduction of fetal porcine pancreatic islet-like cell clusters[J].Transplant，1988，45509-511.]，故不宜采用常规胶原酶消化分离小白鼠胰岛的方法来获得新生猪胰岛。且消化后组织块较大，组织块中央易产生中心性坏死。
胰岛细胞的获得，以往采用密度梯度分离法，该法虽可得到高纯度胰岛细胞，但胰岛收获量仅约30％[于德民，吴锐，尹潍，等成年猪胰岛分离和纯化的实验研究[J].中华器官器植杂志，1995，16146-1481]，临床上难以达到数量上的要求。为此，我们采用一种改良的胶原灌注-不连续密度梯度纯化法及培养的技术成功地分离了纯化的新生猪胰岛细胞团，在数量上和纯度上都达到了临床要求，可供胰岛细胞分化与发育以及异种移植治疗糖尿病研究之用。
成年猪胰岛细胞分化成熟，移植量效比高，但分离胰岛产量低。胚胎猪胰岛细胞分化不成熟，移植量效比低。而新生猪胰岛细胞能通过体外短期培养分化发育成熟，发挥其生理功能[Rayat GR，Rajotte RV，KorbuttGS.Potential application of neonatal porcine islets as treatmentfor type 1 diabetes[J].Ann NY Acad Sci 1999，875175-1881]。
由于新生猪胰岛细胞大部分是散在的，不成胰岛，因而很难分离胰岛，只能在培养过程中加以纯化；即抑制成纤维细胞生长，将退变的外分泌腺泡细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞和树突状细胞通过更换培养液去除掉，而保留上皮样细胞[张伟杰，姜汉英，陈金枝，等.猪胰岛移植物的大量制备[J].中华器官移植杂志，1993，14151-153.]。
国外有采用1周龄新生猪，我们认为，新生猪日龄不可超过1周，宜出生后3～5天内者为最佳，日龄越长，则会影响胶原酶消化及胰岛产量[刘纪宁，祝希媛，吴立，等1新生猪胰岛细胞团的生成和异种移植[J].中华器官移植杂志，1992，13124-1261]。本发明所采用猪来源，皆为中国原产猪，价格便宜，供体数量不受限制，非常便于产业化。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新生猪胰岛细胞的分离、纯化和培养方法，它可以获得形态结构和分泌功能正常的胰岛细胞团，符合临床应用所需的数量和纯度的胰岛细胞。
为了解决上述技术问题，本发明新生猪胰岛细胞的分离、纯化和培养方法，依次包括如下步骤1)分离猪胰岛细胞，从生长2～5天的新生猪体内无菌剖腹取出胰腺，去除胰腺周边组织，注入消化液，其消化温度是37～39℃，消化液PH值是6.0～8.0，加入含有效量小牛血清的冷Hank’s液终止消化；2)纯化步骤1)得到的猪胰岛细胞，配置比重液，于0.5～1.0ml的消化清液中，加入0.3～1.0ml的含有效量小牛血清的冷Hank’s液，再依次取10～15ml的比重液注入，摇荡混匀，静置3～5min，低速离心沉淀细胞；3)将步骤2)得到的猪胰岛细胞加培养基进行7～10天的细胞培养；4)形成猪胰岛细胞团。
本发明使用新生猪，相对成年猪来说，新生猪或胎儿猪胰岛的分离纯化更简易，更适用于作为异种胰岛细胞移植手术的供体。特别是本发明的新生猪胰岛细胞经短期体外培养以后，抗原性很弱，成为胰岛移植最有前途的供体来源，可解决供体短缺的问题。本发明越过了成年猪胰岛技术障碍，解决了胰岛移植的供体严重匮乏问题，使得猪供体产业化成为可能，进而为异种胰岛细胞移植治疗技术的全面推广，造福广大糖尿病患者打下雄厚的基础。
本发明采用了一种改良的胶原灌注-不连续密度梯度纯化法及组织培养的技术，成功地分离纯化了新生猪胰岛细胞团，解决了收获量不足的问题，而在体外培养获得了大量胰岛细胞株。在体外培养条件下，树突细胞、内皮细胞、淋巴细胞和其他血液细胞由于不附壁生长，悬浮在培养液中，通过更换培养液很容易去除了这些细胞，并使纯化后胰岛细胞抗原性变弱，使之更适宜于异种胰岛细胞移植手术。
本发明在数量上和纯度上都达到了异种胰岛细胞移植临床要求，并可供胰岛细胞分化与发育以及异种移植治疗糖尿病的研究之用。
下面结合附图与具体实施方式
对本发明做进一步详细的说明附图是新生猪胰岛细胞的分离、纯化和培养方法流程图。
具体实施例方式
实验例猪胰岛细胞的制备方法包括分离、纯化和培养等过程。
分离出生2～5天的新生猪用氯胺酮(17mg/kg)麻醉后，于无菌状态下剖腹取出胰腺，用含抗生素的D-Hank’s液清洗3次去除血液，并迅速仔细去除胰腺周边脂肪、血管和胰腺被膜，用冷的Euro～collins液冲洗3次后，称重。将22号塑料插管插入主胰导管，置入锥形瓶中。根据称重配成一定比例体积的胶原酶溶液(浓度为1.8mg/m L)，通过导管倒入胰腺组织内，置于37～39℃恒温水浴中轻轻振荡消化20～30min，使消化液pH值保持在6.0～8.0之间。当胰腺组织直观上变松散时，加入含有效量小牛血清的冷Hank’s液终止消化，轻轻振荡15s，用600μm的滤网回收组织。过滤出的残余组织继续消化，重复4～5次，至组织块完全消化，仅剩下少量白色条索状纤维组织，取清液移入50ml离心管中准备离心分离。
纯化先将Euro～collins液及Fico II 1400配制成比重为1.090、1.074、1.054g/cm3的比重液。移取约0.5～1ml的消化清液至50ml离心管中，加入0.3～1ml的含有小牛血清的冷Hank’s液，再依次取10～15ml的比重液注入，摇荡混匀，静置3～5min，在4℃下，低速(800r/min)离心20min，离心后收集1.090～1.054g/cm3之间的胰岛沉淀细胞待培养。
培养将分离得到的细胞加入含20％小牛血清、青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，谷氨酰胺100mg/L增补的RPMI1640液培养。一般一个新生猪胰腺消化后的细胞分在5～7个T75瓶中，而每个培养瓶中培养基含量不少于10～18ml。置于5％CO2、95％空气、37℃细胞培养箱内培养；次日更换培养基，以后隔日换一次培养基，去除残留的树突样细胞、血管内皮细胞和过路淋巴细胞。
由于胰岛细胞24～36h，成纤维细胞16～18h均已贴壁，选择次日更换培养基可以去除绝大部分成纤维细胞，48h后待上皮样细胞紧密贴壁后，换液时用D-Hank’s液轻轻冲洗即可完全去除血细胞。培养7d后，即可获得纯度达90％的胰岛细胞。
第7天收集胰岛细胞在倒置显微镜下观察细胞形态，倒置显微镜下，胰岛细胞呈橘黄色半透明类圆形细胞，胞浆丰富，边缘清晰，有的细胞团边缘有一紫色弧形反光带。细胞团大都松散贴壁，少数悬浮于培养基中，部分细胞团周围有少量纤维细胞爬行。
培养4～5天细胞生长活动最旺盛，以后2～3天则未见更多细胞团生长，培养7天后培养基中已很难见到抗原性强、与排斥反应有密切关系的淋巴细胞、树突状细胞或血管内皮细胞。随培养时间的延长培养液中胰岛素含量呈逐渐下降趋势，但培养7天后的胰岛细胞团对高糖和高糖+茶碱刺激却表现出明显的分泌反应，其原因可能为随培养的时间延长，胰岛细胞死亡裂解减少，释放胰岛素减少而新生胰岛细胞分泌尚不旺盛，但新生猪胰岛细胞对糖刺激的分泌反应说明了B细胞能短时期分化、发育成熟并发挥生理功能。
每次处理4只新生猪胰腺，每只新生猪胰岛细胞团收获量是6～8×105个，纯度是90％。
本发明作为供体的新生猪来源广、价格低，且采用改良的胶原灌注-不连续密度梯度纯化法和组织培养方法，可以获得形态结构和分泌功能正常的胰岛细胞团，符合临床应用所需的数量和纯度的胰岛细胞。可为异种移植治疗糖尿病提供一个方便的供体来源，胰岛细胞还可供胰岛细胞分化与发育以及异种移植治疗糖尿病研究之用。
本发明可以获得高纯度的胰岛，且不容易破坏猪胰岛。在体外培养条件下，树突细胞、内皮细胞、淋巴细胞和其他血液细胞由于不附壁生长，悬浮在培养液中，通过更换培养液很容易去除这些细胞，并使纯化后胰岛细胞抗原性变弱，更适宜于异种胰岛细胞移植手术。
权利要求
1.一种新生猪胰岛细胞分离、纯化和培养方法，依次包括如下步骤1)分离猪胰岛细胞，从生长2～5天的新生猪体内无菌剖腹取出胰腺，去除胰腺周边组织，注入消化液，其消化温度是37～39℃，消化液PH值是6.0～8.0，加入含有效量小牛血清的冷Hank’s液终止消化；2)纯化步骤1)得到的猪胰岛细胞，配置比重液，于0.5～1.0ml的消化清液中，加入0.3～1.0ml的含有效量小牛血清的冷Hank’s液，再依次取10～15ml的比重液注入，摇荡混匀，静置3～5min，低速离心沉淀细胞；3)将步骤2)得到的猪胰岛细胞加培养基进行7～10天的细胞培养；4)形成猪胰岛细胞团。
2.如权利要求1所述的新生猪胰岛细胞分离、纯化和培养方法，其特征在于在步骤2)中，所述的比重液是比重在1.090～1.054g/cm3之间的Euro～collins及Fico II1400。
3.如权利要求1所述的新生猪胰岛细胞分离、纯化和培养方法，其特征在于在步骤3)中，所述的培养基是含20％小牛血清、青霉素100U/ml，链霉素100u/ml，谷氨酰胺100mg/l增补的RMI1640液。
4.如权利要求1所述的新生猪胰岛细胞分离、纯化和培养方法，其特征在于在步骤3)中，一个新生猪胰腺组织分别置入5～7个培养瓶中进行培养。
5.如权利要求1所述的新生猪胰岛细胞分离、纯化和培养方法，其特征在于在步骤3)中，隔日换培养基。
全文摘要
本发明公开了一种新生猪胰岛细胞分离、纯化和培养方法，其方法是从生长2～5天的新生猪供体中无菌剖腹取出胰腺，去除胰腺周边组织，注入消化液，其消化温度是37～39℃，消化pH值是6.0～8.0，其终止消化溶液包括小牛血清和Hank’s液；接着进行猪胰岛细胞的纯化和7～10天的细胞培养。通过本发明可获得供胰岛细胞分化与发育以及异种移植治疗糖尿病研究的猪胰岛供体，可达到通过异种胰岛细胞移植治疗糖尿病的目的，并为猪胰岛供体的产业化及异种胰岛细胞移植治疗技术的推广打下了基础。
文档编号C12N5/06GK101033460SQ200710036638
公开日2007年9月12日 申请日期2007年1月19日 优先权日2007年1月19日
发明者牛申 申请人:牛申