专利名称：浊点系统中微生物转化合成l-苯基乙酰基甲醇的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的合成方法，具体是一种浊点系统中 微生物转化合成L-苯基乙酰基甲醇的方法。
背景技术：
麻黄素是一种常用的药物。获得麻黄素原料的方法通常有从天然麻黄草中提 取、化学合成和生物合成等途径。由于天然资源麻黄草生长受地理位置、季节等 影响，尤其麻黄草为沙漠植物，过度采集对沙漠地区的生态环境造成严重影响。 天然资源己经十分匮乏。因麻黄素分子存在两个手性中心，化学合成方法也不经 济。利用面包酵母的脱羧酶对丙酮酸的脱羧反应和苯甲醛结合合成手性苯基乙酰 基甲醇。该手性中间体苯基乙酰基甲醇进一步经化学合成得到麻黄素是一条在国 外己经工业化生产的合成路线。利用面包酵母的脱羧酶对丙酮酸的脱羧反应和苯 甲醛结合合成手性苯基乙酰基甲醇反应的特点是1)必须利用活细胞作为生物 催化剂利用活细胞的代谢产物丙酮酸。2)利用全细胞作为生物催化剂，副反应
多，虽相对苯甲醛的产物收率只有60%左右，但原料价格低、工艺简单。3)这 类反应都是以非极性或弱极性的有机化合物作为底物/产物。高浓度的底物/产物 将抑制甚至毒害微生物的生长和活性。这导致常规的水溶液系统中生物转化过程 的产物浓度很低而使其缺乏工业化价值。故高产物浓度是该反应工业化追求的主 要目标参数。
为了提高催化反应的效率，介质工程已成为研究的新热点。其中水一有机溶 剂两相分配系统被视为一种有效的手段，但生物催化剂在有机溶剂中，尤其是具 有中等极性的有机溶剂中，生物相容性差。这导致具有中等极性的底物/产物的 生物转化不能实现萃取生物转化。常规水溶液中的生物转化因底物/产物的生物 毒性而只能在低浓度下进行，导致在国内外的微生物转化文献中除采用复杂的过 程控制技术外很少有产物超过10g/L的报道。这成为其工业化应用的限制因素。
经对现有技术文献的检索发现，Zhilong Wang， "The potential of cloud point system as a novel two-phase partitioning system for biotransformation. Applied microbiology and biotechnology. ，， 2007， 75: 卜10.(王志龙."浊度系统作为新的两相分配系统应用于生物转化的潜力". 《应用微生物与生物技术》，2007， 75: 1-10)中介绍，在水-有机溶剂两相分 配系统的萃取生物转化过程中萃取极性产物和维持细胞的活性往往难以同时实 现。在进一步的检索中，还没有发现与本发明关于采用浊度系统以实现萃取极性 产物的微生物转化而获得高产物浓度的方法应用于微生物转化合成L-苯基乙酰 基甲醇的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有工业生产技术的不足，提供一种浊点系统中微生 物转化合成L-苯基乙酰基甲醇的方法。本发明利用浊点系统两相分配技术，实 行在高底物/产物浓度下，利用活细胞作为生物催化剂的生物转化过程，以获得 高产物浓度的具有手性结构的重要医药中间体L-苯基乙酰基甲醇。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤
第一步，在常规培养基中利用微生物发酵获得具有生物活性的微生物细胞作 为微生物转化的生物催化剂；
所述第一步中，培养基组成为100ml水中含2g蛋白胨、2g酵母粉、2g葡 萄糖。
第二步，利用第一步得到的微生物细胞构建浊点系统，并设置浊点系统中微 生物转化的操作参数，包括乙醛、底物苯甲醛、微生物细胞和葡萄糖的量以及 pH值，然后在设置的操作条件下实现浊点系统中的微生物转化，得到L-苯基乙 酰基甲醇；
所述浊点系统，是非离子表面活性剂Triton X-114和Triton X_45按照体 积比l: 0.1-0. 4混合。然后混合表面活性剂与水溶液混合成浊点系统，其中混 合表面活性剂所占的体积分率为10-14%。
所述浊点系统，也可以是表面活性剂Triton X-100与聚乙二醇(PEG)混合 后与100ml水溶液形成浊点系统，其中表面活性剂与聚乙二醇所占的体积分率为 10-20%。 所述水溶液，其100ml中含有蛋白胨2g、酵母粉2g、乙醛0.4-lml、由 第一步所得到的微生物细胞2-llg、底物苯甲醛0.3-1.2ml、葡萄糖1.2-6g， pH 控制在4-6之间。
所述微生物转化，其时间为6-24小时。
在第二步的微生物转化进行到6-8小时时，通过添加底物苯甲醛(其浓度在 0.2-0. 6%)和葡萄糖(其浓度为2-6g/100ml)可实现微生物转化的半连续批式反 应。微生物转化反应继续进行6-8小时后，重复上述过程3-5次，直到获得高产 物浓度的生物转化液。
本发明利用活细胞的代谢功能将葡萄糖转化为丙酮酸。在活细胞中存在丙酮 酸脱羧酶实现丙酮酸脱羧反应而产生活性乙醛。活性乙醛和在转化液添加的底物 苯甲醛縮合而合成具有手续结构的产物L-苯基乙酰基甲醇。
与现有技术相比，本发明采用浊点系统技术，通过考察浊点系统中乙醛、pH、 底物、细胞和葡萄糖浓度等因素对生物转化过程中产物浓度的影响，优化了浊点 系统中生物转化的条件，通过不断地添加底物和葡萄糖，实现了在高底物/产物 浓度下长时间的活细胞生物催化，实现了高产物浓度(转化液中L-苯基乙酰基 甲醇浓度〉10g/L)的生物转化，其工艺具有工业化应用价值。采用经济实用的技 术实现浊点系统中产品的分离将进一步推进其工业化应用的进程。
图1为本发明方法原理图
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限 于下述的实施例。
如图1所示，下列实施例微生物转化合成L-苯基乙酰基甲醇的原理是利
用活细胞的代谢功能将葡萄糖转化为丙酮酸。在活细胞中存在丙酮酸脱羧酶实现 丙酮酸脱羧反应而产生活性乙醛。活性乙醛和在转化液添加的底物苯甲醛縮合而
合成具有手续结构的产物L-苯基乙酰基甲醇。 下列实施例的具体条件
微生物培养和细胞收获
面包酵母Saccharomyces cerevisiae B5接种于发酵培养基，培养基组成为 100ml水中含2g蛋白胨、2g酵母粉、2g葡萄糖。按50/500ml装量加入摇瓶中， 在30t， 200rpm的摇床中培养1天，4000rpm条件下离心后收集细胞。该新鲜 湿细胞作为生物催化剂用于微生物转化过程。
微生物转化
将混合表面活性剂Triton X-114和Triton X-45按一定比例混合，或混合 表面活性剂Triton X-100与聚合物PEG-20000按一定比例混合。将此混合物按 一定比例与转化培养基混合组成浊点系统，其中转化培养基为100ml水中含2g 蛋白胨、2g酵母粉、lg (NH4) 2S04、 0. lg MgS04和0.005g CaCl2。在浊点系统 中加入一定量的新鲜细胞作为生物催化剂， 一定量的葡萄糖和苯甲醛，并加入一 定量的Na2HP04 12H20和乳酸调节至一定的pH形成反应系统。将上述反应系统 按10/50ml装量加入摇瓶中在30°C， 200rpm的摇床中生物转化一定时间， 4000rpm条件下离心后去除细胞，收集上清液在PHLC上进行产物浓度分析。
下列实施例中未注明具体条件的实施方法，通常按照常规条件或按照制造厂 商所建议的条件。
实施例1
Triton X-100与PEG-20000按1: 1混合，将此混合物与转化培养基按20: 100比例混合，加入细胞3g/100ml，底物苯甲醛0. 8ml/100ml，葡萄糖3g/100ml， 调节pH至6，反应1天。得到产物浓度2. 9g/L。
实施例2
Triton X-100与PEG-20000按1: 1混合，将此混合物与转化培养基按20: 100比例混合，加入细胞3g/100ml，底物苯甲醛0. 8ml/100ml，葡萄糖3g/100ml， 乙醛lml/100ml，调节pH至6，反应1天。得到产物浓度3. 2g/L。
实施例3
Triton X-114与Triton X_45按10: 1混合，将此混合物与转化培养基按 10: 100比例混合，加入细胞3g/100ml，底物苯甲醛0.8ml/100ml，葡萄糖 3g/100ml，乙醛0. 6ml/100ml，调节pH至6，反应1天。得到产物浓度3. lg/L。
实施例4
Triton X-IOO与PEG-20000按1: 1混合，将此混合物与转化培养基按20:
100比例混合，加入细胞3g/100ml，底物苯甲醛0. 8ml/100ml，葡萄糖3g/100ml， 乙醛0.6ml/100ml，调节pH至7.2，反应1天。得到产物浓度1. 2g/L。 实施例5
Triton X-114与Triton X-45按10: 1混合，将此混合物与转化培养基按 10: 100比例混合，加入细胞3g/100ml，底物苯甲醛0.8ml/100ml，葡萄糖 3g/100ml，乙醛0. 6ml/100ml，调节pH至5. 2，反应1天。得到产物浓度4. 2g/L。
实施例6
Triton X-100与PEG-20000按1: 1混合，将此混合物与转化培养基按20: 100比例混合，加入细胞3g/100ml，底物苯甲醛0. 8ml/100ml，葡萄糖3g/100ml， 乙醛0.6ml/100ml，调节pH至4.8，反应1天。得到产物浓度4. 8g/L。
实施例7
Triton X-100与PEG-20000按l: 1混合，将此混合物与转化培养基按20: 100比例混合，加入细胞4g/100ml，底物苯甲醛0. 8ml/100ml，葡萄糖3g/100ml， 乙醛0.6ml/100ml，调节pH至5.8，反应1天。得到产物浓度3. 6g/L。
实施例8
Triton X-114与Triton X-45按10: 1混合，将此混合物与转化培养基按 10: 100比例混合，加入细胞4g/100ml，底物苯甲醛0.7ml/100ml，葡萄糖 3g/100ml，乙醛0. 6ml/100ml，调节pH至4. 8，反应1天。得到产物浓度4. 2g/L。
实施例9
Triton X-100与PEG-20000按1: 1混合，将此混合物与转化培养基按20: 100比例混合，加入细胞4g/100ml，底物苯甲醛0. 9ml/100ml，葡萄糖3g/100ml， 乙醛0.6ml/100ml，调节pH至4.8，反应1天。得到产物浓度5. 8g/L。
实施例10
Triton X-114与Triton X-45按10: 1混合，将此混合物与转化培养基按 10:100比例混合，加入细胞4g/100ml，底物苯甲醛lml/100ml，葡萄糖3g/100ml， 乙醛0.6ml/100ml，调节pH至4.8，反应1天。得到产物浓度5. 2g/L。
实施例11
Triton X-100与PEG-20000按1: 1混合，将此混合物与转化培养基按20: 100比例混合，加入细胞4g/100ml，底物苯甲醛1. 2ml/100ml，葡萄糖3g/馳l，乙醛0.6ml/100ml，调节pH至4. 8，反应1天。得到产物浓度2. 8g/L。 实施例12
Triton X-100与PEG-20000按1: 1混合，将此混合物与转化培养基按20: 100比例混合，加入细胞7g/100ml，底物苯甲醛0. 9ml/100ml，葡萄糖3g/100ml， 乙醛0.6ml/100ml，调节pH至4.8，反应1天。得到产物浓度5. 9g/L。
实施例13
Triton X-114与Triton X-45按10: 1混合，将此混合物与转化培养基按 10: 100比例混合，加入细胞llg/100ml，底物苯甲醛0.9ml/100ml，葡萄糖 3g/100ml，乙醛0.6ml/100ml，调节pH至4.8，反应1天。得到产物浓度6g/L。
实施例14
Triton X-114与Triton X_45按10: 1混合，将此混合物与转化培养基按 10: 100比例混合，加入细胞2.2g/100ml，底物苯甲醛0.9ml/100ml，葡萄糖 3g/訓ml，乙醛0.6ml/100ml，调节pH至4.8，反应1天。得到产物浓度2g/L。
实施例15
Triton X-100与PEG-20000按1: 1.1混合，将此混合物与转化培养基按 20: 100比例混合，加入细胞9g/100ml，底物苯甲醛0.9ml/100ml，葡萄糖 3g/100ml，乙醛0. 6ml/100ml，调节pH至4. 8，反应1天。得到产物浓度6. lg/L。
实施例16
Triton X-100与PEG-20000按1: 1.2混合，将此混合物与转化培养基按 20: 100比例混合，加入细胞lg/100ml，底物苯甲酸0.9ml/100ml，葡萄糖 3g/100ml，乙醛0. 6ml/100ml，调节pH至4. 8，反应1天。得到产物浓度1. 2g/L。
实施例17
在转化培养基中加入细胞3g/100ml，底物苯甲醛0.8ml/100ml，葡萄糖 3g/100ml，乙醛O. 6ml/100ml，调节pH至6，反应1天。得到产物浓度0. 4g/L。 实施例18
在转化培养基中加入细胞3g/100ml，底物苯甲醛0.3ml/100ml，葡萄糖 3g/100ml，乙醛O. 6ml/100ml，调节pH至6，反应1天。得到产物浓度0. 6g/L。 实施例19
在转化培养基中加入细胞3g/100ml，底物苯甲醛0.5ml/100ml，葡萄糖
3g/100ml，乙醛0.6ml/100ml，调节pH至6，反应1天。得到产物浓度2. 6g/L。 实施例20
在转化培养基中加入细胞3g/100ml，底物苯甲醛0.6ml/100ml，葡萄糖 3g/100ml，乙醛0.6ml/100ml，调节pH至6，反应1天。得到产物浓度3g/L。 实施例21
Triton X-100与PEG-20000按1: 1.2混合，将此混合物与转化培养基按 20: 100比例混合，加入细胞7g/100ml，底物苯甲醛0.9ml/100ml，葡萄糖 1. 2g/100ml，乙醛0. 6ml/100ml，调节pH至4. 8，反应1天。得到产物浓度4. 4g/L。
实施例22
Triton X-100与PEG-20000按1: 1.2混合，将此混合物与转化培养基按 20: 100比例混合，加入细胞7g/100ml，底物苯甲醛0.9ml/100ml，葡萄糖 6g/100ml，乙醛0. 6ml/100ml，调节pH至4. 8，反应1天。得到产物浓度5. 6g/L。
实施例23
Triton X-100与PEG-20000按1: 1.2混合，将此混合物与转化培养基按 20: 100比例混合，加入细胞7g/100ml，底物苯甲醛0.9ml/100ml，葡萄糖 4. 8g/100ml，乙醛0. 6ml/100ml，调节pH至4. 8，反应1天。得到产物浓度6. 5g/L。
实施例24
Triton X-100与PEG-20000按1: 1.2混合，将此混合物与转化培养基按 20: 100比例混合，加入细胞7g/100ml，底物苯甲醛0.9ml/100ml，葡萄糖 4. 8g/100ml，乙醛0. 6ml/100ml，调节pH至4. 8，反应8小时。得到产物浓度 6. 8 g/L。
实施例25
Triton X-100与PEG-20000按1: 1.2混合，将此混合物与转化培养基按 20: 100比例混合，加入细胞7g/100ml，底物苯甲醛0.9ml/100ml，葡萄糖 4. 8g/100ml，乙醛0. 6ml/100ml，调节pH至4. 8，反应8小时。得到产物浓度 6.2g/L。
实施例26
Triton X-100与PEG-20000按1: 1.2混合，将此混合物与转化培养基按 20: 100比例混合，加入细胞7g/100ml，底物苯甲醛0.9ml/100ml，葡萄糖
2.5g/100ml，乙醛0.6ml/100ml，调节pH至4.8，反应6小时。重复利用3次， 每次得到产物浓度不低于3. 2g/L。 实施例27
Triton X-114与Triton X-45按10: 1混合，将此混合物与转化培养基按 10: 100比例混合，加入细胞7g/100ml，底物苯甲醛0.9ml/100ml，葡萄糖 2. 5g/100ml，乙醛0.4ml/100ml，调节pH至4.8，反应6小时。重复利用3次， 每次得到产物浓度不低于3 g/L。
实施例28
Triton X-114与Triton X-45按10: 1混合，将此混合物与转化培养基按 10: 100比例混合，加入细胞7g/100ml，底物苯甲醛0.9ml/100ml，葡萄糖 2.5g/100ml，乙醛0.4ral/100ml，调节pH至4.8，反应6小时。加入底物和葡萄 糖各0. 5 ml和2. 5 g，如此重复3次，得到最终产物浓度10. 5g/L。
实施例29
Triton X-100与PEG-20000按1: 1.2混合，将此混合物与转化培养基按 20: 100比例混合，加入细胞7g/100ml，底物苯甲醛0.9ml/100ml，葡萄糖 2. 5g/100ml，乙醛O. 4ml/100ml，调节pH至4.8，反应6小时。加入底物和葡萄 糖各0. 5 ml和2. 5 g，如此重复3次，得到最终产物浓度10. 3 g/L。
实施例30
Triton X-100与PEG-20000按1: 1.2混合，将此混合物与转化培养基按 20: 100比例混合，加入细胞7g/100ml，底物苯甲醛0.9ml/100ml，葡萄糖 2. 5g/100ml，乙醛0.4ml/100ml，调节pH至4.8，反应6小时。加入底物和葡萄 糖各0.4 ml和2.5 g，如此重复5次，得到最终产物浓度11 g/L。
权利要求
1.一种浊点系统中微生物转化合成L-苯基乙酰基甲醇的方法，其特征在于，包括以下步骤第一步，在培养基中利用微生物发酵获得具有生物活性的微生物细胞作为微生物转化的生物催化剂；第二步，利用第一步得到的微生物细胞构建浊点系统，并设置浊点系统中微生物转化的操作参数，包括乙醛、底物苯甲醛、微生物细胞和葡萄糖的量以及pH值，然后在设置的操作条件下实现浊点系统中的微生物转化，得到L-苯基乙酰基甲醇；所述浊点系统，是非离子表面活性剂Triton X-114和Triton X-45按照体积比1∶0.1-0.4混合，然后与水溶液混合成浊点系统，其中混合表面活性剂所占的体积分率为10-14％；或者是表面活性剂Triton X-100与聚乙二醇混合后与100ml水溶液形成浊点系统，其中表面活性剂与聚乙二醇所占的体积分率为10-20％；所述水溶液，其100ml中含有蛋白胨2g、酵母粉2g、乙醛0.4-1ml、微生物细胞2-11g、苯甲醛0.3-1.2ml、葡萄糖1.2-6g，pH控制在4-6之间。
2. 如权利要求1所述的浊点系统中微生物转化合成L-苯基乙酰基甲醇的方 法，其特征是，所述第一步中，培养基组成为100ml水中含2g蛋白胨、2g酵 母粉、2g葡萄糖。
3. 如权利要求1所述的浊点系统中微生物转化合成L-苯基乙酰基甲醇的方 法，其特征是，所述第二步中，所述微生物转化，其时间为6-24小时。
4. 如权利要求1或3所述的浊点系统中微生物转化合成L-苯基乙酰基甲醇 的方法，其特征是，在第二步的微生物转化进行到6-8小时时，通过添加底物苯 甲醛和葡萄糖实现半连续批式操作，微生物转化反应继续进行6-8小时，重复上 述过程3-5次。
5. 如权利要求4所述的浊点系统中微生物转化合成L-苯基乙酰基甲醇的方 法，其特征是，所述苯甲醛，其添加浓度为0.2-0.6ml/100ml。
6.如权利要求4所述的浊点系统中微生物转化合成L-苯基乙酰基甲醇的方 法，其特征是，所述葡萄糖，其添加浓度为2-6g/100ml。
全文摘要
本发明公开一种生物工程技术领域的浊点系统中微生物转化合成L-苯基乙酰基甲醇的方法。本发明在培养基中利用微生物发酵获得具有生物活性的微生物细胞作为微生物转化的生物催化剂；利用第一步得到的微生物细胞构建浊点系统，并设置浊点系统中微生物转化的操作参数，包括乙醛、底物苯甲醛、微生物细胞和葡萄糖的量以及pH值，然后在设置的操作条件下实现浊点系统中的微生物转化，得到L-苯基乙酰基甲醇；在此条件下添加底物和葡萄糖，通过半连续批示操作使最终产物浓度达到了11g/L。
文档编号C12P7/26GK101168751SQ200710046918
公开日2008年4月30日 申请日期2007年10月11日 优先权日2007年10月11日
发明者张文智, 王志龙, 齐瀚实 申请人:上海交通大学