专利名称：：一种胞外胆固醇氧化酶产生菌的分离方法
技术领域：
：本发明涉及一种胞外胆固醇氧化酶产生菌的分离方法，属于应用微生物
技术领域：
。技术背景胆固醇氧化酶(cholesteroloxidase,COD)能将胆固醇转变为胆甾-4-烯-3-酮，同时产生过氧化氢01202)，&02在过氧化物酶的作用下分解，可使4-氨基-安替比林与苯酚形成亚醌类呈红色的化合物，在500nm处有最大吸收峰，通过测量反应液在500m处的吸光度，可定量测定胆固醇被氧化的量(RichmondW.1973，PreparationandpropertiesofacholesteroloxidasefromNocardiasp.anditsapplicationtotheenzymaticassayoftotalcholesterolinserum.ClinChem19,1350-1356)。近年来，医学研究证明血清高胆固醇与心脏病、动脉粥样硬化、糖尿病、肝胆疾病等人类疾病有关(MacLachlanJ，WotherspoonAT,AnsellRO,BrooksCJ.2000,Cholesteroloxidase:sources,physicalpropertiesandanalyticalapplications.JSteroid.BiochemMolBiol.72:169-195)。临床上方便、准确地检测血液和食品中的胆固醇含量非常重要，对于糖尿病监测和糖尿病并发症的预防、心脑血管疾病诊断与预防等有着极其重要的作用(AihamH,WatanabeK,NakamuraR.1988,DegradationofcholesterolinEggyorkbyi/zoifococciw，z'No.23.JFoodSci53:659-660)。因此，在临床上，胆固醇氧化酶大量用于血浆胆固醇含量的检测。胆固醇氧化酶作为第二代生物杀虫剂，能够有效地杀灭鞘翅目、鳞翅目、直翅目的害虫，具有良好的环境安全性(张锐，郭三堆.植物抗虫基因工程研究进展[J].生物技术通报，2001:8-12)。此外，胆固醇氧化酶在生产低胆固醇含量食品以及制备药物中间体等方面均具有良好的应用前景(AiharaH,WatanabeK,NakamuraR(1988)DegradationofcholesterolinEggyorkby及/zo(iococctAye，'No.23.JFoodSci53:659-660)。但目前能真正能应用到临床上胆固醇含量检测的胆固醇氧化酶的种类单一，价格昂贵，主要原因在于产生胆固醇氧化酶的菌株产酶量低，多为胞内产酶，加大了生产成本。而作为杀虫剂的胆固醇氧化酶也仅仅来源于一种链霉菌。
发明内容本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种胞外胆固醇氧化酶产生菌的分离方法，其特点是从自然环境、肉制品以及肉食动物新鲜粪便中分离高效胞外胆固醇氧化酶产生菌。胞外胆固醇氧化酶产生菌的分离方法包括以下步骤l.采集鱼、鸡、猪、羊、牛肉制品、肉食动物新鲜粪便以及富含胆固醇的自然或人工环境土样或水样，接种在以胆固醇为唯一碳源的液体富集培养基中，于温度30-37'C振荡富集，培养3-4天；取200pl培养液至新鲜的液体分离培养基中按照上述条件，重复3次，消除样品中所含碳源的干扰；2.取上述培养悬液200iJl用无菌水稀释到l(r5、10-6、10-7'、10-8、10"5个浓度梯度，分别涂布于固体分离培养基上，于温度30-37T:培养3-4天，将出现的菌落接种牛肉膏蛋白胨培养基斜面上培养保存；3.将斜面上保存的菌株活化后在3ml发酵培养基中，于温度30-37r振荡培养48h，取发酵液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，静置过夜，取上层萃取液，在硅胶薄板上点样，室温下展开自然干燥后，于254nra的紫外灯下观察，硅胶薄板上出现黑色无荧光斑点者为胆固醇氧化酶催化胆固醇产生的胆甾-4-烯-3-酮，选取黑色无荧光斑点较大的菌株进行下一步筛选；4.选取胆甾-4-烯-3-酮高产菌株进一步液体发酵培养48h，检测其发酵上清液的胆固醇氧化酶酶活性，从而筛选得到能产生胞外胆固醇氧化酶的菌株。为了有效的筛选到胆固醇氧化酶产生菌，本发明首先在富集培养过程中，以胆固醇为唯一碳源，并通过重复将培养液至新鲜的液体分离培养基反复富集培养，消除样品中所含碳源的干扰，达到真正富集到能分解利用胆固醇的微生物的目的；所用的液体富集培养基的配方为胆固醇0.1，NaN030.1，KH2P040.025，MgS04.7H200.025，FeS040.0001，pH7.0，加适量溴麝香草酚兰作为指示剂，在温度115-121°C，湿热灭菌20min。为了使富集培养获得的混合菌株得到纯化，采用稀释涂平板的方法，将富集培养物稀释为10—5、10—6、10-7、、l(T、1(T5个浓度梯度，分别涂布于固体分离培养基上，所述的固体分离培养基配方为酵母粉0.5，胆固醇0.1，吐温-800.1，NaN030.1,KH2P040.025,MgS04-7H200.025,FeS040.0001，琼脂2%，pH7.0，在温度115-121°C，湿热灭菌20min。在胆固醇氧化酶胞外产生菌的筛选过程中，首先采用硅胶薄板层析分析发酵上层萃取液中胆固醇转化为胆甾-4-烯-3-酮的产量，初步筛选到胆固醇氧化酶胞外产生菌，以简化筛选流程。所述的发酵培养基的配方为酵母粉0.5，胆固醇0.1，吐温-800.1，NaNO30.1，KH2P040.025,MgS047H200.025,FeS040.0001,pH7.0，在温度115-121°C，湿热灭菌20min。按照季文明等(比色法测定胆固醇氧化酶酶活.无锡轻工大学学报，2000:251-254)的方法测定胆固醇氧化酶酶活，具体步骤如下3mL溶液A(4-氨基-安替比林1mmol/L;苯酚6mmol/L;叠氮钠0.2g/L;过氧化物酶7000U/L;磷酸钾缓冲液25mraol/L，pH7.5)，150nL溶液B(胆固醇.-8.26mg/mL;TritonX-100:体积分数4.26%;异丙醇为溶剂)，50"酶液，37°C，反应5min，沸水浴3min，于500nm测吸光度。酶活(U/mL):1.6832XA500，酶活定义为在37t:，pH7.5的条件下，lmin内催化l"mol胆固醇氧化为胆甾-4-烯-3-酮所需要的酶。利用本发明提供的筛选方法，筛选获得多株胞外胆固醇氧化酶产生菌来源与产酶情况详见表l所示。因此，本发明提供的筛选方法，具有如下优点1、具有分离效率高、操作简便的特点，2、能为医药和工业用酶提供更广泛的微生物来源，具有重要的应用和价值。具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。实施例l:(l)采集鱼、鸡、猪、羊、牛肉制品，取lg样品接种在以胆固醇为唯一碳源的液体富集培养基中，于温度36。C振荡富集，培养3天；取200pl培养液至新鲜的液体分离培养基中按照上述条件，重复3次，消除样品中所含碳源的干扰；(2)取上述培养悬液200iJl用无菌水稀释到10—5、l(T、10—7'、10—8、1(T5个浓度梯度，取200[jl稀释液分别涂布于固体分离培养基上，于温度30'C培养3天，将出现的菌落接种牛肉膏蛋白胨培养基斜面上培养保存；(3)将斜面上保存的菌株活化后在3ml发酵培养基中，于温度30。C振荡培养48h,取发酵液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，静置过夜，取上层萃取液，在硅胶薄板上点样，室温下展开自然干燥后，于254nm的紫外灯下观察，硅胶薄板上出现黑色无荧光斑点者为胆固醇氧化酶催化胆固醇产生的胆甾-4-烯-3-酮，选取黑色无荧光斑点较大的菌株进行下一步筛选；(4)选取胆留-4-烯-3-酮高产菌株进一步液体发酵培养48h，检测其发酵上清液的胆固醇氧化酶酶活性，从而筛选得到能产生胞外胆固醇氧化酶的菌株。实施例2:(1)采集肉食动物新鲜粪便，取lg样品接种在以胆固醇为唯一碳源的液体富集培养基中，于温度30'C振荡富集，培养4天；取200pl培养液至新鲜的液体分离培养基中按照上述条件，重复3次，消除样品中所含碳源的干扰；(2)取上述培养悬液200iJl用无菌水稀释到10—5、10"、10—7'、10—8、10—95个浓度梯度，分别涂布于固体分离培养基上，于温度3(TC培养3天，将出现的菌落接种牛肉膏蛋白胨培养基斜面上培养保存；(3)将斜面上保存的菌株活化后在3ml发酵培养基中，于温度30'C振荡培养48h，取发酵液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，静置过夜，取上层萃取液，在硅胶薄板上点样，室温下展开自然干燥后，于254nm的紫外灯下观察，硅胶薄板上出现黑色无荧光斑点者为胆固醇氧化酶催化胆固醇产生的胆甾-4-烯-3-酮，选取黑色无荧光斑点较大的菌株进行下一步筛选；(4)选取胆甾-4-烯-3-酮高产菌株进一步液体发酵培养48h，检测其发酵上清液的胆固醇氧化酶酶活性，从而筛选得到能产生胞外胆固醇氧化酶的菌株。实施例3:(1)菌株的富集采集富含胆固醇的自然或人工环境土样，取lg样品于装有5ml液体富集培养基的试管中，在温度37。C下振荡富集，培养3天；取200pl培养液至新鲜的液体分离培养基中按照上述条件，重复3次，消除样品中所含碳源的干扰；观察各试管中培养液的颜色变化，若培养液的颜色由原来为蓝色转变为培养基本色或浅黄色，该试管中的培养液用于进一步实验。(2)菌株的分离纯化取上述培养悬液200iJl用无菌水稀释到l(r5、10—6、10—7'、10—8、10—95个浓度梯度，分别涂布于固体分离培养基上，在温度37'C下培养3天，将出现的菌落接种牛肉膏蛋白胨培养基斜面上培养保存；(3)初筛将斜面上保存的菌株活化后在3ml发酵培养基中，在温度37'C下振荡培养48h，取发酵液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，静置过夜，取上层萃取液，在硅胶薄板上点样，室温下展开自然干燥后，于254nm的紫外灯下观察，硅胶薄板上出现黑色无荧光斑点者为胆固醇氧化酶催化胆固醇产生的胆甾-4-烯-3-酮，选取黑色无荧光斑点较大的菌株进行下一步筛选；(4)复筛选取胆甾-4-烯-3-酮高产菌株进一步液体发酵培养48h，检测其发酵上清液的胆固醇氧化酶酶活性，从而筛选得到能产生胞外胆固醇氧化酶的菌株。实施例4:(1)菌株的富集采集富含胆固醇的自然或人工环境水样，取lml样品于装有5ml液体富集培养基的试管中，在温度37t:下振荡富集，培养3天；取200yl培养液至新鲜的液体分离培养基中按照上述条件，重复3次，消除样品中所含碳源的干扰；观察各试管中培养液的颜色变化，若培养液的颜色由原来为蓝色转变为培养基本色或浅黄色，该试管中的培养液用于进一步实验。(2)菌株的分离纯化取上述培养悬液200pl用无菌水稀释到10—5、l(T、l(T'、10—8、1(T5个浓度梯度，分别涂布于固体分离培养基上，在温度37t:下培养3天，将出现的菌落接种牛肉膏蛋白胨培养基斜面上培养保存；(3)初筛将斜面上保存的菌株活化后在3ml发酵培养基中，在温度37'C下振荡培养48h,取发酵液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，静置过夜，取上层萃取液，在硅胶薄板上点样，室温下展开自然干燥后，于254nm的紫外灯下观察，硅胶薄板上出现黑色无荧光斑点者为胆固醇氧化酶催化胆固醇产生的胆甾-4-烯-3-酮，选取黑色无荧光斑点较大的菌株进行下一步筛选；(4)复筛选取胆甾-4-烯-3-酮高产菌株进一步液体发酵培养犯h，检测其发酵上清液的胆固醇氧化酶酶活性，从而筛选得到能产生胞外胆固醇氧化酶的菌株。采用本发明的分离方法，能够从富含胆固醇的人工或自然环境中，有效地分离到能产生高活性胞外胆固醇氧化酶的各种细菌菌株，从而为医药业、工业、农业提供丰富的胆固醇氧化酶酶源。表l为13株不同来源细菌的胞外胆固醇氧化酶的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1、一种胞外胆固醇氧化酶产生菌株的分离方法，其特征在于，该分离方法包括如下步骤(1)采集鱼、鸡、猪、羊、牛肉制品、肉食动物新鲜粪便以及富含胆固醇的自然或人工环境土样或水样，接种至以胆固醇为唯一碳源的液体富集培养基中，于温度30-37℃，振荡富集，培养3-4天；取200μl培养液至新鲜的液体分离培养基中按照上述条件，重复3次，消除样品中所含碳源的干扰；(2)取上述培养悬液200μl用无菌水稀释到10-5、10-6、10-7、、10-8、10-95个浓度梯度，分别涂布于固体分离培养基上，于温度30-37℃培养3-4天，将出现的菌落接种牛肉膏蛋白胨培养基斜面上培养保存；(3)将斜面上保存的菌株活化后，在3ml发酵培养基中，30-37℃振荡培养48h，取发酵液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，静置过夜，取上层萃取液，在硅胶薄板上点样，室温下展开自然干燥后，于254nm紫外灯下观察，硅胶薄板上出现黑色无荧光斑点者为胆固醇氧化酶催化胆固醇产生的胆甾-4-烯-3-酮，选取黑色无荧光斑点较大的菌株进行下一步筛选；(4)选取胆甾-4-烯-3-酮高产菌株进一步液体发酵培养48h，检测其发酵上清液的胆固醇氧化酶酶活性，从而筛选得到能产生胞外胆固醇氧化酶的菌株。2、根据权利要求l所述的胆固醇氧化酶胞外产生菌的分离方法，其特征在于，所述的液体富集培养基的配方组分为胆固醇0.1，NaN030.1,KH2P040.025，MgS(V7H200.025，FeS040.0001'pH7.0，加适量溴麝香草酚兰作为指示剂，在温度115-12rC，湿热灭菌20min。3、根据权利要求l所述的胆固醇氧化酶胞外产生菌的分离方法，其特征在于，所述的固体分离培养基配方组分为酵母粉0.5，胆固醇0.1，吐温-800.1，NaN030.1,KH2P040.025,MgSCV7H200.025,FeS040.0001,琼脂2%，pH7.0,在温度115-121°C，湿热灭菌20min。4、根据权利要求l所述的胆固醇氧化酶胞外产生菌的分离方法，其特征在于，所述的发酵培养基的配方组分为酵母粉0.5，胆固醇0.1,吐温-800.1，NaN030.1,KH2P040.025，MgS047H200.025,FeS040.0001，pH7.0，在温度115-121°C，湿热灭菌20min。全文摘要一种胞外胆固醇氧化酶产生菌的分离方法，其特点是从自然环境、肉制品以及肉食动物新鲜粪便中分离产生胞外胆固醇氧化酶的菌株。该方法包括以下步骤a.采集土样或水样等样品，接种在以胆固醇为唯一碳源的液体分离培养基中，富集培养；b.利用稀释涂平板的方法，在固体分离培养基上纯化菌落；c.在发酵培养基中发酵培养，用醋酸乙酯萃取发酵液，用硅胶薄板层析分析萃取液中胆甾-4-烯-3-酮的产量，筛选胆甾-4-烯-3-酮产量高的菌株；d.选取胆甾-4-烯-3-酮高产菌株进一步发酵培养，检测其发酵上清液的胆固醇氧化酶酶活性，从而筛选得到能产生胞外胆固醇氧化酶的菌株。文档编号C12N1/20GK101215531SQ20071005102公开日2008年7月9日申请日期2007年12月29日优先权日2007年12月29日发明者维李,葛方兰,陈贵英申请人:四川师范大学