专利名称：罗氏沼虾精子类明胶酶及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及罗氏沼虾精子类明胶酶(sperm gelatinase-like protease, SGP)及其编码基因和应用。
(二) 背景4支术
在受精过程中，精卵结合具有种间特异性的特点。作为质膜融合的其 中一个调节物，精子上的蛋白质在这个过程中起到了重要的作用。在哺乳 动物中，如老鼠， 一种精子蛋白Izumo是促使精卵质膜融合的关键因子。 另一种精子表面蛋白cyritestin，对精子特异性粘附到卵子上起着重要的作 用。在无脊推动物的受精过程中，精子上的蛋白质(蛋白酶)同样具有重 要作用。如鲍鱼，贻贝以及几种螺类，精子蛋白lysin被认为是精子穿透 卵膜的主要因子。但是在隶属于节肢动物的虾类中，具有此类功能的蛋白 或基因至今没有详细的报道。
曱壳类十足目动物的精子是非典型的，以罗氏沼虾(Macra6rac/n'ww ra^w&^//)为例，其精子类似翻转的伞，有一个基部和单一棘突组成。 由于不能运动,精子上的蛋白酶类被认为在精子穿透卵膜的过程中起着更 为重要的作用。
(三)
发明内容
本发明从罗氏沼虾(M myeW^^')的精子粗提物中分离纯化的一种 具有水解明胶作用的蛋白酶，将其命名为精子类明胶酶(SGP)。此酶活 性能够被罗氏沼虾雄性生殖道特异性的Kazal型蛋白酶抑制剂所抑制。通 过对其基因构造的解析，发现SGP的cDNA全长为577 bp，可被翻译成
127个氨基酸组成的蛋白质。这是首例关于罗氏沼虾精子蛋白酶基因的研咒。
本发明的技术方案如下
罗氏沼虫下精子类明胶酶(sperm gelatinase-like protease, SGP )，含有 SEQ NO: 1所示的氨基酸序列。
基于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQNO: l所示氨基酸序列的 多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该 多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95%以上，均属于本 发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、 插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨 基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非 保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。本发明所述多肽的片段、衍生物或 类似物是指基本上保持本发明所述的罗氏沼奸精子类明胶酶的生物学功 能或活性的多肽，可以是下列情形(I)一个或多个氨基酸残基被保守或 非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸 可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(II) 一个或多个氨基酸残基上 的某个基团被其它基团取代；(III)成熟多肽与另一种化合物(比如延长 多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(IV)附加的氨基酸序列融 合进成熟多肽而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多 肽的序列或蛋白原序列)。
SEQ NO : 1所示的氨基酸序列如下
QCFCSSLEVKGCHPFLVSIIDAVKEQCPKKKQ。其中包括107个氨基酸 组成的成熟肽和20个氨基酸组成的信号肽。
优选的，所述罗氏沼虾精子类明胶酶为SEQNO: l所示的氨基^ 列组成的蛋白质。
本发明还涉及编码所述的罗氏沼虾精子类明胶酶的基因。所述编码基 因含有SEQNO: 2所示的核普酸序列。由于核苷酸序列的特殊性，任何 SEQNO: 2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同 源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一 个或多个核苷酸改变的多核苷S吏序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位 变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如 本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多 个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
优选的，所述编码基因为SEQNO: 2所示的核苷S臾序列。 SEQNO : 2所示的核苷酸序列如下 5,誦GGCAGTCGATCAGCAGCTATCAAGGAAGACCCAAACATGAAATT CCTGTTCGCCGGTGGAATCCTCTTGTTTGCCTTGGCAGTGAGCGCCA
GGCTCTCAAAGAACGGGTCGAGGAGGAAAACTGCACCAAATACGT
TCTCGCCGGAGGGGACTGCGAAATTGTCATCAGGATGGAAAAACTG
GAGAACATCCTGAAGGACTTCTTCCAATCCATGACCACGAAGCCTA
AACTGACCGAACTCTTCGACGCTTCGGTATCCTACTTCCTGGGAGG
CCAGTGCTTCTGTTCATCCCTCGAGGTCAAAGGATGCCACCCATTCC
GCAGTGATGATGTTAAATACCTCCTACGAGTTACCGAATGGACACTC
GTTGAGTATGATTGGTTAATGCTGACAAAATTGTTTTCTGAATAAAA
CATGAAACCATAAAAAAAAAAAA-3，。
该cDNA的全长为577 bp，由
36-bp的5'非翻i奪区(5，-UTR), 157-bp的3'非翻i奪区(3'-UTR)和384-bp
的开放阅读框(ORF)组成。该序列已经提交到GenBank上，但尚未公
开。序列号为EF647641。其中384-bp的开放阅读框(ORF)可被翻译
成127个氨基酸组成的前体蛋白质。
本发明还涉及所述的罗氏沼奸精子类明胶酶在水解明胶中的应用。
通过GenBank上的比对，SGP的cDNA序列和氨基酸序列，与已报 道的蛋白质或功能域，均没有相似性。Northern杂交的结果证实，SGP 特异性地在雄性生殖道中，即精巢、输精管和末端壶腹部表达，而在其他 的组织，包括肝脏、卵巢、心脏和肌肉中没有表达。利用gelatin-substrate film分析表明罗氏沼虾的精子具有水解明胶的功能，这种水解作用能够被 kazal型蛋白酶抑制剂(MRPINK)所抑制。而从精子粗提物分离纯化得 到的SGP，在含有gelatin的SDS-PAGE上，显示了明显的水解明胶的作 用，并且也能够被MRPINK所抑制。这种水解明胶的作用在很多哺乳动 物的精子中被认为是顶体酵素(acrosin)的功能。顶体酵素对哺乳动物的 精子穿越卵膜起着至关重要的作用。由此认为在罗氏沼虾中SGP是精子 穿越卵膜的一个重要因子。在受精过程中，精卵质膜的融合具有种间特异 性的特点。因此认为SGP在序列上与其他类似功能的蛋白没有同源性是 合理的。这也可能是使不同物种间产生生殖隔离的其中 一个原因。
通过对不同物种的精子上与受精有关的酶的研究，有助于了解曱壳类 受精作用的机制，以及不同物种间产生生殖隔离的机制。基于这些理论与 技术，使相关研究人员能够建立优良的杂交体系，从而获得高产，快速生
长的杂交物种。
(四)
图1为罗氏沼奸精子粗提物水解明胶活性的电泳图，a为罗氏沼虾精子粗
提物，b为罗氏沼虾精子粗提物与MRPINK反应后的产物；
图2为SGP水解明胶活性的电泳图；a为SGP, b为SGP与MRPINK反
应后的产物。
(五)
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此
实施例l:罗氏沼坏精子类明胶酶编码基因的获得
① 利用Trizol，根据制造商提供的方法，从罗氏沼奸的雄性生殖道中提 取总RNA。以此为模板，利用反转录酶合成第一链cDNA。
② 根据氨基末端四十个氨基酸的序列，设计三条兼并引物(Fl: 5'-GAYGARAYYTNGCNWSNGARG画3，， F2 : 5'-GAYYTNGCNWSNGARGTNCARCA-3，和Rl :
5 ， -ATYTCRTCRTCNCCNCCNGCNA國3 ，)。
③ 在第一轮PCR反应中，以第一链cDNA为模板，F1和R1为引物。 PCR反应体系为cDNA模板lpl,引物各lpl, 10xPCRBuffer2.5 pl， MgCl21.5 pl， dNTPs 1.0 pl， TaqE 0.25 pl，灭菌水补足到25 pl。 PCR程 序为94。C变性5 min,接着94 。C 30 sec, 52 °C 30 sec， 72 °C 30 sec，进 行30个循环。最后72。C延伸10min。第二轮PCR反应以1.0 |il体积 的第一轮PCR产物为模板，引物为F2和Rl各1.0pl。其余与第一轮反 应相同，PCR反应程序也与第一轮相同。反应产物进行连接转化后测序
得到SGP的中间片,殳序歹寸fragmentl。
根据fragmentl,设计3'RACE的特异性引物3PF: 5'-CAAGGACATGGCTCTCAAAGAA-3'。用于3'RACE的cDNA #4居 FirstChoice/RLM-RACEKit所提供的方法合成。然后以此为PCR的模板， 引物是3PF和由试剂盒提供的3'outerprimer。具体方法参照试剂盒说明。 PCR产物连接转化测序后，得到SGP的3'端序列fmgmentll。 ⑤根据fragmentll,设计了 5'RACE的特异性引物5PO: 5 ， -GCAAACTTGAGTGTCCATTCGGT-3 ，和5PI:
5 ，-GGCGTCAATGATGCTTACCAGGAA-3， 。 5 ，端扩增的沖莫一反的制备采用本实— 验 室改进的方法获得。在第一轮PCR扩增中，PCR体系和PCR程序与前面 介绍的基本相同，其中引物为5PO和adapter primer: 5，-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3，，退火温度为60。C。第二轮PCR， 则以第一轮产物为才莫板，引物为5PI和5， adapterprimer。其余和第一轮 相同。扩增产物同样被连接转化并测序(fragmentIII)。
根据三个片段(fragmentl,fragmentll和fragmentIII)的序列，拼接后得 到SGP cDNA的完整序列
5'-GGCAGTCGATCAGCAGCTATCAAGGAAGACCCAAACATGAAATT
CCTGTTCGCCGGTGGAATCCTCTTGTTTGCCTTGGCAGTGAGCGCCA
TGGCCGACGAAGACCTTGCTTCCGAAGTGCAGCAATTCAAGGACAT
GGCTCTCAAAGAACGGGTCGAGGAGGAAAACTGCACCAAATACGT
TCTCGCCGGAGGGGACTGCGAAATTGTCATCAGGATGGAAAAACTG
GAGAACATCCTGAAGGACTTCTTCCAATCCATGACCACGAAGCCTA
AACTGACCGAACTCTTCGACGCTTCGGTATCCTACTTCCTGGGAGG
GCAGTGATGATGTTAAATACCTCCTACGAGTTACCGAATGGACACTC
GTTGAGTATGATTGGTTAATGCTGACAAAATTGTTTTCTGAATAAAA CATGAAACCATAAAAAAAAAAAA-3'。
该cDNA的全长为577 bp,由36-bp的5，非翻译区(5，-UTR), 157-bp 的3'非翻译区(3，-UTR)和384-bp的开放阅读框组成。该序列已经提交 到GenBank上，但尚未公开。序列号为EF647641 。其中384-bp的开放 阅读框(ORF)可被翻译成127个氨基酸组成的前体蛋白质，其中包括 107个氨基酸组成的成熟肽和20个氨基酸组成的信号肽
QCFCSSLEVKGCHPFLVSIIDAVKEQCPKKKQ。
实施例2:罗氏沼蚱精子类明胶酶的水解作用 待测样品制备
样品1 (罗氏沼坏精子粗提物)取成熟雄性罗氏沼奸的壶腹，碾碎之后， 离心得到精子，在4。C条件下，用超声波处理5分钟，离心后所得的上清 即为精子粗提物，-8(TC储存备用。
样品2(罗氏沼蚱精子粗提物与MRPINK反应后的产物)精子粗提物(10 吗)与MRPINK (5mM)在28""C条件下反应半个小时，反应产物通过含 0.1%明月交的SDS-PAGE 4企测活性。
样品3 (SGP):结合明胶活性检测实验，运用HPLC的方法，从精子粗 提物中分离纯化到SGP。 HPLC的洗脱条件为含0.05%TFA的乙腈在1小
时内，以1 ml/min流速，从0%-65°/0进行梯度洗脱。
样品4 ( SGP与MRPINK反应后的产物)HPLC分离纯化得到的SGP,
在28。C下与MRPINK反应30分钟。反应产物在含0.1%明胶的SDS-PAGE
上检测活性。
电泳步骤
① 含0.1。/。明胶的SDS-PAGE的制备配制10%的SDS-PAGE,在分离胶 中加入中浓度为0.1%的明胶。
② 电泳在20mA， 4。C条件下，进行2h。
③ 电泳结束后，凝胶在BufferA (0.1 M Tris,pH 8.0) +2.5%Triton X-100 中平衡1.5 h。然后用BufferA清洗。最后在含5 mM CaCl2和0.2 M NaCl 的BufferA中，37 。C过夜反应。
④ 反应结束后，用考马斯亮蓝R-250染色脱色。
⑤ 将待测样品1与样品2 —组，样品3与样品4 一组，按照上述方法进行 电泳，电泳图参见图1、图2。
结论
在图l-a中的透明亮带表示罗氏沼虾精子粗提物中含有能够水解明胶 的蛋白酶，而将粗提物与MRPINK反应后，蛋白酶活性消失(图l-b)。 图2-b透明亮带显示了 SGP水解明胶的活性，SGP与MRPINK反应后， 其水解活性受到抑制(图2-a)。
序列表—ST25
SEQUENCE LISTING
<110>浙江大学
<120>罗氏沼虾精子类明胶酶及其编码基因和应用
<130>
<160〉 9
<170> Patentln version 3.4
<210〉 1
〈211〉 127
〈212> PRT
<213〉 Macrobrachium rosenbergii
〈400〉 1
Met Lys Phe 1
Leu
Phe 5
Ala Gly
Gly lie Leu 10
Leu Phe Als Leu
Ala Val 15
Ser Ala Met Ala Asp Glu Asp Leu Ala Ser Glu Val Gin Gin Phe Lys 20 25 30
Asp Met Ala Leu Lys Glu Arg Val Glu Glu Glu Asn Cys Thr Lys Tyr 35 40 45
Val Leu Ala Gly Gly Asp Cys Glu lie Val lie Arg Met Glu Lys Leu 50 55 60
Gu Asn lie Leu Lys Asp Phe Phe Gin Ser Met Thr Thr Lys Pro Lys
65
70
75
80
Leu Thr Glu Leu Phe Asp Ala Ser Val Ser Tyr Phe Leu Gly Gly Gin 85 90 95
Cys Phe Cys Ser Ser Leu Glu Val Lys Gly Cys His Pro Phe Leu Val 100 lb5 110
Ser lie lie Asp Ala Val Lys Glu Gin Cys Pro Lys Lys Lys Gin 115 120 125
〈210〉 2 <211> 577 <212> 腿 <213〉 Macrobrachium rosenbergii
<400> 2 ggcagtcgatcagca_gct3tcaagg犯gaccc犯acatg3aattcctgttcgccggtgga60
atcctcttgtttgccttggcagtgagcgccatggccgacgaagaccttgcttccgaagtg120
cagcaattcaaggacatggctctc犯agaacgggtcgaggcaccaaatac180
gttctcgccgg&ggggactgcgaaattgtca犯犯ct ggag33C3tCCtg240
saggacttcttccaatccatgaccacgaagcctaaactgaccgaactcttcgacgcttcg300
g"tatcctacttcctgggaggccagtgcttctgttcatccctcgaggtcaaaggatgccac360
ccattcctggtaagcatcattgacgccgtcaaggaacEiatgtcccaagaag卿cagtga420
tacctcctac.gagttaccga3tggacactc犯gtt.tgc犯ctacacttga咖
actttagattttgcccactctaattctgttgagtatgattggtt组gctgacaawttg540
ttttctgaat aaaacatgaa accataaaaa aaaa犯a
577
<210>3
<211>21
<212>PRT
<213>Unknown
〈220>
<223>人工合成
<400>3
Gly Ala Tyr Gly10
15
Asn Gly Ala Arg Gly
20
<210〉 <211> 〈212〉 <213>4 23 PRT Unknown
<220> <223>人工合成
〈400>4
Gly Ala Tyr Tyr 1Thr Asn Cys Ala 20〈210〉 <21L〉 <212> <213>5 22 PRT Unknown
<220〉 〈223〉人工合成
<400〉5
10
15
Ala Thr Tyr Thr Cys Arg Thr Cys Arg Thr Cys Asn Cys Cys Asn Cys 15 10 15
Cys Asn Gly Cys Asn Ala
20
〈210〉6
<211〉22
〈212>DNA
〈213〉Unknown
<220>
<223〉人工合成
<400>6
caaggacatg gctctcaaag aa
22
<210〉 7
〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉 Unknown
<220〉
<223〉 人工合成 <400> 7
gcaaacttga gtgtccattc ggt
<210>8
<211〉24
<212〉DNA
<213>Unknown
<220〉
<223〉人工合成
〈400〉8
ggcgtcaatg atgcttacca ggaa
〈210〉 9
<211〉 21
<212> DNA
〈213> Unknown
〈220〉
<223>人工合成
〈400〉 9
tgtagcgtga agacgac卿a
权利要求
1.罗氏沼虾精子类明胶酶(sperm gelatinase-like protease，SGP)，含有SEQNO1所示的氨基酸序列。
2. 如权利要求1所述的罗氏沼蚱精子类明胶酶，其特征在于所述罗氏沼 虾精子类明胶酶为SEQ NO: 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
3. 编码权利要求1所述的罗氏沼奸精子类明胶酶的基因。
4. 如权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因含有SEQ NO: 2所示的核苷酸序列。
5. 如权利要求4所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为SEQ NO: 2所示的核苦酸序列。
6. 如权利要求1或2所述的罗氏沼虫下精子类明胶酶在水解明胶中的应用。
全文摘要
本发明从罗氏沼虾(M.rosenbergii)的精子粗提物中分离纯化的一种具有水解明胶作用的蛋白酶——罗氏沼虾精子类明胶酶(spermgelatinase-like protease，SGP)及其编码基因和应用。通过对不同物种的精子上与受精有关的酶的研究，有助于了解甲壳类受精作用的机制，以及不同物种间产生生殖隔离的机制。基于这些理论与技术，使相关研究人员能够建立优良的杂交体系，从而获得高产，快速生长的杂交物种。
文档编号C12N9/64GK101368178SQ20071007080
公开日2009年2月18日 申请日期2007年8月16日 优先权日2007年8月16日
发明者晔 李, 杨卫军, 马文明 申请人:浙江大学