专利名称：一种预示和鉴定鸡腹脂量的微卫星分子标记方法
技术领域：
本发明属于动物分子遗传学领域，特别是涉及一种用微卫星分子标记检测鸡腹脂量的方法。
(二)、背景技术鸡不仅在全世界广泛饲养，具有重要经济价值，而且在生命科学研究中极有意义，是一种重要的模式生物。家禽育种工作在过去的几十年中依赖于表型的选择已经取得了令人瞩目的成绩，肉鸡的生长速度和肉产量得以明显提高。肉鸡业在世界范围内，尤其在中国等发展中国家具有良好的发展前景。然而，伴随着肉鸡的快速生长，其生理性不适症及相关疾病明显增加，如腹脂沉积过多，腿部疾病，腹水综合症，猝死症，鸡体免疫功能下降等，这些问题给肉鸡生产者造成的经济损失是显而易见的。腹脂被认为是一种经济价值很低的副产品，并且过多的腹脂沉积将导致饲料转化率下降。如何控制腹脂在肉鸡体内的沉积，育种工作者做了大量的研究，目前，选育低脂肉鸡品系是世界范围内肉鸡育种重要的奋斗目标之一。
国内外学者普遍认为通过遗传选择手段选育低脂肉鸡是控制鸡体脂沉积过多的一个有效的途径。Griffin等研究了血浆极低密度脂蛋白(VLDL)浓度与腹脂的关系，发现二者存在正的遗传相关，并对低VLDL浓度的品系选择了4个世代，发现其腹脂和体脂含量下降，蛋白质含量和饲料效率有所提高。Whitehead和Griffin对血浆VLDL浓度进行双向选择，获得了瘦鸡品系和肥鸡品系，两个品系7周龄体重相近，但瘦鸡系的总蛋白含量较高，体脂含量较少，而肥鸡系正相反。李辉等根据血浆极低密度脂蛋白(VLDL)浓度及腹脂率等指标对来源于AA肉鸡的一个父系进行双向选择，建成了现在的东北农业大学高低脂双向选择品系，到目前为止已经经过了10个世代的选择，高、低脂系在腹脂量上已有明显的分离，两系腹脂率(AFP)相差近3倍(见附图1)，是一个检测影响鸡腹脂量差异等位基因的宝贵资源群体。
然而通过遗传选择手段培育瘦鸡品系和肥鸡品系对降低肉鸡腹脂虽然取得了一定的作用，但其育种进展还是比较缓慢的。过去的15年来，伴随着人类基因组计划的开展，畜禽基因组计划也得到了高速发展。分子生物学和数量遗传学的结合，使得标记辅助选择(MAS)的可操作性大大加强。选择与数量性状位点(Quantitative Trait Loci，QTL)相连锁的分子遗传标记(基因或非基因标记)即可实现对基因型的直接选择，这将大大加快育种进程。
微卫星标记作为继RFLP之后的第二代分子标记，越来越受到研究者的青睐。微卫星，又称简单序列重复(Simple sequence repeats，SSR)，是指以少数几个核苷酸(2～6个)为单位多次串联重复的DNA序列。微卫星标记由核心序列和两侧保守的侧翼序列构成。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性。微卫星标记具有以下的优点①分布广泛，微卫星广泛分布于真核生物基因组中，大约每隔10～50kb就存在一个微卫星。②高度多态，突变率低，在不同的个体中，微卫星重复单位数目的变异非常大，由此造成了高度的长度多态性，并使其具有较高的信息含量。③共显性标记，微卫星标记遵循孟德尔遗传法则，呈共显性遗传，因此能很好地区分纯合子与杂合子。④微卫星引物的通用性，微卫星侧翼序列的保守性以及物种间某些染色体区段的共线性，使得从一个物种获得的引物可以应用于相关的分类群。⑤中性标记，在多数情况下，微卫星标记没有任何表型效应，因而不存在对畜禽个体的有害或次级效应。
(三)、发明内容本发明的主要目的是提供一种分子生物学技术，即采用PCR和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测鸡腹脂含量，从而预示和鉴定鸡腹脂量的微卫星分子标记方法。
本发明的目的是这样实现的1、根据鸡基因组序列在微卫星ADL328两侧设计一对引物，其中上游引物在5’端加上6-FAM荧光标记ADL328F5’-CACCCATAGCTGTGACTT-3’ADL328R5’-AAAACCGGAATGTGTAAC-3’；2、利用该引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增；3、使用ABI377测序仪进行微卫星PCR扩增产物的检测分析，检测出ADL328在该群体中存在长度多态；4、根据扩增出来的片断长度将其分成4个等位基因，从小到大依次为1、2、3和4。4个等位基因共形成10种基因型，其中等位基因1和4构成的三种基因型见附图2。
本发明还可以包括1、其中分析标记多态性的方法是通过检测微卫星重复片断长度而分类的基因型。
2、其中用于分析标记多态性的部位是鸡1号染色体173442693bp处。
3、其中用于分析标记多态性的部位是由ADL328F和ADL328R表示的引物扩增区。
4、其中用于分析多态性的位点选自鸡基因组如下序列中第32位至第57位的13个CA重复序列。
1 CACCCATAGCTGTGACTTTGTTCGAGTGCTGCACACACACACACACACACACACACACGA61 CTGTGAAAGAGTACATTTGTCTCTGGAGTTTGCTGCAGTTACACATTCCGGTTTT。
5、其中鸡腹脂量是鸡的腹脂重和腹脂率。
6、其中变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为4.5％。
实验证明该微卫星标记的基因频率在5个世代中两系间的分布均达到显著或极显著水平，在连续5个世代中等位基因4在两系间的分布均达到显著或极显著水平。
本发明巧妙地采用PCR扩增和凝胶分离的方法检测鸡1号染色体上的一个微卫星标记在群体中的多态性。由于该微卫星标记在群体中存在长度多态，因此，根据扩增片断长度大小将4种等位基因分别命名为1、2、3和4。由于该微卫星具有多个等位基因，因此采用ABI377测序仪进行等位基因的分离。
获得基因型后计算等位基因的频率，比较等位基因频率在东北农业大学高腹脂和低腹脂两个品系问的分布差异，结果表明ADL328等位基因频率在两系间存在显著或极显著差异，并且在连续5个世代中都检测到了这种差异。对该微卫星标记与腹脂量的相关分析表明其与腹脂重和腹脂率都存在显著或极显著的相关，并且在连续五个世代中都得到了一致的结果。基因型间的多重比较表明11基因型的腹脂重和腹脂率显著高于22、33、44基因型。
本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。利用本发明的微卫星分子标记方法对腹脂量进行选择，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的微卫星分子标记方法，同时为鸡的腹脂量改良提供了一种有效的微卫星分子标记育种手段，可以加速鸡的育种进程。
附图1是高低脂双向选择系选育效果图；附图2-4是等位基因1和4构成的三种基因型效果图。
具体实施方式
下面举例对本发明做更详细地描述一、实验材料1.实验动物和性状测定东北农业大学建立的肉鸡高低脂双向选择品系，本研究选取5个世代，将每个世代鸡只按腹脂重由大到小排序，取高低两尾各15％的个体，5个世代共计596只鸡。
每世代鸡群在常规下饲养，测1、3、5、7周龄体重，7周龄末屠宰，屠宰前称活重，屠宰后称屠体重、腹脂重，并且计算出腹脂率。
2.实验药品Taq DNA Polymerase购自Promega公司；dNTPs、琼脂糖(Agrose)购自北京鼎国生物技术发展中心；Tris碱、EDTA、丙烯酰胺、N、N’-甲叉双丙烯酰胺购自美国Life Science公司；硼酸购自北京化学试剂公司；过硫酸铵、尿素购自美国Life technologies公司；TEMED购自上海生工生物工程技术服务有限公司；去离子树脂购自Gibico公司；Genescan-350TM分子量内标购自美国ABI公司；其他常规试剂由中国农业大学物资供应科提供。
3.主要仪器Gene Amp PCR System 9600PERKIN ELMER公司，美国；Gene Amp PCRSystem 9700PERKIN ELMER公司，美国；梯度PCR仪Eppendorf公司，德国；377测序仪ABI公司，美国；超纯水仪Millipore公司，美国；制冰机SANYO公司，日本；自动灭菌锅SANYO公司，日本；台式高速低温离心机Eppendorf公司，德国；DYY-III2型、DYY-III-6B型稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂，中国；凝胶成像系统Alpha Innotech公司，美国；分光光度计Eppendorf公司，德国。
二、实验方法1.缓冲液与常用试剂的配制10×PCR Buffer15mM MgCl2，50mM KCl，100mM Tris·HCl，1％TritonX-100，0.1％明胶。
1M Tris·Cl121.14g Tris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，加水定容至1000ml，高压灭菌。
0.5M EDTA(pH8.0)800ml水中加入186.1g乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na·2H2O)，在磁力搅拌器上搅拌，用NaOH(约20g)调节pH至8.0后，加水定容至1000ml，高压灭菌。
TE(pH8.0)10mM Tris·Cl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)，高压灭菌，室温保存。
10％SDS100g SDS溶于900ml水中，加热至68℃助溶，用HCl调pH值至7.2，加水定容至1000ml。
50×TAE缓冲液Tris碱242g，冰乙酸57.1ml，0.5M EDTA(pH8.0)100ml，加水至1000ml。
10％过硫酸铵(APS)0.1g过硫酸铵，加1ml水溶解(每次使用需新鲜配制)。
40％丙烯酰胺贮存液(29∶1)称取丙烯酰胺58.0g，N、N’-甲叉双丙烯酰胺2.0g，树脂1.5g，加入适量的去离子水，搅拌使其充分溶解后，用0.02μm滤纸真空抽滤，定容至150ml，4℃可贮存一个月。
4.5％丙烯酰胺溶液尿素18.0g，树脂0.5g，5.63ml 40％丙烯酰胺贮存液，加入适量去离子水，搅拌使其充分溶解，用0.02μm滤纸真空抽滤，加入5ml用0.02μm滤纸真空抽滤的10×TBE，定容至50.0ml，灌胶前加入250μl10％过硫酸铵(APS)，30ul四甲基乙二铵(TEMED)。
上样缓冲液(Loading Buffer)去离子甲酰胺50μl，葡聚糖蓝10μl，加入Genescan-350TM 9μl，充分混匀，4℃保存。
10×TBETris碱108g，硼酸55g，EDTA 8.3g，加水至1000ml。
溴化乙锭贮存液在100ml水中加入1g溴化乙锭，4℃棕色瓶内保存。
6×凝胶加样缓冲液0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青，40％(W/V)蔗糖水溶液，4℃保存。
血液DNA提取液10mM Tris·Cl(pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0)，20μg/ml RNA酶，0.5％SDS。
2.引物的设计与合成以下引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成ADL328F5’-CACCCATAGCTGTGACTT-3’ADL328R5’-AAAACCGGAATGTGTAAC-3’；3.鸡基因组DNA的小量提取方法一(1)取20μl抗凝血液，加入500μl禽裂解液，加入蛋白酶K至终浓度为100-200μg/ml，混匀55℃消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的团块。
(2)将溶液冷却至室温，加入5M NaCl至终浓度1.5M，混匀10min。加入等体积酚/氯仿，反复颠倒离心管混匀10min。
(3)12,000rpm，室温离心10min。取上清，加等体积氯仿混匀10min。
(4)12,000rpm，室温离心10min。取上清2倍体积无水乙醇沉淀DNA。
(5)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。
(6)7,500rpm，室温离心5min，弃上清。
(7)将DNA干燥后(注意不能太干)溶于200μl TE中。
方法二(1)将20μl全血加入装有700μl 1×SET的1.5ml离心管中，轻轻混匀。
(2)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度100-200μg/μl和10％的SDS至终浓度0.5％，55℃消化12h。
(3)待消化完全后，加入等体积的Tris饱和酚，来回颠倒，使其混匀(4)12,000rpm离心10min，用剪去尖端的吸头将上层水相小心移入另一个离心管中，弃去有机相。重复第三和第四步骤一次。
(5)向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液(体积比为24∶23∶1)，混合10min。12,000rpm.，离心10min，移出水相到另一个离心管。
(6)向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇混合液(23∶1)，来回颠倒混合10min，12,000rpm，离心10min，移出水相到另一个离心管。
(7)向水相中加1/10体积NaAc(3M，pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，来回颠倒，沉淀DNA。
(8)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。
(9)7,500rpm离心5min。小心倒掉管中乙醇，将倒置在滤纸上，让乙醇流尽，置于空气中干燥。
(10)加入200μl的TE，置50℃水浴中过夜溶解DNA。溶解后贮存于-20℃备用。
4.PCR反应(1)以鸡DNA为模板进行PCR扩增，25ul反应体系中包含以下溶液或试剂10×PCR reaction buffer2.5μldNTP Mixture(各2.5mM) 2.0μl引物1(10μM) 0.5μl引物2(10μM) 0.5μlEX-Taq(5U/μl) 0.25μl去离子水 18.25μl基因组DNA(50ng/μl)1.0μl(2)将上述溶液混合并按以下条件进行PCR反应。
94℃变性10min；94℃30sec，61.5℃45sec，72℃30sec，32个循环；72℃延伸10min。
(3)反应结束后，取PCR反应液(2μl)进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。
5.利用ABI377测序仪进行微卫星PCR扩增产物的检测。
(1)用灭菌的去离子水将PCR扩增产物稀释20～30倍；(2)取1μl稀释液，加1μl上样缓冲液，充分混匀；(3)94℃变性5min，取出后立即插置冰上骤冷；
(4)变性的PCR产物用4.5％的变性聚丙烯酰胺凝胶在ABI377序列分析仪GSRun-36A-2400模型下电泳2.5小时；(5)使用GeneScanTM3.1软件分析Gel File，进行泳道线校正、数据转换、内在标准分子量校正、迁移片段大小测定；(6)使用GenotyperTM2.5软件确定基因型。
(GenescanTM3.1软件使用见Applied Biosystems公司Genescan AnalysisSoftware Version3.1 User’s Manual；GenotyperTM2.5软件使用见AppliedBiosystems公司ABI PRISMTM Genotyper 2.5 User’s Manual)7.统计模型建立表型数据整理表型数据收集整理采用Excel软件，用JMP(SAS Institute，Cary，NC)计算表型均值、标准差及相关系数。
等位基因频率等位基因频率指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。
Pi＝〔2(ii)+(ij1)+(ij2)+……(ijn)〕/2NPi第i个等位基因的频率i纯合复等位基因j1，j2……jn与i共显的第1到第n个等位基因由于微卫星呈共显性遗传，所以对测得的基因型进行统计计算即可获得等位基因频率实施例、鸡微卫星标记基因频率在高低脂双向选择系间的差异分布及其多态性与腹脂量的相关。
利用本发明的引物(ADL328F和ADL328R)对东北农业大学高低脂双向选择系5个世代共596个个体的基因组DNA进行PCR扩增，然后利用ABI377测序仪进行微卫星PCR扩增产物的检测分析。在高低脂5个世代中共检测到4种等位基因，分别命名为1、2、3和4。
对微卫星标记ADL328基因频率在两系间的差异性采用Fisher精确性检验(表1)。
表1ADL328等位基因频率在第六、七、八、九、十世代两系间的比较(P值)
表2列出微卫星标记ADL328在5个世代中与腹脂量的相关分析结果，相关分析用JMP 6.0(SAS Institute Inc.)进行。
表2微卫星标记ADL328与腹脂重和腹脂率的相关分析结果(P值)
*代表差异显著(P＜0.05)；**代表差异极显著(P＜0.01)将5个世代的所有个体放在一起，把世代数作为一个固定效应进行标记与腹脂重和腹脂率的相关分析，结果表明P＜0.01，表明该微卫星多态性与腹脂量显著相关。对10种基因型在东农高低脂系腹脂重和腹脂率的最小二乘均值进行多重比较结果表明11基因型的腹脂重和腹脂率显著高于22、33、44基因型(见表3)。
表3ADL328不同基因型对东农高低脂系鸡只腹脂重和腹脂率的影响
均值比较时同一列无相同字母者差异显著(a-bp＜0.05)。
分析多态性的位点选自鸡基因组如下序列中第32位至第57位的13个CA重复序列，序列表1 CACCCATAGCTGTGACTTTGTTCGAGTGCTGCACACACACACACACACACACACACACGA61 CTGTGAAAGAGTACATTTGTCTCTGGAGTTTGCTGCAGTTACACATTCCGGTTTT。
权利要求
1.一种预示和鉴定鸡腹脂量的微卫星分子标记方法，其特征是(1)、根据鸡微卫星标记ADL328附近的基因组序列设计一对引物ADL328F5’-CACCCATAGCTGTGACTT-3’ADL328R5’-AAAACCGGAATGTGTAAC-3’；(2)、利用该引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增；(3)、使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行标记多态性分析，检测出ADL328在该群体中存在长度多态；(4)、等位基因及其频率分析根据检测到的片断长度对各等位基因命名，片断由短到长分别命名为1、2、3和4。
2.根据权利要求1所述的预示和鉴定鸡腹脂量的微卫星分子标记方法，其特征是其中分析标记多态性的方法是通过检测不同个体微卫星长度不同而分类的基因型。
3.根据权利要求2所述的预示和鉴定鸡腹脂量的微卫星分子标记方法，其特征是其中用于分析标记多态性的部位是鸡1号染色体173442693bp处。
4.根据权利要求3所述的预示和鉴定鸡腹脂量的微卫星分子标记方法，其特征是其中用于分析标记多态性的部位是由ADL328F和ADL328R表示的引物扩增区。
5.根据权利要求4所述的预示和鉴定鸡腹脂量的分子标记方法，其特征是其中用于分析多态性的位点选自鸡基因组如下序列中第32位至第57位的13个CA重复序列，1CACCCATAGCTGTGACTTTGTTCGAGTGCTGCACACACACACACACACACACACACACGA61 CTGTGAAAGAGTACATTTGTCTCTGGAGTT TGCTGCAGTTACACATTCCGGTTTT。
6.根据权利要求1-5任何一项所述的预示和鉴定鸡腹脂量的分子标记方法，其特征是其中鸡腹脂量是鸡的腹脂重和腹脂率。
7.根据权利要求1-6任何一项所述的预示和鉴定鸡腹脂量的微卫星分子标记方法，其特征是其中用于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的变性聚丙烯酰胺凝胶的浓度为4.5％。
全文摘要
本发明提供的是一种预示和鉴定鸡腹脂量的微卫星分子标记方法。根据鸡1号染色体基因组序列，查找到在173442693bp处存在CA重复序列，共有13个CA重复，将其命名为微卫星ADL328，在该微卫星标记两侧根据基因组序列设计一对引物ADL328F和ADL328R；利用该引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增，然后利用ABI377测序仪进行微卫星PCR扩增产物的检测分析，检测到ADL328在所研究群体中存在4个长度多态，即4个等位基因，分别命名为等位基因1、2、3和4。利用本发明的微卫星标记方法对鸡腹脂量进行选择，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为鸡的腹脂量改良提供了一种有效的分子标记育种手段，可以加速鸡的育种进程。
文档编号C12N15/11GK101078030SQ20071007226
公开日2007年11月28日 申请日期2007年5月28日 优先权日2007年5月28日
发明者李辉, 张慧 申请人:东北农业大学