专利名称：采用密码子优化的il-15的疫苗和免疫治疗剂及其使用方法
采用密码子优化的IL-15的疫苗和免疫治疗剂及其使用方法 发明领域
本发明涉及包含编码IL-15及其片段的密码子优化的核酸序列的核酸分 子、改良的疫苗、预防性和/或治疗性免疫接种个体抵御免疫原的改良方法，和 改良的免疫治疗组合物及改良的免疫治疗方法。
背景技术：
免疫治疗指调节人的免疫应答反应从而赋予所需的疗效。免疫治疗剂指给 予个体后能调节个体的免疫系统，足以最终减轻不良免疫应答反应相关症状， 或通过增强所需的免疫应答而最终减轻症状的那些组合物。在一些情况中，所 述免疫治疗是疫苗接种方案的一部分，给予个体疫苗使个体与免疫原接触，进 而使该个体产生针对该免疫原的免疫应答，在这些情况中，免疫治疗剂可增强 免疫应答和/或选择性增强免疫应答的某一部分(例如细胞应答或体液应答)，这 是治疗或预防具体病症、感染或疾病所需的。
可采用针对靶抗原，例如过敏原、病原体抗原或与参与人体疾病的细胞相 关的抗原疫苗免疫接种个体。与参与人体疾病的细胞相关抗原包括癌症相关肿 瘤抗原和参与自身免疫疾病细胞相关的抗原。
设计这些疫苗时，业已知晓接种的疫苗必须在个体的细胞中产生靶抗原方 能有效诱导免疫系统的细胞免疫应答。具体地说，减毒活疫苗、采用无毒性 载体的重组疫苗和DNA疫苗各自能在接种疫苗的个体细胞内产生抗原，从 而诱导免疫系统的细胞免疫应答。另一方面，只包含蛋白质的杀死或灭活 疫苗和亚单位疫苗不能诱导良好的细胞免疫应答，虽然它们能诱导体液应答。
细胞免疫应答反应通常是提供抵御病原体感染的保护力和提供治疗病 原体感染、癌症或自身免疫疾病的有效免疫治疗所必须。因此，常优选能 在接种疫苗个体的细胞内产生靶抗原的疫苗，例如减毒活疫苗、采用无毒性载体的重组疫苗和DNA疫苗。
虽然这些疫苗常能有效地预防性或治疗性免疫接种个体而抵御病原体 感染或人体疾病，但需要改良的疫苗。需要能产生增强免疫应答的组合物 和方法。
同样，虽然一些免疫治疗剂可用于调节患者的免疫应答反应，但仍需要改 良的免疫治疗组合物和方法。
发明概述
本发明涉及包含编码IL-15蛋白质的核酸序列的核酸分子，所述核酸序列 包含编码IL-15功能片段的SEQ IDN0:1或其片段。
本发明涉及包含编码IL-15功能片段的SEQ ID N0:1或其片段的核酸分 子，所述核酸分子不含IL-15信号序列的编码序列和/或不含IL-15的Kozak区 和/或IL-15的5'非翻译区和/或IL-15的3'非翻译区和/或包含非-IL-15信号序 列的编码序列。
本发明涉及包含编码IL-15蛋白质的核酸序列和包含某免疫原编码序列的 核酸分子，所述核酸序列包含编码IL-15功能片段的SEQIDNO:l或其片段。
本发明涉及包含以下核酸分子的组合物含有SEQ ID NO:l或其片段的 核酸序列的核酸分子和含有编码某免疫原的核酸序列的核酸分子，所述SEQ IDN0:1或其片段编码IL-15的功能片段。
本发明还涉及调节个体免疫应答反应的方法，所述方法包括给予所述个体 包含编码IL-15功能片段的SEQ ID N0:1或其片段的核酸分子。
本发明还涉及包含含有编码IL-15功能片段的SEQ ID N0:1或其片段的核 酸分子的重组疫苗。
本发明涉及在个体中诱导抗某免疫原的免疫应答反应的方法，所述方法包 括单独给予所述个体包含编码IL-15功能片段的SEQ IDN0:1或其片段的核酸 分子，或与编码某免疫原的核酸分子联合给予或与某免疫原联合给予。
附图简述
图1显示了 SEQIDNO:l。优选实施方式详述 定义
本文所用的术语"靶蛋白质"指由本发明的基因构建物编码的肽和蛋白质， 它们在免疫应答反应中起着靶蛋白质作用。术语"靶蛋白质"和"免疫原"可 互换使用，指引起免疫应答的蛋白质。靶蛋白质是免疫原性蛋白质，应与病原 体的蛋白质或有害类型细胞(如癌细胞)或参与自身免疫疾病的细胞(免疫应 答需要抵御)的蛋白质共有至少一个表位。针对靶蛋白质的免疫应答反应可保 护个体抵御和/或治疗该个体的与该靶蛋白质相关的特定感染或疾病。
本文所用的术语"基因构建物"指DNA或RNA分子，这些分子含有编 码靶蛋白质或免疫调节蛋白质的核苷酸序列。该编码序列包括操作性连接于调 节元件的起始和终止信号，包括能指导给予该核酸分子的个体细胞表达的启动 子和聚腺苷酸化信号。
本文所用的术语"可表达形式"指基因构建物，其含有操作性连接于编码 靶蛋白质或免疫调节蛋白质的编码序列的必需调节元件，从而当该编码序列存 在于个体的细胞中时可被表达。
本文所用的术语"共有一个表位"指蛋白质含有与另一蛋白质某表位相同 或基本上相似的至少一个表位。
本文所用的术语"基本上相似的表位"指结构上虽与某蛋白质的表位不同， 但能引起与该蛋白质交叉反应的细胞或体液免疫应答的表位。
本文所用的术语"胞内病原体"指病毒或病原生物体，它们的复制周期或 生命周期的至少一部分发生在宿主细胞中，并能在宿主细胞中产生病原蛋白质 或导致病原蛋白质产生。
本文所用的术语"过度增殖性疾病"指细胞过度增殖的那些疾病和病症。
本文所用的术语"过度增殖相关蛋白质"指与过度增殖性疾病相关的蛋白质。
本文所用的术语"免疫调节蛋白"指能调节递送了该免疫调节蛋白的 人的免疫系统的蛋白质。示范性的免疫调节蛋白质包括IL-15、 CD40L、 TRAIL 、 TRAILrecDRC5 、 TRAIL-R2、 TRAIL - R3 、 TRAIL-R4、 RANK、RANK配体(RANK LIGAND)、 Ox40、 Ox40配体(Ox40 LIGAND)、 NKG2D、 F461811或MICA、 MICB、 NKG2A、 NKG2B、 NKG2C、 NKG2E、 NKG2F、 CD30、 CD153 (CD30L)、 Fos、 c如、Sp-l、 Apl、 Ap-2、 p38、 p65Rel、 My膽、IRAK、 TRAF6、 IkB、NIK、 SAP K、 SAP1、 JNK2、 JNK1B2、 JNK1B1、 JNK2B2、 JNK2B1、 JNK1A2、 JNK2A1、 JNK3A1、 JNK3A2、 NF-k-B2、 p49 剪接形式、NF-k-B2、 p100剪接形式、NF-k-B2、 p105剪接形式、NF-k-B 50K 链前体、NFkB p50、人IL-la、人IL-2、人IL陽4、鼠IL-4、人IL画5、人IL-IO、 人IL-15、人IL-18、人TNF- a、人TNF-(3、人白介素12、 MadCAM-l、 NGF IL墨7、 VEGF、 TNF-R、 Fas、 CD40L、 IL-4、 CSF、 G-CSF、 GM-CSF、 M-CSF、 LFA-3、 ICAM-3、 ICAM-2、 ICAM-1、 PECAM、 Pl50.95、 Mac-l、 LFA-1、 CD34、 RANTES、 IL-8、 MIP-Ia、 E-选择蛋白(selecton)、 CD2、 MCP-I、 L-选择蛋白、P-选择蛋白、FLT、 Apo-l、 Fas、 TNFR-1、 p55、 WSL-1、 DR3、 TRAMP 、 Apo-3、 AIR、 LARD、 NGRF、 DR4(TRAIL)、 DR5、 KILLER、 TRAIL陽R2、 TRICK2、 DR6、 ICE、 VLA國1和CD86 (B7.2)。
发明概述
本发明提供编码IL-15的核酸序列，与天然序列相比，所述核酸序列能提 供改良的蛋白质表达。可联用改良的IL-15编码序列与引用纳入本文的以下专 利申请2004年6月14日提交的PCT申请PCT/US04/18962; 2003年6月 13日提交的美国临时申请号60/478,210和2003年6月13日提交的美国临 时申请号60/478,205中公开的，特别是提供与非IL-15信号肽，尤其是IgE信 号肽(编码序列)相连的IL-15蛋白质编码序列的那些序列，以及这些构建物在 疫苗中的应用和在递送IL-15蛋白质作为免疫调节蛋白质的构建物中的应用。 在一些优选实施方式中，本发明提供包含含有编码IL-15功能片段SEQ ID NO:l或其片段的核苷酸序列的核酸分子的载体、疫苗和免疫调节组合物及方 法。在一些优选实施方式中，提供的这些核酸分子不含IL-15信号序列的编码 序列，更优选不含IL-15的Kozak区和非翻译区。在一些优选的实施方式中， 本发明提供包含含有与人IgE信号序列的编码序列相连的编码IL-15功能片段 SEQIDNO:l或其片段的核苷酸序列的核酸分子的载体、疫苗和免疫调节组合物及方法。
业已修饰了编码IL-15的天然序列以提高其表达。在早期改进中，删除了
例如IL-15 (信号肽)序列的编码序列和非翻译区等元件以提高其表达。可掺 入这些早期改进，和与SEQIDN0:1所示成熟IL-15蛋白质的改良编码序列联 用。在优选的实施方式中，包含SEQ IDN0:1的核酸分子不含IL-15信号肽的 编码序列，优选用另一种信号蛋白，例如IgE信号蛋白替代其位置。此外，还 可除去IL-15的Kozak区和非翻译区以消除抑制元件。构建物优选包含的唯一 IL-15序列是编码不含IL-5信号肽的成熟IL-15蛋白质氨基酸序列的IL-15序 列。
按照一些实施方式，提供的组合物包含分离的核酸分子，所述核酸分子包 含编码一种融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含与编码IL-15功能片段 SEQ ID NO:l或其片段编码的IL-15蛋白质相连的非IL-15信号序列。在一些 优选实施方式中，所述分子不含IL-15信号序列的编码序列。在一些优选的实 施方式中，所述融合蛋白在人中不具免疫原性。
按照一些实施方式，提供的一些组合物包含某核酸构建物，该核酸构建物 包含编码IL-15功能片段的SEQIDNO:l或其片段，和在同一核酸分子或不同 核酸分子(编码免疫原的核酸序列)上任选包含上述其它早期改进。下述免疫原 一般可以是任何免疫原性蛋白质，包括过敏原、病原体抗原、癌症相关抗原或 与自身免疫疾病相关细胞相连的抗原。在优选的实施方式中，所述免疫原是病 原体抗原，最优选选自HIV、 HSV、 HCV和WNV病原体。
在一些优选的实施方式中，所述核酸构建物是质粒。在一些优选的实施方 式中，将所述核酸分子掺入到病毒载体，例如牛痘病毒、腺病毒、腺伴随病毒、 逆转录病毒、RSV、 VSV、痘病毒或可用作疫苗或基因治疗载体的任何其它可 接受的病毒载体中。
按照本发明的某些方面内容，可将包含编码IL-15功能片段SEQIDNO:l 或其片段的基因构建物直接掺入到减毒的活病原体中。可用作疫苗的这些病原 体的例子如下所示。在优选的实施方式中，将人IL-15(优选不含IL-15信号序 列)与人IgE信号序列相连。
包含免疫原编码序列的组合物可用作疫苗。不含免疫原编码序列的组合物可用作免疫调节组合物。在一些实施方式中还提供蛋白质免疫原作为受IL-15 表达而增强免疫应答反应的靶蛋白质。
在一些优选的实施方式中，所述核酸构建物是质粒。在一些优选的实施方 式中，将所述核酸分子掺入到病毒载体，例如牛痘病毒、腺病毒、腺伴随病毒、 逆转录病毒或可用作疫苗或基因治疗载体的任何其它可接受的病毒载体中。
按照本发明的某些方面内容，可将包含编码IL-15功能片段的SEQ ID N0:1或其片段的基因构建物直接掺入到减毒的活病原体中。可用作疫苗的这 些病原体的例子如下所示。在优选的实施方式中，将人IL-15(优选不含IL-15 信号序列)与人IgE信号序列相连。
按照本发明的一些实施方式，本发明组合物包含含有免疫原和/或免疫原 性蛋白质编码序列的基因构建物。可将这些组合物递送给个体以调节该个体免 疫系统的活性，从而增强抵御该免疫原的免疫应答。个体的细胞摄入编码免疫 调节蛋白质的核酸分子后，编码免疫调节蛋白质的核酸序列在细胞中表达而将 此种蛋白质递送给该个体。本发明的各方面提供在包含不同核酸分子的组合物 中，将一个核酸分子上的蛋白质编码序列作为重组疫苗部分和作为减毒疫苗部 分递送的方法，所述不同核酸分子编码各种转录因子或中间体因子的一种或多 种。
本发明一些方面提供的组合物和方法能预防性和/或治疗性免疫接种个体 以抵御病原体或异常的疾病相关细胞。所述疫苗可以是任何类型的疫苗，例如 减毒活疫苗、细胞疫苗、重组疫苗或核酸或DNA疫苗。
本发明涉及用于递送免疫调节蛋白质的组合物和这些组合物的使用方法。
可采用几种熟知的技术，包括DNA注射(也称为DNA疫苗接种)、重组载 体，如重组腺病毒、重组腺相关病毒和重组牛痘病毒来递送所述核酸分子。
在引用而纳入本文的美国专利号5,593,972， 5,739,118， 5,817,637， 5,830,876， 5,962,428, 5,981,505， 5,580,859， 5,703,055， 5,676,594及其引 用的优先权申请中描述了 DNA疫苗。除了那些申请中所述的递送方案外，美 国专利号4,945,050和5，036，006描述的递送DNA的其它方法也引用纳入本文。
给药途径包括但不限于肌肉内、鼻内、腹膜内、真皮内、皮下、静脉内、 动脉内、眼内和口服以及局部、透皮、吸入或栓剂或递送给粘膜组织，例如通过灌洗递送至阴道、直肠、尿道、口腔和舌下组织。优选的给药途径包括给予 粘膜组织、肌肉内、腹膜内、真皮内和皮下注射。可通过以下方式，包括但不 限于常规注射器、无针注射装置或"微粒轰击基因枪"给予所述基因构建物。 当所述基因构建物被细胞摄取时，可作为功能性染色体外分子维持存在于
细胞中或整合入细胞的染色体DNA中。可将DNA以一种或多种质粒形式引
入细胞，作为分离的遗传物质而维持在细胞中。或者，可将能整合入染色体的
线性DNA引入细胞。当将DNA引入细胞时，可加入试剂以促进DNA整合入 染色体。还可在DNA分子内包含用于促进整合的DNA序歹lj。或者，可将RNA 引入细胞。也考虑了提供的基因构建物为含有着丝粒、端粒和复制起点的线性 小染色体。基因构建物可保留减毒活微生物或重组微生物载体在细胞内存活 (所需)的遗传物质部分。基因构建物可以是重组病毒疫苗的基因组部分，此 时所述遗传物质或整合入细胞染色体中，或维持存在于染色体外。基因构建物 包含核酸分子基因表达所需的调控元件。这些元件包括启动子、起始密码子、 终止密码子和聚腺苷酸化信号。此外，为了基因表达编码靶蛋白或免疫调节蛋 白的序列，常需要增强子。这些元件必须与所需蛋白的编码序列操作性相连， 而且这些调控元件必须能在所给予的个体内可操作。
起始密码子和终止密码子一般认为是所需蛋白质的编码核苷酸序列的 一部分。但是，这些元件在给予此基因构建物的个体内必须具有功能。起 始密码子和终止密码子必须与编码序列同在框内。
所用的启动子和聚腺苷酸化信号在个体的细胞内必须具有功能。 用于实施本发明，尤其是用于产生人用基因疫苗的启动子例子包括但 不限于猿病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人 免疫缺陷病毒(HIV)的启动子如HIV长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼 病毒启动子、ALV启动子、巨细胞病毒(CMV)的启动子例如CMV立即早 期启动子、EB病毒启动子、罗斯肉瘤病毒(RSV)启动子以及例如人肌动蛋 白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白等人基因的启 动子。
用于实施本发明，尤其是用于产生人用基因疫苗的聚腺苷酸化信号的 例子包括但不限于SV40聚腺苷酸化信号和LTR聚腺苷酸化信号。具体地说，可采用加利福尼亚州圣迭戈市英杰公司(Invitrogen， San Diego， CA) 的pCEP4质粒中的SV40聚腺苷酸化信号，称为SV40聚腺苷酸化信号。 除了 DNA表达所需的调控元件外，DNA分子中还可包含其它元件。 这些其它元件包括增强子。增强子可选自但不限于人肌动蛋白、人肌球 蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和诸如CMV、 RSV和EBV等病毒的增强 子。
为了使所述构建物维持存在于染色体外并在细胞内产生该构建物的多 个拷贝，可提供含哺乳动物复制起点的基因构建物。加利福尼亚州圣迭戈 市英杰公司的质粒pVAXl、 pCEP4和pREP4含有EB病毒复制起点和核抗 原EBNA-1编码区，它们能产生高拷贝附加型复制产物而不整合。
在涉及免疫接种应用的一些优选实施方式中，递送的核酸分子包含编 码耙蛋白、免疫调节蛋白的核苷酸序列，还包含能进一步增强对这些靶蛋 白的免疫应答反应的蛋白质(编码)基因。这些基因的例子是编码其它细 胞因子和淋巴因子，例如a干扰素、Y干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、 TNF、 GM-CSF、上皮生长因子(EGF)、 IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-6、 IL-IO、 IL-12 和IL-15，包括删除了信号序列而任选包含IgE信号序列的IL-15的基因。
如果因为任何原因需要清除接受了所述基因构建物的细胞，可以加入 用作细胞摧毁靶标的其它元件。可在此基因构建物中加入可表达形式的疱 疹(病毒)胸苷激酶(tk)基因。可给予个体药物甘昔洛韦(gangcyclovir)，该 药物可选择性杀伤产生tk的任何细胞，从而提供了选择性破坏含该基因构 建物细胞的工具。
为了最大程度产生蛋白质，可选择调控序列使其充分适合于在给予该 构建物的细胞内表达基因。此外，可选择能在细胞内最有效转录的密码子。 本领域普通技术人员能够制备在细胞内具有功能的DNA构建物。
在一些实施方式中，可提供基因构建物以产生连接有IgE信号肽的本文所 述免疫调节蛋白质的编码序列。
本发明的一种方法包括通过以下途径给予核酸分子的步骤肌肉内、鼻内、 腹膜内、皮下、真皮内或局部给予，或通过灌洗给予选自呼吸道、阴道、直肠、 尿道、口腔和舌下的粘膜组织。在一些实施方式中，将所述核酸分子与多核苷酸功能增强剂或基因疫 苗促进剂一起递送给细胞。多核苷酸功能增强剂的描述可参见1994年1月
26日提交的美国系列号5,593,972 ， 5,962,428和国际申请系列号 PCT/US94/00899，以上申请均通过引用纳入本文。基因疫苗促进剂的描述 可参见引用纳入本文的1994年4月1日提交的美国系列号021,579。与核 酸分子联合给予的辅助剂可以与该核酸分子混合给予，或者在给予核酸分 子的同时分别给予，或在此之前或之后给予。此外，功能为转染剂和/或复 制剂和/或促炎剂并能与GVF共同给予的其它制剂包括生长因子、细胞因子 和淋巴因子，例如a干扰素、y干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、 TNF、 上皮生长因子(EGF)、 IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-6、 IL-IO、 IL-12和IL-15以及 成纤维细胞生长因子；表面活性剂，如免疫刺激性复合物(ISCOMS)，弗氏 不完全佐剂，LPS类似物，包括单磷酰脂质A(MPL);胞壁酰肽，醌类似物 和诸如角鲨烯和角鲨烯类囊泡，和透明质酸，也可以与该基因构建物联合 给予。在一些实施方式中，免疫调节蛋白可用作GVF。在一些实施方式中， 所述核酸分子与PLG联合提供以增强递送/摄取。
本发明的药物组合物含有约1纳克至约2000微克的DNA。在一些优 选实施方式中，本发明的药物组合物含有约5纳克至约IOOO微克的DNA。 在一些优选实施方式中，该药物组合物含有约10纳克至约800微克的DNA。 在一些优选实施方式中，该药物组合物含有约0.1至约500微克的DNA。 在一些优选实施方式中，该药物组合物含有约1至约350微克的DNA。在 一些优选实施方式中，该药物组合物含有约25至约250微克的DNA。在 一些优选实施方式中，该药物组合物含有约100至约200微克的DNA。
可根据所采用的给药方式配制本发明的药物组合物。如果药物组合物 是可注射的药物组合物，它们是无菌、无热原和不含颗粒的。优选采用等 渗制剂。等渗添加剂一般包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖、山梨糖和乳糖。 在一些情况下，优选等渗溶液，如磷酸缓冲盐水。稳定剂包括明胶和白蛋 白。在一些实施方式中，在所述制剂中加入血管收縮剂。
按照本发明的一些实施方式，诱导抵御某免疫原的免疫应答反应的方法是 将本发明组合物给予个体。所述疫苗可以是减毒活疫苗、细胞疫苗、重组疫苗或核酸或DNA疫苗。
除了采用可表达形式的免疫调节蛋白编码序列来增强基因疫苗外，本发明 涉及改良的减毒活疫苗和采用重组载体递送编码抗原外来基因的改良疫苗。减 毒活疫苗和采用重组载体递送外来抗原的疫苗的例子描述可参见以下美国专
利号4,722,848; 5,017,487; 5,077,044; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424; 10 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,453,364; 5,462,734; 5,470，734;和5,482,713，这些专利通过引用纳入本文。提供的基因构建物 包含与调控元件操作性连接的免疫调节蛋白的编码核苷酸序列，所述调控 序列在疫苗中的功能是有效表达。可将这些基因构建物掺入到减毒活疫苗 和重组疫苗中以产生本发明的改良疫苗。
本发明提供免疫接种个体的改良方法，该方法包括将基因构建物作为疫苗 组合物的一部分递送给个体细胞的步骤，所述疫苗组合物包括DNA疫苗、减 毒活疫苗和重组疫苗。这些基因构建物包含编码免疫调节蛋白质和与调控序列 操作性连接的核苷酸序列，所述调控序列在疫苗中的功能是有效表达。所述改 良的疫苗可导致细胞免疫应答增强。
可釆用本发明来引发抵抗靶蛋白(即与病原体、变应原或个体自身的"异 常"细胞特异相关的蛋白质)的增强免疫应答反应。本发明可用于免疫接种 个体以抵御病原因子和生物，因此，针对某病原体蛋白的免疫应答反应提 供了抵御该病原体的保护性免疫力。通过采用本发明引发抵御过度增殖细 胞特异性相关靶蛋白的免疫应答反应，可战胜过度增殖性疾病和病症，例 如癌症。通过采用本发明引发抵御与参与自身免疫疾病的细胞特异性相关 靶蛋白的免疫应答反应可战胜自身免疫疾病和病症。
根据本发明的一些方面内容，将编码靶蛋白和免疫调节蛋白的DNA或 RNA导入个体组织的细胞中表达从而产生其编码蛋白。可将编码耙蛋白和 一种或两种免疫调节蛋白的DNA或RNA序列与在个体细胞内表达所需的 调控元件相连接。DNA表达的调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号。此 外，所述基因构建物中还可包含诸如Kozak区等其它元件。
在一些实施方式中，编码靶蛋白质的可表达形式序列和编码两种免疫调节蛋白的可表达形式序列位于同一核酸分子上而递送给个体。
在一些实施方式中，编码靶蛋白质的可表达形式序列位于与含有编码一种 或多种免疫调节蛋白的可表达形式序列的核酸分子不同的核酸分子上。在一些 实施方式中，编码靶蛋白质的可表达形式序列与编码一种或多种免疫调节蛋白 的可表达形式序列位于与含有编码一种或多种免疫调节蛋白的可表达形式序 列的核酸分子不同的一个核酸分子上。根据本发明可产生多种不同的核酸分子 并递送给个体。例如，在一些实施方式中，编码靶蛋白质的可表达形式序列位 于与含有编码两种免疫调节蛋白之一种或多种的可表达形式序列的核酸分子 不同的核酸分子上，而后一种可表达形式序列位于与含有编码一种或多种免疫 调节蛋白的可表达形式序列的核酸分子不同的核酸分子上。在这些情况中，所 有三种分子都被递送给个体。
可以质粒DNA、重组载体核酸分子(形式)或者作为减毒疫苗或细胞疫 苗中提供的遗传物质部分提供这些核酸分子。或者，在一些实施方式中，除了 编码蛋白的核酸分子外，还可将靶蛋白质和/或与一种或两种免疫调节蛋白一起 作为蛋白质递送，或者代之以编码它们的核酸分子递送。
所述基因构建物可含有操作性连接于基因表达所需调节元件的编码靶蛋 白质或免疫调节蛋白质的核苷酸序列。根据本发明，提供的基因构建物组合包 括含有编码靶蛋白质的可表达形式核苷酸序列的构建物和含有编码免疫调节
蛋白的可表达形式核苷酸序列的构建物。将含有基因构建物组合的DNA或 RNA分子掺入活细胞中可导致该DNA或RNA表达，而产生耙蛋白质及一种 或多种免疫调节蛋白。结果增强了抵御该靶蛋白质的免疫应答反应。
可采用本发明来免疫接种个体以抵御所有的病原体，例如病毒、原核生物 和致病性真核生物，如单细胞致病生物或多细胞寄生虫(的感染)。本发明特 别可用于免疫接种个体以抵御能感染细胞和无衣壳的那些病原体，例如病毒和 原核微生物，例如淋球菌、李斯特菌属和志贺菌属那些原核病原体。此外，本 发明还可用于免疫接种个体以抵御原生动物病原体，这类病原体在其生活周期 中的某一阶段为胞内病原体。表1提供了可用于制备本发明疫苗的一些病毒家. 族和种属的名单。疫苗中可采用含有编码各肽的DNA序列的DNA构建物， 所述肽含有至少一个与例如表中所列那些病原体抗原所展示表位相同的或基本上相似的表位。此外，本发明还可用于免疫接种个体以抵御其他病原体，包 括原核病原体和真核原生动物病原体以及多细胞寄生虫，如表2所列。
为制备基因疫苗以提供保护力免遭病原体感染，必须在基因构建物中包括 编码免疫原性蛋白质的基因物质，例如靶蛋白的编码序列，以引发对其的保护 性免疫应答反应。不论病原体是胞内感染(本发明尤其适用)或胞外感染病原体，
不是所有的病原体抗原能都引发保护性应答反应。因为DNA和RNA均较小， 而制备比较容易，本发明还提供了采用多种病原体抗原进行疫苗接种的额外优 点。用于基因疫苗的基因构建物可包含编码多种病原体抗原的基因物质。例如， 一个构建物中可包含数种病毒基因，从而提供多种靶抗原。
表1和表2包括一些致病因子和生物的名单，可以制备它们的基因疫苗以 保护个体免遭其感染。在一些优选的实施方式中，免疫接种个体抵御病原体的 方法针对HIV、 HTLV或HBV。
本发明另一方面，提供了赋予抵御过度增殖性疾病特征性的过度增殖性细 胞的保护性免疫应答反应的方法，以及治疗患过度增殖性疾病个体的方法。过 度增殖性疾病的例子包括所有形式的癌症和银屑病。
业已发现，将包含编码免疫原性"过度增殖细胞"相关蛋白的核苷酸序列 的基因构建物引入个体细胞中能导致在个体的疫苗接种细胞内产生这些蛋白 质。为了免疫接种以抵御过度增殖性疾病，可给予个体包含编码过度增殖性疾 病相关蛋白的核苷酸序列的基因构建物。
为使过度增殖相关蛋白成为有效的靶免疫原，其必须是只产生在过度增殖 细胞内，或在过度增殖细胞内产生的水平高于正常细胞。靶抗原包括这样的蛋 白质、其片段和肽，它们包含在上述蛋白中发现的至少一个表位。在一些情况
中，过度增殖相关蛋白质是编码某蛋白的基团发生突变的产物。突变基因编码 的蛋白质与正常蛋白几乎相同，除了其氨基酸序列略有不同因而产生了正常蛋 白质上没有的不同表位。这类靶蛋白包括由例如輝6、 ，c、 Am等原癌基因和 转座基因kr/fl6/、 ras、 wc、 P53、 "ew、 和EGRF编码的那些蛋白质。除了 作为靶抗原的原癌基因产物外，用于抗癌治疗和保护性方案的耙蛋白还包括B 细胞淋巴瘤所产生抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体可变区，在一些 实施方案中，它们也可用作自身免疫疾病的靶抗原。还可采用其它肿瘤相关蛋白作为靶蛋白，例如发现的肿瘤细胞内含量较高的蛋白质，包括单克隆抗体 17-IA所识别的蛋白质和叶酸结合蛋白质或PSA。
虽然可采用本发明来免疫接种个体以抵御几种癌症形式中的一种或多种， 但本发明尤其适用于预防性免疫接种易患某种特定癌症或曾患癌症因而易复
发的个体。遗传学和技术以及流行病学的发展已能测定和评估个体发生癌症的 几率和风险。可利用基因筛检和/或家族健康史来预测某特定个体患几种癌症中
任何一种的可能性。
类似地，那些曾患癌症和已接受治疗切除癌瘤或处于缓解中的个体尤其易 复发。作为治疗方案的一部分，可以针对己诊断(明确)的癌症给予这种个体 免疫接种以抵御复发。因此， 一旦得知某个体曾患有某类癌症并有复发危险时， 可免疫接种他们，使其免疫系统作好准备以抵御任何将出现的癌症。
本发明提供治疗患过度增殖性疾病个体的方法。在这些方法中，引入的基 因构建物用作免疫治疗剂，以指导和促进个体的免疫系统抵御产生耙蛋白的过 度增殖细胞。
本发明提供了治疗自身免疫疾病和病症个体患者的方法，该方法可赋 予对抗自身免疫相关靶抗原，包括细胞受体和能产生针对"自身抗原"的 抗体细胞的广泛保护性基础免疫应答反应。
T细胞介导的自身免疫疾病包括类风湿关节炎(RA)、多发性硬化症 (MS)、斯耶格伦综合征(Sjogren syndrome)、肉样瘤病、胰岛素依赖性糖尿 病(IDDM)、自身免疫甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、 多肌炎、皮肌炎、银屑病、脉管炎、韦格纳氏肉芽肿病、克罗恩病和溃疡 性结肠炎。上述各种疾病的特征是T细胞受体结合内源性抗原，进而引发 自身免疫疾病相关的炎性级联反应。针对T细胞(受体)可变区的疫苗接 种将引发包括CTL在内的免疫应答而消除那些T细胞。
在RA中，已特征鉴定到参与该疾病的T细胞受体(TCR)的几个特异性 可变区。这些TCR包括V(3-3、 V(3-14、 20 V(3-17和Va-17。因此，可用编 码这些蛋白质中至少一种的DNA构建物作为疫苗接种，以引发耙向参与 RA的T细胞的免疫应答。参见Howell, M. D.等，1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10921-10925; Paliard， X.等，1991 Science 253, 325-329; Williams. W.C.等，1992. J. Clin. Invest. 90:326-333;以上各篇文献通过引用纳入本文。
在多发性硬化症(MS)中，已特征鉴定到参与该疾病的TCR的几个 特异性可变区。这些TCR包括Vfp和Va-lO。因此可用编码这些蛋白中至 少一种的DNA构建物作为疫苗接种，以引发靶向参与MS的T细胞的免疫 应答。参见:Wucherpfennig,K.W.,等，1990 Science248:1016-1019; Oksenberg， J.R等，1990 Nature 345:344-346;以上各篇文献通过引用纳入本文。
在硬皮病中，已特征鉴定到参与该疾病的TCR的几个特异性可变区。 这些TCR包括V(3-6、 V卩-8、 V(3-14和Va-16、 Va-3C、 Va-7、 Va-14、 Va-15、 Va-16、 Va-28和Va-12。因此，可用编码这些蛋白中至少一种的 DNA构建物作为疫苗接种，以引发靶向参与硬皮病的T细胞的免疫应答。
为治疗T细胞介导的自身免疫疾病患者，尤其是TCR可变区尚未特征 鉴定的患者，可以进行滑膜活检。可提取含T细胞的样品，用标准技术鉴 定那些TCR的可变区。利用这些信息制备基因疫苗。
B细胞介导的自身免疫疾病包括狼疮(SLE)、格雷夫斯病、重症肌无力、 自身免疫溶血性贫血、自身免疫血小板减少症、哮喘、冷球蛋白血症、原 发性胆管纤维硬化(primary biliary sclerosis)和恶性贫血。这些疾病各自的特 征是抗体结合内源性抗原，进而引发自身免疫疾病相关的炎性级联反应。 针对抗体的这种可变区的疫苗接种，可引发包括CTL在内的免疫应答以消 除产生这种抗体的B细胞。
为治疗B细胞介导的自身免疫疾病患者，必须鉴定参与自身免疫活动 的抗体的可变区。可进行活检，提取炎症部位存在的抗体样品。用标准技 术鉴定那些抗体的可变区。利用该信息制备基因疫苗。
在SLE病例中，认为一种抗原是DNA。因此，可以筛检待免疫接种以 抵御SLE的患者血清中的抗DAN抗体，制备包含编码在其血清中发现的 抗DNA抗体可变区的DNA构建物的疫苗。
TCR和抗体可变区的共同结构特征是熟知的。通常可用以下熟知的方 法发现编码特定TCR或抗体的DNA序列，例如Kabat等(1987，"免疫学 感兴趣蛋白质的序列"，"美国卫生与人类服务部"(U.S. Department of Health and Human Services),贝塞斯达市(Bethesda)，马里兰州)所述的方法，该篇文献通过引用纳入本文。此外，克隆抗体的功能性可变区的通用方法
可参见引用纳入本文的Chaudhary, V.K.等，1990， Proc. Natl. Acad, Sci. USA 87:1066。 表l
小RNA病毒科
属 鼻病毒属(医学)引起50%普通感冒病例。
肠病毒(Etheroviruses):(医学)包括脊髓灰质炎病毒、柯 萨奇病毒、艾柯病毒、人肠道病毒如甲肝病毒。 口疮病毒(Apthoviruses):(兽医学)这些是口蹄疫病毒。 革巴抗原VP1， VP2， VP3， VP4， VPG
杯状病毒科
属 诺瓦克群病毒属(医学)这些病毒是流行性胃肠炎的重
要病原体。
披膜病毒科
属 Ct病毒属(医学和兽医学)例子包括Senilis病毒、罗斯
河病毒(RossRiver virus)和东方和西方马脑炎病毒。 呼肠孤病毒属(医学)风疹病毒。
黄病毒科
例子包括(医学)登革热病毒、黄热病毒、日本脑炎病 毒、圣路易斯脑炎病毒和虱传脑炎病毒。
西尼罗病毒(GenbankNC001563、 AF533540、 AF404757 、 AF404756 、 AF404755 、 AF404754 、 AF404753 、 AF481864、 M12294、 AF317203、 AF196835、 AF260969、 AF260968、 AF260967、 AF206518和AF202541)
代表性靶抗原E
NS5 C丙肝病毒(医学)这些病毒不属于任何科，但据信是披膜病毒或黄病毒。大 部分类似于披膜病毒科。
冠状病毒科(医学和兽医学)
传染性支气管炎病毒(禽类)
猪可传播性胃肠炎病毒(猪)
猪凝血性脑脊髓炎病毒(猪)
猫传染性腹膜炎病毒(猫)
猫小肠冠状病毒(猫)
狗冠状病毒(狗)
SARS相关冠状病毒
人呼吸道冠状病毒引起约40例普通感冒。 EX.224E, 0C43。
注意一冠状病毒可引起非甲、非乙和非丙型肝炎。
靶抗原
E1-也称为M蛋白或基质蛋白 E2-也称为S蛋白或刺突蛋白
E3-也称为HE或血凝素-elterose糖蛋白(并不存在于所有
冠状病毒中)
N-核衣壳
弹状病毒科
靶抗原
tK疱病毒(Vesiliovirus)
狂犬病病毒(医学和兽医学)狂犬病
G蛋白
N蛋白
线状病毒科(医学)
出血热病毒，例如马堡病毒和埃博拉病毒
虽'j禾占病毒禾斗属 副粘病毒属(医学和兽医学)
腮腺炎病毒，新城疫病毒(重要的鸡致病原) 麻疹病毒属(医学和兽医学) 麻疹病毒、狗瘟热 肺病毒(医学或兽医学) 呼吸道合胞病毒
正粘液病毒科(医学)
流感病毒
布尼亚病毒禾斗(B ungavirus)
属 布尼亚病毒属(医学)加利福尼亚脑炎，LA Crosse
白蛉热病毒属(医学)里夫特山谷热病 汉坦病毒属Puremala是 一 禾中hemahagin热病毒 内罗毕病毒属(兽医学)内罗毕绵羊病 还有许多未分类的布尼亚病毒属
沙粒病毒科(医学)
LCM，拉沙热病毒
呼肠孤病毒科
属 呼肠孤病毒属可能是一种人病原体
轮状病毒儿童急性胃肠道炎 环状病毒属(医学和兽医学)
科罗拉多虱传热病毒、Lebombo(人)马脑炎病毒、蓝舌
病毒
逆转录病毒科
亚科
致癌病毒亚科(Oncorivirinal):(兽医学)(医学)猫白血病 病毒、HTLVI和HTLVII
20慢病毒亚科(医学和兽医学)mv，猫免疫缺陷病毒、马
传染性贫血病毒 泡沫病毒亚科
孚L多空病毒科
亚科 亚科
多瘤病毒亚科(医学)BKU和JCU病毒
乳头瘤病毒亚科(医学)与癌症或乳头瘤的恶性进展有 关的许多种病毒
腺病毒(医学)
EXAD7， ARD.， O.B.-引起呼吸道疾病-一些腺病毒，例 如275，引起肠炎
细小病毒科(兽医学)
猫细小病毒引起猫肠炎
狗细小病毒 猪细小病毒
疱疹病毒科 亚科
a疱疹病毒亚科
单纯疱疹病毒属(医学)
HSVI(GenbankX14112、 NC001806)， HSVII(NC001798)
水痘病毒属(医学和兽医学)假狂犬病-水痘-带状疱疹病
亚科-
卩疱疹病毒亚科 巨细胞病毒属(医学)
HCMV
鼠巨细胞病毒(Muromegalovirus)亚科: 属
Y疱疹病毒亚科 淋巴隐病毒属(医学)
EBV-(伯基特淋巴瘤(Burkitts lympho))
细长病毒属
痘病毒科
亚科:
属
带状痘病毒亚科(医学-兽医学)
天花病毒属(天花病毒)
牛痘属(牛痘病毒) 副痘病毒属-兽医学
禽痘病毒(Auipoxvirus)-兽医学
山羊痘病毒属
兔痘病毒属
猪痘病毒属
肝DNA病毒科
乙型肝炎病毒 未分类的 S肝炎病毒
表2
细菌病原体
病原性革兰阳性球菌包括肺炎球菌；葡萄球菌；和链球菌。病原性 革兰阴性球菌包括脑膜炎球菌和淋球菌。
病原性革兰阴性肠道杆菌包括肠杆菌、假单胞菌、不动细菌和艾肯 菌、类鼻疽、沙门菌、志贺菌、嗜血杆菌、软性下疳、布鲁菌、土拉菌、 耶尔森(巴斯德)菌、念珠状链杆菌和螺菌、单核细胞增生李斯特菌、猪红斑 丹毒丝菌、白喉杆菌、霍乱杆菌、炭疽杆菌、杜诺万菌(性病性肉芽肿)和巴 尔通氏体。
亚科:病原性厌氧菌包括破伤风杆菌；肉毒菌和其它羧菌；结核杆菌；麻 风杆菌和其它分枝杆菌。病原性螺旋体病包括梅毒；密螺旋体病；热带 肉芽肿；品它病和地方流行性梅毒；和钩端螺旋体病。
由较高级病原菌和病原性真菌引起的其它感染包括放线菌病；诺卡 菌病；隐球菌病，酵母病，组织胞浆菌病和球孢子菌病；念珠菌病，曲霉 病，和毛霉菌病；孢子丝菌病，巴西芽生菌病，霉样真菌病(petriemdosis)， 球拟酵母菌病，足分枝菌病和着色芽生菌病；和皮肤真菌病。
立克次体感染包括立克次体的(感染)和立克次体病。
支原体和衣原体感染的病例包括支原体肺炎；性病性淋巴肉芽肿； 鹦鹉热；和产期衣原体感染。
病原性真核细胞
由病原性原虫和蠕虫引起的感染包括阿米巴病；疟疾；利什曼病； 锥虫病；弓形体病；卡氏肺囊虫病；巴贝虫病；贾第鞭毛虫病；旋毛虫病; 丝虫病；血吸虫病；线虫病；吸虫病；和绦虫感染。
权利要求
1. 一种包含编码IL-15功能片段的SEQ ID NO1或其片段的核酸分子。
2. 如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，该分子包含SEQIDNO:l。
3. 如权利要求1或2所述的核酸分子，其特征在于，该分子不含IL-15 信号序列的编码序列。
4. 如权利要求1-3所述的核酸分子，其特征在于，该分子不含IL-15的 Kozak区和/或IL-15的5，非翻译区和/或IL-15的3'非翻译区。
5. 如权利要求l-4所述的核酸分子，其特征在于，该分子包含非-IL-15信 号序列的编码序列。
6. 如权利要求l-5所述的核酸分子，其特征在于，该分子包含IgE信号序 列的编码序列。
7. 如权利要求l-6所述的核酸分子，其特征在于，该分子还包含免疫原的 编码序列。
8. 如权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述免疫原是病原体抗 原、癌症相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞相连的抗原。
9. 如权利要求8所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述免疫原是选 自HIV、 HSV、 HCV和WNV构成之组的病原体的病原体抗原。
10. 如权利要求l-9所述的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子 是质粒。
11. 如权利要求l-9所述的核酸分子，其特征在于，所述分子掺入在病毒 载体中。
12. 如权利要求l-9所述的核酸分子，其特征在于，所述分子掺入在减毒 活病原体中。
13. —种包含权利要求1-12所述核酸分子和含有免疫原编码核酸序列的 核酸分子的组合物。
14. 如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述免疫原是病原体抗 原、癌症相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞相连的抗原。
15. 如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述免疫原是选自HIV、HSV、 HCV和WNV构成之组的病原体的病原体抗原。
16. 如权利要求13-15所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是质粒。
17. —种可注射的药物组合物，其包含权利要求l-12所述的核酸分子或权 利要求13-15所述的组合物。
18. —种调节个体的免疫应答反应的方法，该方法包括给予所述个体权利 要求l-6所述的核酸分子。
19. 一种重组疫苗，其包含编码免疫原的核酸序列和权利要求l-6所述的 核酸序列。
20. 如权利要求19所述的重组疫苗，其特征在于，所述免疫原是病原体 抗原、癌症相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞相连的抗原。
21. 如权利要求20所述的重组疫苗，其特征在于，所述免疫原是选自HIV、 HSV、 HCV和WNV构成之组的病原体的病原体抗原。
22. 如权利要求19-21所述的重组疫苗，其特征在于，所述重组疫苗是重 组牛痘疫苗。
23. —种诱导个体抵御免疫原的免疫应答反应的方法，该方法包括给予所 述个体权利要求7-12所述的核酸分子或权利要求13-16所述的组合物或权利要 求19-22所述的重组疫苗。
全文摘要
本发明揭示了编码IL-15或其片段的核酸分子，此核酸分子表达的蛋白质水平高于含天然IL-15编码序列的核酸分子。还揭示了含有其它修饰，例如缺乏IL-15信号序列的编码序列和/或缺乏IL-15非翻译序列和/或包含非-IL-15信号序列的核酸分子。揭示了包含这种核酸分子的载体，包括质粒和病毒载体，以及单用这种核酸分子或与编码免疫原的核酸序列联用的方法，所述序列是所述核酸分子的一部分和/或不同核酸分子的一部分。揭示了编码融合蛋白的重组疫苗和减毒活病原体以及它们的使用方法。
文档编号C12Q1/68GK101432300SQ200780005940
公开日2009年5月13日 申请日期2007年1月12日 优先权日2006年1月13日
发明者D·B·韦纳, M·库兹勒 申请人:宾夕法尼亚州立大学托管会